卫生微生物实验

1、 授课对象：12级预防医学专业 授课地点：8号楼-511 主讲教师：曹亦菲 实验教学安排实验教学安排一、水的卫生细菌学检测一、水的卫生细菌学检测（一）细菌总数的检测（一）细菌总数的检测（二）大肠菌群数的检测（二）大肠菌群数的检测二、奶粉中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的检测二、奶粉中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的检测（一）金黄色葡萄球菌检测（一）金黄色葡萄球菌检测（二）沙门氏菌检测（二）沙门氏菌检测三、自然沉降法检测空气中溶血性链球菌三、自然沉降法检测空气中溶血性链球菌四、消毒效果的实验室评价四、消毒效果的实验室评价实验教学内容实验教学内容细菌培养基制作（4人/大组）分组配制分组配制第一大组配制：营养琼

2、脂培养基第二大组配制：SS琼脂培养基第三大组配制：乳糖胆盐发酵管培养基伊红美兰培养基1 营养琼脂培养基: 配方：按试剂瓶（营养琼脂培养基）说明配制操作：配制200 ml4瓶 直接高压灭菌12115 min 备用2 SS琼脂培养基琼脂培养基 配方：按试剂瓶（SS琼脂培养基）说明配制。操作：配制300 ml1瓶。煮沸溶化（不用高压灭菌） 倒15块左右大平板，约20 ml/块 备用。3 伊红美兰琼脂培养基（伊红美兰琼脂培养基（EMB平板）平板） 配方：按试剂瓶（伊红美兰琼脂培养基）说明配制。 操作：配制300 ml 1瓶。 直接高压灭菌108 15 min 共倒20块左右大平板 备用。 4 乳糖胆盐

3、发酵管培养基乳糖胆盐发酵管培养基 配方：按试剂瓶（乳糖胆盐发酵管培养基）说明配制。 操作：600 ml 搪瓷量水杯 煮沸溶化 用10 ml量筒分装60支左右试管，10 ml/支 高压灭菌108 15 min 备用。 调调 配配（计算、称量）： 按照培养基配方计算并正确称取各种原料放于烧杯中。另用量筒量取所需蒸馏水量。 溶溶 化化： 将营养基各成分和蒸馏水倒入烧杯中，在电炉中加热融化，边加热边用玻棒搅拌，沸腾时立即从电炉上拿下，等泡沫消失后再放置电炉上加热，注意不要让琼脂逸出，煮沸2-3次。 将烧瓶口用橡胶盖盖好，外再用防水纸包好，最后用绳系紧，平放在高压蒸汽灭菌器的内筒中，高压蒸汽灭菌。液体培

4、养基液体培养基分装量约为试管高度的1/4，加塞后灭菌直立。平板培养基：平板培养基：先将灭菌琼脂融化后冷却至50左右，以无菌操作倾 注于灭菌平皿内，每板约15ml（小平板）、20ml（大平板）,刚好覆盖平皿底为宜，水平旋转平皿。待琼脂凝固后将平皿翻转，置4保存备用。 加水加水 装锅装锅 加盖加盖 排气排气 灭菌灭菌 起锅起锅一、水的卫生细菌学检测（一、水的卫生细菌学检测（2人人/组）组） （一）水的细菌总数测定（2人/组）1 原理采用营养琼脂倾注平板计数法，测定被检物在单位重量或体积（g或ml）内所含有的活细菌数量，以判明被检物（水）被细菌污染的程度。2 材料 检材：水源水（实验室提供）。 无菌

5、生理水。 制备9 ml无菌生理盐水3支/组排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3。 营养琼脂培养基已灭菌备用。 无菌平皿6个/组。每个稀释度做2个平行样，依次标明10-1、10-2、10-3。3、方法与步骤水样的采集500 ml灭菌玻璃瓶饮用水采集水源水采集采集自来水时，放水5-10 min，排除管内贮存水江河、湖、水库等水样，采集距水面10-15 cm深处水用1 ml无菌吸管吸取水源水原样1ml 换1 ml无菌吸管混匀后（来回吸3次）吸出1 ml换1 ml无菌吸管混匀后（来回吸3次）吸出1 ml释释度 1: 10(10-1) 1: 10(10-2) 1: 10(10-3)9 m

6、l 生理盐水9 ml 生理盐水9 ml 生理盐水注：吸管不要碰到水面换1ml无菌吸管分别吸取10-3、10-2、10-1的样品各1 ml于无菌平皿，每个稀释度做两个平行样。（注意：低浓度 高浓度加样倾注平板法：将冷却至45的培养基倾注于平皿（手触底部不感到烫，2/3平皿量）。混匀（一人倒一人混，前后左右圆混匀）。37 X24 h培养（凝固后培养，平皿倒置）菌落计数菌落计数 1、平皿分、平皿分4部分点数（见图）部分点数（见图） 2、求同一、求同一稀释度的平均菌落数稀释度的平均菌落数 如：如： A1数数 + A2数数 2 4、结果、结果 1）平板菌落数的选择）平板菌落数的选择 2）稀释度的选择）稀

7、释度的选择 3）菌落数的报告）菌落数的报告 菌落数菌落数100 按实有数报告按实有数报告 菌落数菌落数100 采用两位有效数，后面数值采用两位有效数，后面数值 四舍四舍五入（也可用五入（也可用10的指数表示）的指数表示） 无法计数无法计数 无法计数报告无法计数报告 （ 注明水样的稀释倍数）注明水样的稀释倍数） 5. 菌落计数的报告：菌落计数的报告：稀释度选择及细菌总数报告方法稀释度选择及细菌总数报告方法 1 1,365 164 20 16，400 16，000或或1.6104 2 2,760 295 46 1.6 37，750 38，000或或3.8 104 3 2,890 271 60 2.

8、2 27，100 27，000或或2.7104 4 不可计不可计 4，650 513 513，000 510，000或或5.1 105 5 27 11 5 270 270或或2.7 102 6 不可计不可计 305 12 30，500 31，000或或3.1 1047 不可计不可计 不可计不可计 不可计不可计 10-3无法计数无法计数 稀释稀释 倍数倍数 平均平均 菌菌落落 数数例例 次次两稀释度两稀释度 菌落数之比菌落数之比细菌总数细菌总数(个个/g或个或个/ml) 报告方式报告方式(个个/g或个或个/ml)10-110-210-3 稀释液及菌落数稀释液及菌落数 稀释稀释 倍数倍数 平均平均

9、 菌菌落落 数数例例 次次两稀释度两稀释度 菌落数之比菌落数之比细菌总数细菌总数(个个/g或个或个/ml) 报告方式报告方式(个个/g或个或个/ml)10-110-210-311,365164201）应选择平均菌落数在30-300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之16,4001.6 104 稀释稀释 倍数倍数 平均平均 菌菌落落 数数例例 次次两稀释度两稀释度 菌落数之比菌落数之比细菌总数细菌总数(个个/g或个或个/ml) 报告方式报告方式(个个/g或个或个/ml)10-110-210-32,760295462) 若两个稀释度的菌落数确立在30-300，则应视二者之比来决定，若比值小于2，应报告

10、平均数。若比值大于2则报告其中较小的数字37,7503.8 104231.62,890271602.227,1002.7 104 稀释稀释 倍数倍数 平均平均 菌菌落落 数数例例 次次两稀释度两稀释度 菌落数之比菌落数之比细菌总数细菌总数(个个/g或个或个/ml) 报告方式报告方式(个个/g或个或个/ml)10-110-210-34不可计 4,650513513,0005.1 1043) 若所有平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之 稀释稀释 倍数倍数 平均平均 菌菌落落 数数例例 次次两稀释度两稀释度 菌落数之比菌落数之比细菌总数细菌总数(个个/g或个或个/m

11、l) 报告方式报告方式(个个/g或个或个/ml)10-110-210-35271152702.7 1024) 若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以倍数报告之 稀释稀释 倍数倍数 平均平均 菌菌落落 数数例例 次次两稀释度两稀释度 菌落数之比菌落数之比细菌总数细菌总数(个个/g或个或个/ml) 报告方式报告方式(个个/g或个或个/ml)10-110-210-36不可计3051230,5003.1 1045) 如果所有稀释度的菌落数均不在30300之间，其中一部分大于300，一部分小于30，则应以最接近30或300的平均菌落数计算。 稀释稀释 倍数倍数 平均平均 菌

12、菌落落 数数例例 次次两稀释度两稀释度 菌落数之比菌落数之比细菌总数细菌总数(个个/g或个或个/ml) 报告方式报告方式(个个/g或个或个/ml)10-110-210-37不可计 不可计不可计10-3无法计数6) 若所有稀释度的菌落数均不可计数，则以最高稀释倍数无法计数报告之（二）水的大肠菌群数的检测（2人/组） 1 原理 大肠杆菌是人和动物 肠道中主要细菌，由于它在肠道中数量较多，在肠道外抵抗力较强，容易检出，故大肠杆菌常作为粪便污染指标，也间接表明有肠道致病菌的污染。2 材料 检材：水源水（实验室提供） 10ml 无菌吸管1支/组，1 ml无菌吸管1支/组。 乳糖胆盐发酵管：初发酵9支/组

13、，做好标记（实验室提供），复发酵9支/组（自己制备） 伊红美兰琼脂培养基（EMB平板）一块/组。 其他：显微镜、酒精灯、接种环、载玻片、G染色液等3 方法与步骤 大肠菌群的检验程序 采样 稀释初发酵：乳糖胆盐发酵管，37 18-24h不产酸、产气产酸、产气结论：大肠菌群阴性EMB平板， 37 18-24h革兰氏染色复发酵：乳糖胆盐发酵管， 37 18-24hG+G-无芽孢杆菌产酸、产气不产酸、产气结论：大肠菌群阴性结论：大肠菌群阳性结论：大肠菌群阴性操作步骤 初发酵试验用1 ml无菌吸管吸取10-2样品1 ml 3用1 ml无菌吸管吸取10-1样品1 ml 3用1 ml无菌吸管吸取原样1 ml

14、 310 ml乳糖胆盐发酵管10 ml乳糖胆盐发酵管10 ml乳糖胆盐发酵管37 18-24h培养333 在指示性培养基（EMB平板）上分离培养产酸产气的发酵管平板划线接种法EMB平板（9等分）37 18-24h培养213456789EMB平板：伊红、美兰平板 原理：大肠杆菌因分解乳糖产酸使PH降低，致使伊红与美兰结合成紫红色化合物，故菌落呈紫黑色且有金属光泽。但在碱性环境中，伊红与美兰不能结合，故不分解乳糖的致病性肠道杆菌的菌落为无色、半透明。 紫黑色带金属光泽大菌落 大肠杆菌菌落 无色半透明小菌落 肠道致病菌菌落 革兰染色镜检，复发酵试验EMB平板上挑取1-2个大肠菌群可疑菌落（紫黑色有金

15、属光泽）革兰染色镜检乳糖胆盐发酵管（9支，复发酵）37 18-24h培养 3片4 结果 初发酵乳糖胆盐发酵管：产酸、产气 EMB平板：紫黑色、金属光泽菌落 G染色：G-无芽孢杆菌， 复发酵乳糖胆盐发酵管：产酸、产气大肠菌群阳性大肠菌群阳性以上有一项不符的大肠菌群阴性大肠菌群阴性 大肠菌群数的报告： 根据有大肠杆菌细菌存在的初发酵管的管数，查相应的大肠杆菌检索表，报告每1000 ml待检样品中大肠菌群的最近似数。 阳性管数阳性管数MPN 阴性阴性管数管数MPN1ml 30.1ml 30.01ml 3个/L1ml 30.1ml 30.01ml 3个/L00030200900013020114000

16、26020220000390203260010302101500116021120001290212270013120213340大肠菌群最可能数（MPN)检索表注意事项 划线时平皿盖半开45角，接种环与平皿约成30-40角，轻轻接触，以腕力在琼脂表面轻快滑动，不能划破琼脂。 第一次划线应占平皿面积的1/10，为第一组线。转动培养皿60 左右，将接种环通过第一组线再划第二组线，同法进行第三组、第四组画线接种。4区不要接上1区。 每一组线划完后接种环均应灭菌。附： （1）细菌涂片制作 涂片（均匀） 干燥 固定生理盐水+细菌（2）G染色过程 初染（结晶紫）1分钟 水洗 媒染（碘液） 1分钟 水洗

17、脱色（95%酒精）0.5分钟 水洗 复染（稀释复红） 0.5分钟 水洗分分半半紫碘酒红用吸水纸将片子上的水吸干显微镜油镜镜检结果蓝紫色（G+ ）蓝紫色（G- ）紫阳红阴紫阳红阴革兰染色结果紫色G+菌红色G-菌二、奶粉中金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的检测 （一）金黄色葡萄球菌产生的肠毒素可致以呕吐为症状的急性胃肠炎（食物中毒），故食品中不应检出金黄色葡萄球菌。2 材料 检材：奶粉增菌液（实验室提供） 血平板 血浆凝固酶试验材料：兔血浆、生理盐水、玻片等 G染色材料：G染色液等 其他：显微镜、酒精灯、接种环、玻片等3 方法与步骤奶粉液体培养基增菌平板划线分离接种法血平板37 18-24h培养挑取可疑菌

18、落（圆形凸起，有透明溶血环）菌落观察G染色血浆凝固酶试验附：平板分区划线接种法混合菌1234 接种方法接种方法 培养结果培养结果 接种环接种环4. 结果 菌落观察：圆形凸起的大菌落、 金黄色色素、有溶血环 G染色：G+葡萄串状排列 血浆凝固酶试验：+金黄色葡萄金黄色葡萄球菌阳性球菌阳性血浆凝固酶试验（玻片法）兔血浆+金葡菌金葡菌凝集生理盐水+金葡菌金葡菌不凝集（二）沙门氏菌检测（2人/组） 1 原理 沙门菌为肠道致病菌，通过消化道感染可致伤寒病、胃肠炎（食物中毒），故食品中不应检出沙门菌。2 材料 检材：奶粉的增菌液（实验室提供） SS平板 7种生化管：葡、乳、H2S、尿素、半固体、双糖铁、蛋

19、白胨水等 血清学鉴定材料：玻片、生理盐水、伤寒诊断血清等 3 方法与步骤奶粉液体培养基增菌平板划线分离接种法SS平板37 18-24h培养挑取可疑菌落（无色透明小菌落）生化反应血清学鉴定7种生化反应已知Ab检测未知Ag(玻片凝集试验）SS平板:(SS是沙门菌Salmonella、志贺杆菌Shigella名字缩写） 原理：成份中胆盐、煌绿对大肠杆菌有抑制作用，而对肠道致病原菌则无抑制作用。中性红为指示剂，酸性时呈红色，碱性时呈淡黄色。大肠杆菌能分解乳糖产酸，因此菌落呈红色。肠道病原菌不分解乳糖，但利用蛋白胨产生碱性产物，故菌落呈淡黄色。SS平板无色透明小菌落无色透明小菌落不发酵乳糖菌落不发酵乳糖

20、菌落（肠道致病菌菌落）（肠道致病菌菌落）红色大菌落红色大菌落发酵乳糖菌落发酵乳糖菌落( (大肠杆菌菌落）大肠杆菌菌落）4 结果 双糖铁 葡 乳 尿 H2S 靛 动力 血清学未知菌肠道杆菌的生化反应挑取SS平板分离到的可疑菌落分别接种1 双糖铁培养基2 葡萄糖发酵3乳糖发酵4 尿素酶试验5 H2S试验6 靛基质试验（蛋白胨水液体培 养基）7动力试验（半固体培养基） （微量发酵管）葡萄糖发酵乳糖发酵尿素酶试验H2S试验（微量发酵管）穿刺接种法靛基质试验（蛋白胨水液体培养基）液体培养基接种法动力试验（半固体培养基） 穿刺接种法半固体培养基的接种法附：液体培养基的接种法附：附：上/乳糖/固体下/葡萄糖

21、/半固体接种方法：半固体穿刺接种（接种针） 斜面接种（接种环）观察：葡萄糖分解、乳糖分解、H2S试验、动力实验指示剂：酚红，酸性黄色 碱红红色双糖铁培养基葡萄糖+乳糖-H2S-葡萄糖+乳糖-H2S+葡萄糖+乳糖+H2S- 标准管 痢疾杆菌 伤寒杆菌 大肠杆菌 附： 血清学鉴定-（玻片凝集反应）伤寒诊断血清未知菌+？生理盐水未知菌+？五类肠道杆菌的生化反应及动力 大肠杆菌大肠杆菌 - - + + + / 变形杆菌变形杆菌 - + + +/- + - / 乙型副伤乙型副伤寒杆菌寒杆菌 - + - - + -/ 伤寒杆菌伤寒杆菌 + - +/- - - + -/+痢疾杆菌痢疾杆菌 + - - - +

22、/- - -/+葡萄糖葡萄糖 乳糖乳糖 H2S 尿素尿素 靛基质靛基质 动力动力 双糖铁双糖铁糖发酵试验结果观察和记录反应现象反应现象结果描述结果描述变色、有气泡变色、有气泡产酸产气，产酸产气，阳性，以阳性，以“ ”表示表示变色、无气泡变色、无气泡产酸不产气，产酸不产气，阳性，以阳性，以“+”表示表示不变色、无气泡不变色、无气泡阴性，以阴性，以“-”表示表示 某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。 某些细菌能分解含硫的氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸等) 产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐反应，形成黑色

23、的硫化铁沉淀，为硫化氢试验阳性。阴性阴性阳性阳性 阳性阳性 某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚红指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性。阴性阴性阳性阳性三、自然沉降法检测空气中溶血性链三、自然沉降法检测空气中溶血性链球菌（球菌（2人人/组）组） 材料：血平板方法：对照教室5 min室外5 min37 18-24h结果：计数菌落数（cfu/皿），观察菌落数的差异菌落计数方法四、消毒效果实验室评价（四、消毒效果实验室评价（2人人/组组) 材料：普通琼脂平板2块 大肠杆菌、金葡菌 消毒剂：来苏水、新洁尔灭、碘酒、紫药水 方法药敏试验-纸片法新碘来紫新碘来紫大肠杆菌金葡菌37 18-24h结果观察 抑菌圈直径15mm 高度敏感 抑菌圈直径10-15mm 中度敏感 抑菌圈直径10mm 低度敏感 无抑菌圈 不敏感或耐药(直径mm) 来苏水 新洁尔灭 碘酒 紫药水 大肠杆菌金葡菌实验结束注意事项： 1 培养物做好标记。 2 培养物37 18-24h培养。 3 试管播于试管架培养、平