环境工程微生物实验

1、第一章 微生物学实验常识第一节 微生物实验操作常识环境工程微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时，通过实验，培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力以及实事求是、严肃认真的科学态度以及勤俭节约、爱护公物的良好作风。一、实验过程中注意事项1每次实验前必须对实验内容进行充分预习，以了解实验的目的、原理和方法，做到心中有数，思路清楚。2认真及时做好实验记录，对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验，则需记下每次观察的现象和结果，以便分析。3实验室内应保持整洁，勿高声谈话和随便走动，保持室内安静。4实验时细心仔

2、细，全部操作应严格按操作规程进行，万一遇有盛菌液试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时，应立即报告指导教师，及时处理，切勿隐瞒。5实验过程中，切勿使酒精、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险，先关掉火源，再用湿布或砂土掩盖灭火，必要时用灭火器。6使用显微镜或其他贵重仪器时，要求细心操作，特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约，用毕后仍放会原处。7每次实验完毕后，必须把所用仪器抹净放妥，将实验室收拾整齐，擦净桌面，如有菌液污染桌面或其他地方时，可用3%来苏尔液或5%石炭酸液覆盖其上半小时后擦去，如系芽孢杆菌，应适当延长消毒时间。凡带菌之工具（吸管、玻璃刮棒等）在洗涤前须先消毒

3、（浸泡在3%来苏尔液中）。8每次实验须进行培养的材料，应标明自己的组别及处理方法，放于教师指定的地点进行培养。实验室中的菌种和物品等，未经教师许可，不得携出室外。9每次实验的结果，应以实事求是的科学态度填入报告内容中，力求简明准确，及时汇交教师批阅。10离实验室前应将手洗净，注意关闭门窗，灯、火、煤气等。二、接种室在微生物工作中，菌种的接种移植是一项主要操作，这项操作的特点就是要保证菌种纯，防止杂菌的污染。在一般环境的空气中，由于许多尘埃和杂菌，对接种工作干扰很大，很易污染。因此，接种工作要在空气经过灭菌的环境里进行，小规模的可利用接种箱，大规模的则在接种室里操作，也可在超净工作台中操作。（一

4、）接种室内设备和用具接种室内的工作台，不论是什么台面，都要求表面光滑和水平。光滑是便于用消毒药剂擦洗；水平是在倒琼脂平板时可以保证培养皿内平板的厚度一致。在接种室（或超净工作台）安装一个紫光灯。接种室内的紫光灯，可吊在经常工作的座位的正上方。缓冲室内应有专用的工作服、鞋、口罩、盛有来苏儿水的瓷瓶和毛巾、手持喷雾器和5石炭酸溶液等。接种室内有酒精灯、常用接种工具、不锈钢制的刀、剪、镊子、70的酒精棉球、工业酒精、载玻片、记录本、标签纸、废物筐等。（二）接种室的灭菌消毒1熏蒸灭菌：接种室使用时间较长，污染比较严重，应进行熏蒸灭菌。可用甲醛、乳酸或硫磺熏蒸。熏蒸前应将接种室清扫干净，打开通气窗通风干

5、燥。这是接种室彻底灭菌的措施。2石炭酸喷雾：在每次接种前，用5石炭酸喷雾，可促使空气中微粒及杂菌沉降，防止桌面、地面上微尘飞场，并有杀菌作用。3紫外线照射：有条件时在每次接种前，应开启紫外线灯，照射半小时以上（一般不必超过一小时），有较好的杀菌效果。（三）接种室工作程序1每次使用前半小时，接种室和缓冲室内用5石炭酸喷雾。有紫外线灯时可照射半小时。2用肥皂洗手。把所需器材搬入缓冲室。换上经常灭菌的工作服、工作帽和工作鞋（旧的衣帽鞋洗干净后灭菌即可），戴好口罩，然后用2煤酚皂液将手浸洗2min。3将各种需用物品般进接种室，按一定位置放好。检查是否齐备。用5石炭酸重点在工作台面上方和附近地面上喷雾，

6、然后退回隔离室，稍停几分钟，再进接种室工作。4接种操作前用70%酒精棉球擦手，进行无菌操作时，要严格认真，动作要轻缓，尽量减少空气波动，如二人操作，要相互配合好。工作时用完的火柴、废纸等，不要仍在地上，应丢道废物桶内。5工作结束后，立即将台面收拾干净，将不应在接种室存放的物品和废弃物全部拿出接种室，然后用5%石炭酸全面喷射，开紫外线灯照射半小时。6工作中应主要安全。如遇棉塞着火，用手紧握即可熄火，如来不及时，应用湿布扑灭，切勿用嘴吹，以免扩大燃烧；如遇有菌培养物洒落或打碎有菌容器时，应用抹布沾5石炭酸收拾到废物桶内并擦拭台面或地面，用酒精棉球擦手后再继续操作。（四）接种室空气污染情况的检验接种

7、室应定期进行空气污染情况的检验，其目的是了解接种室灭菌效果，另外是了解在操作过程中操作行动对空气的污染影响，以便有的放矢地及时改进灭菌措施和操作方法。1检验方法（1）平板检验法：用培养微生物主要类群的常规培养基，如肉汤琼脂、淀粉琼脂、土豆琼脂，分别倒成平板，每种两个，都放入接种室内。检验时，按无菌操作各将其中一个平板的盖子打开，经过预定时间后再行盖好，另外一个不开盖子的作为对照，一起放入30环境培养，48h后检验有无菌落生长。（2）斜面培养法将常用的琼脂斜面（与上相同）各取2管，放入接种室。按无菌操作各将其中的一管打开棉塞，将棉塞放入灭菌的培养皿内。经过预定时间后，再将棉塞通过火焰塞好试管。连

8、同对照一起培养，48h后检验有无杂菌生长。2检验方法（1）空气灭菌后的检验：接种室用甲醛或其它药剂熏蒸后，在开始使用前半小时或一小时打开培养皿盖子，至使用接种室时盖好。其目的是为了检验接种室内空气灭菌的效果。（2）操作过程中空气污染情况的检验：为了检验在使用接种室的过程中，由于人员的进出、器材的搬放、接种操作的动作等原因造成的空气污染的情况，可在淮备工作结束后接种操作开始时打开盖子，经5分钟、30分钟或直到工作结束时再盖好，以检验在不同的使用时间内空气污染的程度。（3）紫外线灭菌效果的检验：接种室用紫外线灯照射后，可在不同高度和不同位置用琼脂平板检验空气中的杂菌，以判断紫外线的灭菌效果。必要时

9、应调整照射时间或紫外线灯的高度。3检验结果分析：检验用的平板或斜面，在30培养48h后，检验是否长有菌落、菌落数量、并由菌落形态判断杂菌的种类。一般要求平板开盖5分钟者应不超过3个菌落；斜面开塞30分钟者应不长菌落为合格。从空气中杂菌的种类可以考虑采取有效措施，增进灭菌效果。如霉菌较多，可先用5石炭酸灭菌后，再用甲醛熏蒸；如细菌较多时，可采用乳酸与甲醛交替熏蒸的办法。第二节 实验室常用显微镜自从17世纪荷兰人列文虎克发明了显微镜后，人类才第一次看见了细菌。本世纪30年代，电子显微镜的问世，人类才真正地揭示了微观世界的奥妙，不但看到了细胞的亚显微结构，而且也弄清了超微生物病毒的真正面目。40年代

10、层析技术的分离和电泳技术的出现和兴起，大大地推动了分子生物学的研究，诸如核酸、酶、蛋白质分子的分离、分析和分子的结构的测定。近几十年来，红外光谱、紫外光谱和质谱、核磁共振波谱等技术的应用和发展，弄清了许多有机分子的结构。随着激光、超导等技术的不断涌现，将把微生物学实验技术推向一个崭新的水平。一、显微镜人眼观察物体的能力是有限的。一般情况下，在25cm的明视距离内，人眼只能分辨相距0.10.2mm的两个物体。也就是说，当两个物体相距不到0.1mm时，人眼也就把它们看成是一个物体了。这个极限称为人眼的分辨力。由此可知，人眼对小到一定距离的物体，如普通的细菌，就只能是“视而不见”。自从显微镜发明后，

11、变产生了微生物学，它大大地推动了生物科学的发展，使人类从宏观世界走向微观世界。（一）光学显微镜1、普通光学显微镜普通光学显微镜由机械部分和光学系统两大部分所组成。机构部分包括：镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台等；光学部分包括：目镜、物镜、聚光器、反光镜和光源等。普通光学显微镜的特点：结构简单、操作方便、成像清晰、价格低廉、种类繁多、用途十分广泛。2、暗视野显微镜若将普通光学显微镜的聚光器换成暗视野聚光器，就可变为一架暗视野显微镜。从暗视野显微镜目镜中观察，视野全是黑暗的，只有被检物体（细菌）才是明亮的。由于所见到的菌体仅仅是个轮廓，而看不清其内部结构，故只能在观察菌体时使用。3、荧光显微镜

12、荧光显微镜与暗视野显微镜的结构是相同的，只是把普通光源换成一个激发荧光的紫外光源，紫外光光源通常采用高压汞灯。荧光显微镜主要用于科研、教学、医药和微生物等研究工作中。4、相差显微镜如果要观察透明的活体微生物，由于光线透过它时光的波长和振幅不发生变化，所以整个视野的亮度是均匀的，因而一般的显微镜不能分辨出微生物细胞的细微结构。若采用相差显微镜即可弥补上述不足。相差显微镜的结构除了与普通显微镜一样外，所不同的是在聚光器下方插入了一个环状光栏，另有几个安装相板的相差物镜及合轴调整望远镜三个特殊部分。国内常用的有：XSX-1型与XSX-2型相差显微镜（南京江南光学仪器厂产品）。相差显微镜主要用于科研、

13、教学、医疗等部门作细菌学、病理学的研究观察。5、偏光显微镜在生物体中，某些组织成分由于光学性质不同，可不经染色，利用偏光来加以区别。偏光显微镜就是利用它的特殊装置偏光器、检偏器和补偿器等，使在镜检时产生偏光以鉴别细微结构，同时还可以辨别组织中的化学成分，因此可用于组织化学的研究中。6、紫外光显微镜该镜是以紫外光为光源。由于被检物体内各种组分对紫外光吸收能力不同，因此，在以紫外光显微镜镜检时，可使未染色的标本容易辨别。同时，又因紫外光的波长比可见光要短一半，从而使它的分辨力增加了两倍，所以能看到用染色方法所看不到的结构。该镜对核酸的研究尤为重要。（二）电子显微镜电子显微镜的一切性能都是光学显微镜

14、不能比拟的。光学显微镜的放大倍数只有两千倍，而电子显微镜的放电倍数则为一百多万倍。目前，电子显微镜技术（electron microscopy)已成为研究机体微细结构的重要手段。常用的有透射电镜（transmission electron microscope，TEM）和扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM）。与光镜相比电镜用电子束代替了可见光，用电磁透镜代替了光学透镜并使用荧光屏将肉眼不可见电子束成像。电子显微镜不但放大能力强，而且分辨率高，光学显微镜的分辨率为0.2m，而电子显微镜的分辨率已达到0

15、.3nm。一般原子的间距大约为0.1nm，因此电子显微镜可以观察到原子世界。这个分辨率比光学显微镜提高了3000多倍。电子显微镜主要由电子发射源（又称电子枪）、会聚透镜、接物透镜、投射透镜、记录系统、高压电源与低压电源、真空系统等七大部分组成。1、扫描电镜扫描电镜是用极细的电子束在样品表面扫描，将产生的二次电子用特制的探测器收集，形成电信号运送到显像管，在荧光屏上显示物体。（细胞、组织）表面的立体构像，可摄制成照片。扫描电镜样品用戊二醛和饿酸等固定，经脱水和临界点干燥后,再于样品表面喷镀薄层金膜，以增加二波电子数。扫描电镜能观察较大的组织表面结构，由于它的景深长，1mm左右的凹凸不平面能清所成

16、像，故放样品图像富有立体感。2、透射电镜透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像， 投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。透射电镜的分辨率为0.10.2nm，放大倍数为几万几十万倍。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超薄切片（通常为50100nm）。其制备过程与石蜡切片相似，但要求极严格。要在机体死亡后的数分钟内取材，组织块要小(1立方毫米以内），常用戊二醛和锇酸进行双重固定树脂包埋,用特制的超薄切片机（ultramicrotome）切成超薄切片，再经醋酸铀和柠檬酸铅等进行电子染色。电子束投射到样品时，可随组织构成成分的密度不同而发生相应的电子发射，如

17、电子束投射到质量大的结构时，电子被散射的多，因此投射到荧光屏上的电子少而呈暗像，电子照片上则呈黑色。称电子密度高（electron dense）。反之，则称为电子密度低（electron lucent）。（三）显微摄影要拍一张高质量的微生物照片，必须具备图像清晰、分辨率高的显微镜和优良的摄影机，这两者是最为重要的，然后配合以适当的照明和熟练的操作技巧，就可以拍到一张满意的显微照片。任何一种显微镜都可以用于显微摄影，不属哪一种适用、哪一种不适用的问题，但常用的还是普通的明视野显微镜。如果要拍摄一张高质量的显微照片，最好使用高分辩率的显微镜。第三节 灭菌与灭菌器灭菌是专指用化学

18、或物理的方法杀死和除去全部微生物因此，灭菌后无任何活的微生物。其主要包括一切细菌、芽孢、霉菌、病毒等。在微生物的实验和研究工作中，不论是培养基，还是所使用的一切器具，都必须经过严格的灭菌后，方能进行工作。灭菌的方法很多，常用的有化学法与物理法。物理法中又包括高温灭菌法、辐射灭菌法与过滤除菌法等。这里介绍常用几种灭菌器械：一、高压灭菌器高压灭菌器是一个密闭的、可以耐受压力的金属锅，通以蒸汽，蒸汽不能向外扩散，就使灭菌器内压力不断升高，水的沸点也不断升高，这样就可以获得比100更高的温度。如在每平方厘米为一个大气压（即15磅平方英寸）的压力下，温度可达121，一般只要维持1520分钟就可杀死一切微

19、生物的营养体和它们的各种孢子。高压灭菌器有立式，卧式和手提式等数种类型。二、干热灭菌箱干热灭菌箱就是电热烘箱，灭菌时使电热烘箱保持恒温，所以又称热空气灭菌。这种灭菌器适于各种各样的耐热玻璃器皿（如培养皿、试管、移液管等）和某些其它物品（如石蜡油）的灭菌，一般在160下，持续1小时，就可以达到灭菌的目的。三、细菌过滤器过滤除菌法是将带菌的液体或气体通过一个过滤器，使细菌受到机械阻留而隔留在滤板上，从而达到除菌的目的。第二章 微生物实验技术实验 1 光学显微镜的使用及微生物形态的观察一、实验目的1掌握光学显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作方法和保养2学习并掌握油镜的使用技术3观察细菌的个体形态，

20、学会生物图的绘制4. 观察观察酵母菌、霉菌个体形态二、实验器材显微镜、盖玻片、载玻片、香柏油、细菌示范片、擦镜纸细菌示范片；酵母菌示范片；霉菌示范片等三、显微镜的结构显微镜分机械装置和光学系统两部分。如图1-1所示。图1-1 显微镜的结构1目镜；2目镜筒；3镜臂；4粗调手轮；5微调手轮；6移动尺；7物镜转换器；8物镜；9载物台；10聚光镜；11 可变光栏；12反射镜；13底座（一）显微镜的机械装置1镜筒 镜筒上端装目镜，下端接转换器。镜筒有单筒和双筒两种。本实验采用的是单筒显微镜。镜筒长度一般是160mm。2转换器 转换器装在镜筒的下方，其上有3个孔，有的有4个或5个孔。不同规格的物镜分别安装

21、在各孔上。3载物台 载物台为方形，中央有光孔，孔的两侧各装1个标本夹片，载物台上还有移动器，其上有刻度尺。移动器可纵向和横向移动，其作用是夹住和移动标本。4镜臂 镜臂支撑镜筒、载物台、聚光器和调节器。镜臂有固定式和活动式两种。本试验所用显微镜的镜臂为活动式。5镜座 镜座为马蹄形，支撑整台显微镜，其上有反光镜。6调节器 调节器包括大、小螺旋调节器（调焦距）各一个。可调节物镜和所需观察的物体之间的距离。调节器装在镜臂上方，通过升降镜筒来调焦距。（二）显微镜的光学系统1目镜 每台显微镜备有3个不同规格的目镜，其上刻有5×、10×、16×等数字和符号，意指使用时可放大5倍

22、、10倍和16倍。2物镜 物镜装在转换器孔上，可分低倍镜、高倍镜和油镜三种，其相应的放大倍数常是10、40（或45）、100（或90）。通常显微镜的放大倍数等于物镜放大倍数与目镜的放大倍数的乘积。例如，用放大40倍的物镜（高倍镜）与放大16倍的目镜时所得的物像的放大倍数为40×16640倍。在使用低倍镜和高倍镜时，标本和物镜之间的介质时空气。油镜的放大倍数通常为100倍，使用油镜时，物镜与标本之间的介质是香柏油，即在标本上滴上一滴油，再将油镜浸没在油中。3聚光器 聚光器在载物台的下面，反光镜反射来的光线通过聚光器被聚集成光锥照射到标本上，可增强照明度，提高物镜的分辨率。聚光器可以上下

23、调整，中央装有光圈，用以调节光线的强弱。当光线过强时，应缩小光圈或把聚光器向下移动。4反光镜 反光镜装在镜座上，有平、凹两面，光源为自然光时用平面镜，光源为灯光时用凹面镜。它可以自由转动方向。反光镜可反射光线到聚光器上。 四、油镜物镜的基本原理一般在镜头上有一白圈或红圈的，表示为油镜物镜，也有的以“OI”或“HI”字样来表示。使用时，油镜物镜与其它物镜的不同是载玻片与物镜之间，不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=1.52，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生曲折。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系，当光线通过

24、玻片后，受到曲折，发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就降低了视野的照明度。如图1-2所示。图1-2 物镜干燥系（a）与油浸系（b）光线通路图1-3 物镜的光线入射角利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径（N.A.），因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓的数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示：N.A.=n sin/2 N.A.=数值孔径n介质折射率最大入射角，即镜口角。因此，光线投射到物镜的角度越大，显微镜的效能就越大（图1-3），该角度的大小是由物镜的直径和焦距决定的。n是影响数值

25、孔径的因素，n值越大，数值孔径也越大。如光线入射角为120°，其半数的正弦为sin60°0.87，由图1-4可知，而n空气1，n水1.33，n香柏油1.52，n玻璃1.52，则：以空气为介质时：N.A.=1×0.870.87以水为介质时：N.A.1.33×0.871.15以香柏油为介质时：N.A.1.52×0.871.32图1-4 油浸作用显微镜的性能还依赖于物镜的分辨率，分辨率是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。分辨率用表示。0.61×/N.A. （式中为波长）它与物镜的数值孔径成正比，与光波长度成反比，因此，物镜的数值孔径越

26、大，光波波长越短，则显微镜的分辨率越大，被检物体的细微结构也越能更明晰地区别出来。事实上可见光的波长（0.380.7m）是不可能缩短的，只有靠增大数值孔径来提高分辨率。五、显微镜的操作步骤（一）观察前的准备1置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约为一寸左右。镜检者姿势端正，一般用左眼观察，右眼便于绘图或记录，两眼必须同时睁开，以减少疲劳，亦可练习左右眼均能观察。2调节光源，对光时应避免直射光源，因直射光源影响物像的清晰，损坏光源装置和镜头，并刺激眼睛。如室内光线不足或阴暗天气，可用日光灯或显微镜灯照明。调节光源时，先将光圈完全开放，升高聚光器至载物台同样高，否则使用油镜时光线较暗。然后转

27、下低倍镜观察光源强弱，调节反光镜，反光镜有凹平面，光线较强的天然光源，宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜。在对光时，要使全视野内为均匀的明亮度。凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线。（二）低倍镜观察检查的标本须先用低倍镜观察，因为低倍镜视野较大，易发现目标和确定检查的位置。1旋转转换器，将低倍镜移到镜筒正下方，和镜筒对直。2转动反光镜向着光源处，同时用眼对准目镜仔细观察，使视野亮度均匀。3将标本片放在载物台上，用标本夹夹住，移动移动器使观察的目的物置于圆孔的正中央。4将粗调节器向下旋转，眼睛注视物镜，以

28、防物镜和载玻片相碰。当物镜的尖端距载玻片约0.5cm处时停止旋转。5左眼向目镜里观察，此时可适当的缩小光圈，否则只见光亮一片，难见到目的物。同时将粗调节器慢慢向上旋转，如果见到目的物，但不十分清楚，可用细调节器调节，至目的物清晰为止。6如果粗调节器旋得太快，超过焦点，必须从第4步重调，不应正视目镜情况下调粗调节器，以防没把握的旋转使物镜与载玻片相碰撞坏。7观察时两眼同时睁开。单筒显微镜应习惯用左眼观察，以便绘图。（三）高倍镜的观察1先用低倍镜观察，发现目的物后再将高倍镜移至视野正中处。2旋转转换器换高倍镜，眼睛要在侧面观察，如果高倍镜触及载玻片立即停止旋动，说明原来低倍镜就没有调准焦距，目的物

29、并没有找到，要用低倍镜重调。如果调对了，换高倍镜时基本可以看到目的物。若有点模糊，用细调节器调就清晰可见。若视野较暗可适当调节光圈。3在视野中找到最适宜于观察的部位，将此部位移至视野中心，准备用油镜观察。（四）油镜观察1如果用高倍镜目的物未能看清，可用油镜。在用油镜观察前，必须先用低倍镜和高倍镜检查标本片，将目的物移到视野正中。2将高倍镜移至一侧，在载玻片上标本的镜检部位滴一滴香柏油（或液体石蜡），侧面观察，将油镜移至正中使油镜头浸没在油中，刚好贴近载玻片。应特别注意不能压在标片上，更不能用力过猛，否则不仅压碎玻片，还会损坏镜头。3从目镜观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用细调节器将镜筒徐徐

30、上升，直至出现清晰物像为止。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下刚好贴近载玻片，重复操作至物像看清为止。4观察细菌的示范片，用铅笔绘出其形态图。5观察完毕，上旋镜筒。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再蘸取少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其它纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。6将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成八字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免物镜与聚光镜发生碰撞危险。六、微生物形态观察（一）细菌的观察取细菌观察片，依次用低倍镜、高倍镜，确定适宜的观察视野。然后用油镜观察，并在油镜状态

31、下观察细菌具体形态，并绘制生物图。（二）酵母菌的观察酵母菌是多形的、不运动的单细胞微生物，细胞核与细胞质已有明显分化，菌体比细菌较大。繁殖方式也比较复杂：无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母菌是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过结合产生子囊孢子。用美蓝染色制成水浸片，不仅可观察其外形，而且可以区分死活细胞。取酵母菌观察片，先用低倍镜，观察酵母菌的基本形态，然后用高倍镜观察细胞内部细微结构。并绘制酵母菌形态图。（三）霉菌的观察霉菌属真核微生物，是丝状真菌的通称，菌丝较粗，分为营养菌丝及气生菌丝。营养菌丝伸入培养基内或匍匐生长在营养基的表面；气生菌丝生长在培养基上方的空气中，长出分生孢子梗和分生孢子。霉

32、菌的菌丝直径约310m，在显微镜下放大100倍清晰可见，放大400倍则细胞内部结构也能看见。多数霉菌的菌丝有隔膜，将菌丝分隔成多细胞。取霉菌观察片，先用低倍镜，观察霉的基本形态和特点，然后用高倍镜观察细胞内部细微结构。并绘制霉菌形态图。七、实验结果 分别绘出观察到的标本片的形态，同时注明物镜放大倍数和总放大率。实验记录表：微生物形态观察倍数微生物形态图细菌的观察酵母菌的观察霉菌的观察八、思考题用油镜观察时应特别注意些什么？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用? 附录 显微镜的保养显微镜的光学系统是显微镜的主要部分，尤其是物镜和目镜。一架显微镜的机械装置虽好，但光学系统不好，这架显微镜是不会

33、起好作用的。因此，对显微镜要妥善保管。1避免直接在阳光下曝晒，因为透镜与透镜之间，透镜与金属之间都是用树脂或亚麻仁油粘合起来的。金属与透镜膨胀系数，受高热因膨胀不均，透镜可能脱离或破裂，树脂受高热溶化，透镜也会脱落。2避免和挥发性药品或腐蚀性酸类一起存放，碘片、酒精、醋酸、盐酸和硫酸等对显微镜金属质机械装置和光学系统都是有害的。3透镜要用擦镜纸擦拭，若仅用擦镜纸擦不净，可用擦镜纸蘸二甲苯擦拭，但用量不宜过多，擦拭时间也不宜过长，以免粘合透镜的树脂被溶化，而使透镜脱落。4不能随意拆卸显微镜，尤其使物镜、目镜、镜筒不能随意拆卸，因拆卸后空气中灰尘落入里面引起生霉。机械装置经常加润滑油，以减少因摩擦

34、而受损。5避免用手指沾抹镜面，否则会影响观察，沾有有机物的镜片，时间长了会生霉，因此，每使用一次，所有的目镜和物镜都得用擦镜纸擦净。6显微镜放在干燥处，镜箱内要放硅胶吸收潮气。目镜、物镜放在盒内并存于干燥器内，以免受潮生霉。实验 2 培养基制备与灭菌一、实验目的1熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备工作。2掌握配置和分装培养基的方法3掌握高压蒸汽灭菌技术。二、仪器与材料1培养皿（d=90mm）10套；试管（20mm×200mm）10支；移液管（10mL）2支，（1mL）4支；锥形瓶(250mL)2个，（500mL）1个；烧杯（300mL）1个，电炉（800w）1个；玻璃珠30粒；天平；量

35、筒等。2纱布、棉花、牛皮纸（或报纸）3精密pH试纸6.48.4；10盐酸；10NaOH；4牛肉膏；蛋白胨；氯化钠；琼脂；蒸馏水；5高压蒸汽灭菌锅；烘箱；酒精灯；图8-1吸管的包扎牛皮纸或报纸吸管三、实验原理培养基是按照微生物生长繁殖所需要的各种营养物质，用人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、生长因素以及水份等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适酸碱度范围内才能表现它们最大生命活力，因此对不同种类的微生物应将培养基调节到一定的pH值范围。培养基的种类很多，不同的微生物所需要的培养基不同，就它们的物理性状来分，可分为液体的、固体的和半固体的三种。固体培养基是在液体培养基中加入

36、1.52的琼脂，半固体培养基是加入0.20.5的琼脂。 图8-2 棉塞（a）正确 （b）、（c）不正确 四、操作步骤 (一)玻璃器皿的洗涤和包装 1洗涤玻璃器皿在使用前必须洗涤干净。培养皿、试管、锥形瓶等可用洗衣粉加去污粉洗刷并用自来水冲净。移液管先用洗液浸泡，再用水冲洗干净。洗刷干净的玻璃器皿自然晾干或放人烘箱中烘干、备用。2包装（1）将移液管放在4-5 cm宽的长纸条的一端，移液管与纸条约成30°夹角，折叠包装纸包住移液管的尖端(如图8-1)，用左手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，纸条螺旋式地包在移液管外面，余下纸头折叠打结。按实验需要，可单支包装或多支包装，待灭菌。（2）用棉塞

37、将试管管口和锥形瓶瓶口部塞住棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发，故在微生物工作中一直普遍使用。棉塞的制作（见图8-2和图8-3）：按试管口或锥形瓶口大小估计用棉量，将棉花铺成中心厚，周围逐渐变薄的圆形或方形，对折后卷成卷，一手握粗端，将细端塞入试管或锥形瓶的口内，棉塞不宜过松或过紧，用手提棉塞，以管、瓶不掉下为准。棉塞四周应紧贴管壁和瓶壁，不能有皱折，以防空气微生物沿棉塞皱折侵入。棉塞插入2/3，1/3留在管口(或瓶口)外，便于拔塞。试管、锥形瓶塞好棉塞后，用牛皮纸包并用细绳或橡皮筋捆扎好放在铁丝或铜丝篓内待灭菌。图8-3 棉塞制作过程（3）培养皿由一底一盖组成一套，用牛皮纸

38、或报纸将10套培养皿(皿底朝里，皿盖朝外，5套、5套相对)包好。 图8-4 培养基的分装（二）培养基的配置过程1称量：按照培养基配方，准确称取各成份放于烧杯中。 2熔化：向上述烧杯中加入所需要的水量，搅匀，然后加热使其熔解，如是配制固体培养基，在琼脂熔化的过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，补足所失水份。如果配方中含有淀粉，则需先将淀粉用少量冷水调成糊状并在火上加热搅拌然后加足水份及其他药品，待完全熔化后，补足所失水份。3调pH值：初制备好的培养基往往不能符合所要求的pH值，故需用pH试纸或酸度计矫正用10%NaOH或10%HCl调pH至所需范围。4过滤：用滤纸

39、或多层纱布过滤，一般无特殊要求的情况下，这一步可以省去。 5分装：根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内或三角瓶内，管(瓶)口塞上棉塞。分装装置如图8-4。注意不要，使培养基沾染在管（瓶）口上以免浸湿棉塞，引起污染。（注：本实验固体培养基采用灭菌后分装）（1）液体：分装高度以试管高度的1/4左右为宜。（2）固体：分装试管，其装量为管高的1/5，灭菌后制成斜面（图8-5）。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜。（3）半固体：分装试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后，垂直待凝成半固体深层琼脂。图8-5 摆斜面6灭菌：培养基分装好了以后，塞上棉塞，外面再包一层牛皮纸，便可进行灭菌。培

40、养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损培养基的必要成份。培养基经灭菌后，必须放37温室培养24小时，无菌生长者方可使用。（三）无菌水或稀释水的制备取500mL锥形瓶盛有200mL自来水或蒸馏水，瓶口用棉塞塞好，并用牛皮纸包扎紧。高压蒸汽灭菌即可。使用时用灭菌的吸管吸取。（四）、配制培养基的配方根据实验需要选择下列配方，其它培养基的配方参看附录。1肉汤蛋白胨培养基 牛肉膏 3g；蛋白胨 10g；NaCl 5g；琼脂 20g；蒸馏水1000mL；pH 7.07.2； 灭菌：1.05kg/cm2；温度121；维持20min。 2查氏培养基 NaNO3 2g；MgSO4

41、 0.5g；琼脂 20g； K2HPO4 1g；FeSO4 0.01g；蒸馏水 1000mL；KCl 0.5g；蔗糖 30g；pH 自然灭菌：0.7kg/cm2；时间：20min。 3淀粉琼脂培养基（高氏一号）可溶性淀粉 20g；FeSO4 0.5g；KNO3 1g；琼脂 20g；NaCl 0.5g；K2HPO4 0.5g；MgSO4 0.5g；蒸馏水 1000Ml； pH 7.07.2灭菌：1.05kg/cm2；时间：20min。（五）灭菌灭菌与消毒二者含意不同，前者是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物；后者是指消灭病源菌或有害微生物而言。灭菌与消毒的方法很多，但总的可以分为物理法和化学法两

42、大类。物理的方法包括加热灭菌(湿热灭菌、干热灭菌)，过滤除菌、紫外线灭菌等。化学的方法主要是利用有机或无机的化学药品对实验室用具和其他物体表面进行灭菌与消毒。下面分述各灭菌消毒方法的基本原理及操作步骤。1.紫外线灭菌：紫外线灭菌是用紫外灯管进行的。波长为200300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。紫外线的杀菌作用主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA复制所致。另一方面，空气在紫外线照射下，可产生臭氧(O3)，臭氧也有一定的杀菌作用。紫外线透过物质的能力很差，所以只适用于空气及物体表面的灭菌，它距照射物以不超过1.2米为宜。 操作方法： 接种室常用紫外光

43、灯作空气灭菌，为了加强紫外线灭菌的效果，在开灯以前，可以在接种室内喷洒石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。接种室内的桌面，凳等可用23的来苏尔擦洗。然后再开紫外光照射30分钟左右。紫外线对人体也有伤害作用，所以不能直视开着的紫外灯光，也不能在开着灯的情况下工作。 为了检验紫外线灭菌的效果，可以在灭菌后的接种室内，桌上和桌下各放一套已倾入肉汤蛋白胨培养基的培养皿，把皿盖打开15分钟然后盖上，置37培养，如果每个平皿的菌落不超过4个，则可认为灭菌的效果良好，若菌落很多，则需延长照射时间或同时加强其它的措施。 2.加热灭菌 加热灭菌包括湿热和干热两种，湿热

44、灭菌又可分成高压蒸汽灭菌、间歇灭菌、煮沸消毒等，干热灭菌又可分成直接灼烧、恒温干燥箱灭菌等。但无论哪种加热的方法，其基本原理是一样的，即通过不同的加热方法使细菌体内蛋白质凝固变性，而达到杀灭细菌的目的。蛋白质的凝固变性与蛋白质中含水量的多少有关，含水份较多者，其凝固所需要的温度较低，反之，含水份较少者需较高温度才能使蛋白质凝固，因此杀灭芽孢比杀灭营养体所需要的温度高。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水份，使蛋白质易于凝固，同时湿热的穿透力强，而且当蒸汽与被灭菌物体接触凝成为水时，又可放出热量，使温度迅速增高，从而增加灭菌效力。 几种加热灭菌的操作方法分述如下。1

45、）高压蒸汽灭菌 高压蒸汽灭菌是利用高压蒸汽来达到灭菌的目的，其温度在100以上，有强大的杀菌能力。灭菌时是用高压蒸汽灭菌锅进行的。微生物实验所需的一切器皿、器具、培养基（不耐高温者除外）等都可用此法灭菌。高压蒸汽锅是耐一定压力的密闭金属锅，有立式和卧式两种。灭菌锅上附有压力表、排气阀、安全阀等。本实验室灭菌锅是电源加热。其操作方法：（1）加水： 打开灭菌锅盖，向锅内加入适量的水。或从加水口处加水入锅内。 （2）装锅： 加水后，将待灭菌的物品放入锅内，注意不要放得太挤，以免影响蒸气的流通和灭菌效果。然后关严锅盖，对角式均匀旋紧螺旋，打开排气阀。（3）点火：打开电源开关，加热。（4）关闭排气阀：待

46、锅内水沸腾后，则视排气阀排出蒸汽相当猛烈且微带蓝色时，可关闭排气阀。此时蒸汽将锅内冷空气驱净。（5）升压、升温：关闭排气阀以后，锅内成为密闭系统，蒸汽不断增多，压力计和温度计的指针上升，当压力达到1.05kg/cm2（温度为121）即灭菌开始，这时调整火力大小使压力维持在1.05kg/cm21530min。除含糖培养基用0.56kg/cm2压力外，一般都用1.05kg/cm2压力。（6）中断热源：达到灭菌时间要求后停止加热，任其自然降压，当指针回到“0”时，打开排气阀（请注意，排气阀不能过早打开，否则培养基因压力突降，温度没下降而使培养基翻腾冲到棉塞处，既损失培养基有玷污了棉塞）。（7）出锅：

47、排气完毕，即可扭松螺旋柄使锅盖松动。此时应该将锅盖提高12cm，并不推开，使用锅内的余热使棉塞、包头纸等烘干。1520min后。再推开锅盖，取出器物，排掉锅内剩余水。（8）待培养基冷却后置于37恒温箱内培养24h，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。若是斜面培养基，从锅内取出后立即摆成斜面，待凝后也放于37培养，若无菌，保存备用。高压蒸汽灭菌是应用最广的一种灭菌方法，一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本等都可应用此法灭菌。但应用此法灭菌是否彻底的一个重要关键是在压力上升之前，必须先用蒸汽将锅内的冷空气完全驱尽，否则，虽然压力表已指向1.05kg/cm2，但锅内的温度却还只有100，结果往往会造

48、成灭菌不彻底。2）间歇灭菌 有些培养基如明胶培养基、牛乳培养基等因不耐高温，故需用间歇灭菌法。间歇灭菌的温度和时间是100，30分钟。这样的温度和时间足以杀死一切细菌的营养体，但是不能杀死芽孢，因此采用此法灭菌是将待灭菌物经第一次灭菌后（100、30分钟)，取出置温箱培养，使其中芽孢萌发为营养体，第二日再经100，30分钟灭菌，以杀灭发育的营养体。但恐其中仍有芽孢残留，因此第三天再经培养灭菌，以达彻底灭菌。此法可用阿诺氏(Arnold)流动蒸汽灭菌器或普通蒸笼均可，不需加压，所以可普遍使用。但因手续麻烦，时间长，故一般能用高压蒸汽灭菌的均不采用间歇灭菌法。3）火焰灭菌直接用火焰灼烧灭菌，迅速彻

49、底。对于接种环，接种针或其它金属用具，可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。此外，在接种过程中，试管或三角瓶口，也采用通过火焰而达到灭菌的目的4）煮沸消毒 注射器和解剖器械等，均可用煮沸消毒。其方法是先将注射器等用纱布包好，然后放进煮沸消毒器内，加水煮沸。一般对于细菌的营养体煮沸约1530分钟即可，但对其芽孢需要延长时间，往往需煮沸12小时。如果在水内加入2炭酸钠可促使芽孢死亡，而且可以防止金属器械生锈。5）干热灭菌 最简单的干热灭菌法是灼烧法，即利用火焰直接把微生物烧死。此法灭菌迅速、彻底，但要焚毁物件，因此使用范围有限，只适合于接种环、试管口及不能用的污染物品或实验动物的尸体等的灭菌。实验

50、室中常用的干热灭菌法是指用热空气灭菌，即把待灭菌的物件均匀地放在恒温干燥箱内；加热至160170，维持2小时即可达到目的。此法只适宜玻璃器皿，金属用具等的灭菌，但是含有水份的物质，如培养基等不可用这种方法。干热灭菌的操作步骤如下：（1）将包扎好的待灭菌物(培养皿、吸管等)放于箱内，注意不要摆得太挤，以免妨碍气流流通。（2）关门，插上电源插头(常为220V)。拨动开关，旋动恒温调节器，至红灯亮。（3）待温度上升至160170时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度两小时。（4）两小时后，中断电源，待温度降至70以下以后，可开箱门取出灭菌物品，在70以上时，切勿自行打开箱门。温度过高，里边缺氧而易失

51、火，玻璃器皿骤遇冷空气会炸裂。五、实验报告记录所配置培养基的名称、成分、含量、灭菌条件等。并说明该培养基的用途类别主要成分配置体积灭菌条件培养基用途六、思考题1、培养基是依据什么原理配置成？2、肉膏蛋白胨琼脂培养基中不同成分各起什么作用？3加压蒸汽灭菌开始之前，为什么要放尽锅内的冷空气？灭菌后，压力表未降低到“0” 时为什么不可开盖?4试述高压蒸汽灭菌灭菌原理和方法。附录： 其他常用灭菌与消毒方法一、过滤除菌 过滤除菌是用细菌过滤器进行的。 此滤器的过滤板的孔眼非常小，至使细菌不能通过，故滤液呈无菌。某些不能用热力灭菌的培养基或其他溶液(如一些抗菌素、血清、疫苗等)可用细菌滤器除菌。常用的细菌

52、滤器有蔡氏滤器(Seitz滤器)，玻璃滤器等。蔡氏滤器是用金属(银或铝等)做成的，分为上、下两节，过滤时，用螺旋把石棉板紧紧地夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液置于滤器中抽滤，每次过滤必须用一张新滤板。石棉板滤器因容积大小的不同，而有各种型号。玻璃滤器的滤板是用玻璃粉热压而成的，滤板与玻璃漏斗粘合在一起，适用于过滤细菌的型号是IG 5。反复加热灭菌和冷却，容易使滤板与漏斗之间出现空隙，此滤器就不能用了。过滤除菌操作步骤如下：（1）将过滤器及抽滤瓶等全部装置，用纸包好，在使用前先进行高压蒸汽灭菌30分钟。（2）小心将已灭菌的滤器及抽滤瓶等外面的包纸打开，以无菌操作把滤器安装于抽滤瓶上。水银检压计

53、 安全瓶接电力抽气机图9-1 过滤除菌装置 （3）以橡皮管连接抽滤瓶与安全瓶(中间可连一水银检压计)，再将安全瓶接于真空泵上(图12-1)。 （4）将待除菌的液体注入滤器内，开动真空泵即可过滤。 （5）将滤液以无菌操作注入无菌瓶内，置37培养24小时，若无菌生长，可保存备用。 （6）滤器用毕后，需立即用清水洗涤干净，然后放在稀盐酸中浸泡数小时，再用清水冲洗干净，烘干备用。如过滤物是含传染的物质，应先浸入2石炭酸溶液中2小时后再行洗涤。 注意：过滤时间不宜过长，因低压能使屈曲运动的细菌通过滤器，但也要避免高度减压因微小颗粒将堵塞于滤板之内，而失去过滤效能。一般以100200毫米水银柱减压为限。（

54、四）化学灭菌 实验室常用于消毒灭菌的化学药剂有如下几种：1福尔马林 福尔马林为甲醛气体溶于水的溶液。 普通市售的福尔马林约含甲醛3740，是一种强烈的杀菌剂，可利用其蒸汽或溶液灭菌，其主要作用是使蛋白质凝固。10福尔马林溶液常用于组织标本的固定。其蒸汽常用于接种室或培养室的熏蒸灭菌。福尔马林熏蒸是利用其挥发所产生的气体。通常用量按每立方米26毫升计算，必要时可再加大用量。挥发甲醛有两种方法；一种是直接加热；一种是氧化。（1）加热熏蒸 按熏蒸空间计算，量取甲醛溶液，盛在小铁筒内，用铁架支好，把酒精灯灌上适量酒精(估计能蒸干甲醛溶液所需的量，不要超过太多)。将室内各种物品准备妥当后，点燃酒精，关闭

55、室门，任甲醛溶液煮沸挥发。酒精灯最好能在甲醛蒸完后即自行熄灭。（2）氧化熏蒸 按甲醛液用是的一半称取高锰酸钾于一磁碗或玻璃容器内，再量取定量的甲醛溶液，室内准备妥当后，把甲醛液倒在盛有高锰酸钾的器皿内，立即关门。几秒钟后，甲醛溶液即沸腾而挥发。 高锰酸钾是一种强氧化剂，当它与一部份甲醛液作用时，由氧化作用产生的热可使其余的甲醛液挥发为气体。甲醛液熏蒸应在使用前至少24小时进行，熏蒸后密闭保持12小时以上，再行处理使用。用甲醛液熏蒸对人的眼、鼻有强烈刺激作用，在相当时间内不能进室工作，因此应在熏蒸后12小时，量取与甲醛液等量的氨水，迅速放于室内，这样可以减弱对人的刺激作用。2石炭酸(酚) 石炭酸

56、是一种常用的防腐剂或杀菌剂。其主要作用也是使菌体蛋白质疑固，而且其渗透力也很强。配成35%的水溶液是一种常用的消毒剂。一般用于接种室内喷雾，进行桌面、地面和墙壁的消毒。3煤酚皂液(来苏尔) 煤酚皂也是一种消毒剂，但在水中的溶解度低。和肥皂制成乳浊液可以增强共悬浮性及吸附性，杀菌作用即大为提高。1一2的煤酚皂水溶液常用于无菌操作前洗手消毒(浸泡12分钟)，或用于室内喷雾消毒。也可用3溶液浸泡用过的吸管等玻璃器具(浸泡1小时)。4酒精(乙醇) 酒精也是常用的消毒剂，其杀菌力随其浓度不同而有变化：浓度过高(95100)的乙醇接触菌体后，立即引起菌体表层蛋白质凝固而形成了一层保护膜，使得乙醇分子不能渗入其内，影响杀菌效果；浓度过低，则杀菌力减弱。实验证明，以70