艾滋病检测技术规范

1、艾滋病检测技术规范艾滋病检测技术规范江苏省疾控中心江苏省疾控中心 胡海洋胡海洋2012.10.22 2012.10.22 苏州苏州主要内容艾滋病诊断标准样品的采集、处理、保存、运送及接收HIV抗体检测ELISA的影响因素及质量控制快速检测的注意事项及质量控制HIV抗体确证试验艾滋病实验室质量管理艾滋病实验室生物安全艾滋病诊断标准（WS293-2008）HIVHIV感染者感染者（15岁以上）符合下面一项即可诊断HIV抗体确证试验阳性或血液中分离出HIV毒株有急性HIV感染综合征或流行病学史，且不同时间的两次HIV核酸检测结果均为阳性艾滋病病例艾滋病病例（15岁以上）符合下面一项即可诊断HIV感染

2、和CD4 T淋巴细胞数 1ml样本的质量 无严重溶血，无微生物污染，无血脂过多，无严重黄疸等管子的质量 防漏三层包装 单管包装重新采样样品的运送要求样品和送检单分开专人送样血清or血浆2-8度运送或者冻存状态下直接运送CD4/CD8淋巴细胞测定的全血样品室温18-25运送抗原及核酸检测的样本 冻存状态下冰壶冷藏运送，避免冻融DBS/DPS样品应在室温18-25运送送样单要求送样单打印检测者/审核者手签，单位或实验室盖章信息完整(送检人群、身份证号码、联系电话、现地址及户籍地址等)详细的样本来源(监管场所的具体到哪个监管场所)充分利用备注栏规范性(试剂、cutoff值等)样品的接收打开包装，注意

3、生物安全，个人防护核对样品与送检单，检查样品管有无破损和溢漏记录 一般记录，另外记录有无严重溶血，微生物污染、血脂过多及黄疸等情况开盖 生物安全柜中，个人防护主要内容艾滋病诊断标准样品的采集、处理、保存、运送及接收HIV抗体检测ELISA的影响因素及质量控制快速检测的注意事项及质量控制HIV抗体确证试验艾滋病实验室质量管理艾滋病实验室生物安全HIV抗体检测的目的HIV抗体检测可用于诊断诊断、血液筛查血液筛查、监测监测等。以诊断为目的的检测是为了确定个体HIV感染状况，包括临床检测、自愿咨询检测、根据特殊需要进行的体检等。以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HIV，包括献血员筛查和原料血浆筛

4、查。以监测为目的的检测是为了解不同人群HIV感染率及变化趋势，包括各类高危人群、重点人群和一般人群。HIV抗体检测的要点根据目的选择检测方法及检测策略。严格遵守实验室标准操作程序（SOP）。筛查试验阳性，须做确证试验。筛查试验阴性，不应做确证试验。筛查及确证试验阳性均应做好咨询工作。HIV抗体筛查试验流程样 品初筛试验初筛试验筛查试剂阳性反应阴性反应复检试验复检试验原有试剂+另一不同原理（或厂家）试剂或另外两种不同原理（或厂家）试剂一阴一阳均阴性反应均阳性反应确证试验报告阴性筛查试剂国家食品药品监督管理局注册批准ELISA试剂批批检合格在有效期内推荐使用经临床质量评估敏感性和特异性高的试剂初筛

5、试剂 高敏感性复检试剂 高特异性筛查方法酶联免疫吸附实验（ELISA）第三代试剂 双抗原夹心法第四代试剂 抗原抗体联合诊断试剂 同时检测P24抗原和抗HIV-1/2抗体 缩短窗口期 注意复检试剂的选择注意复检试剂的选择化学发光或免疫荧光试验筛查方法快速检测（RT）明胶颗粒凝集试验（明胶颗粒凝集试验（PAPA） 将HIV抗原致敏的明胶颗粒作为载体，与待检样品作用，混匀后室温反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。免疫渗滤试验免疫渗滤试验 斑点斑点ELISAELISA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验速试验 均以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原点状固定在膜上，加待检

6、样品。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。有效试验的质控点必须显色。免疫层析试验免疫层析试验 以硝酸纤维膜为载体，HIV抗原线状固定在膜上，待检样品沿着载体迁移，阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。有效试验的质控带必须显色。酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素样品溶血标本及混有红细胞的血清采用ELISA法检测易产生假阳性 可能是溶血血清中含有过氧化酶物质（红细胞或血红蛋白中的亚铁血红素），在洗涤过程中往往难以完全洗脱，它可使H2O2释放出原生态氧(O)，从而催化底物四甲基联苯胺生成可溶性的有色物质，即显蓝色，产生假阳性。轻微溶血没事，严重溶血的标本易产生假阳性。受细菌污染的标本因菌体中

7、可能含有内源性辣根过氧化物酶，因此，被细菌污染的标本同溶血标本一样，亦可产生非特异性显色而干扰测定结果。酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素样品塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性 ，最好使用真空采血管或抗凝管。（抗凝剂会略有影响，但影响不大）标本凝固不全 在工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清。酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素按说明书要求，实验前应取出试剂稳定

8、加样加样的量要准确 移液器要经常清洗 定期校准加样位置 孔壁1/3以下 不可溅出 不可产生气泡必须使用一次性TIP头，严格控制，防止交叉污染先加稀释液的，加样时可用移液器孔内吹打混匀移液器的校准可以送检，可以自校，自校要有SOP有记录酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素孵育时间 严格按照试剂盒说明书操作 容易控制温度 严格按照试剂盒说明书操作 用校准的温度计监测温度，特别是冬天，避免因温度过低导致假阴性。封板 孵育时不贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁,难以清洗彻底。恒温孵育设备的使用与维护校准的温度计监测ELISA反应温度水浴的尤其要注意水位酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响

9、因素洗板洗液的量 试剂不同，板孔的大小差异会导致洗液的量的不同，为保证洗的彻底，原则是量足够多且不会逸出。浸泡时间 严格按照试剂盒说明书操作，一般30-60秒，不设置浸泡时间或时间太短，洗脱不彻底的话会产生“花板”。 保持针孔通畅不阻塞 血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机的针孔处于阻塞状态，造成未结合标记酶洗脱不彻底，导致“花板”。应做好洗板机的维护工作。拍板酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素洗板机的检定、使用及维护检定：注液量和残留量使用：设置程序（注液量、洗板次数、浸泡时间、洗板位置）维护：蒸馏水冲洗酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素显色加底物时，应悬空加液，

10、避免触及板孔内壁造成交叉污染。应先加底物缓冲液再加TMB底物，加入顺序不能颠倒。已显浅蓝色的TMB底物坚决不能用。个别试剂要求A、B液先混合后再加。温度与时间的控制。酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素终止及读板读板前应保证板孔底部干净，无异物，无水气，无气泡，特别是在冬天。酶标仪不应放置在阳光或强光照射下,操作时室温宜在15-30,使用前先预热15-30 min,测读板结果会更稳定。酶标仪必须检定酶联免疫吸附实验（ELISA）的影响因素Cutoff值计算及结果判定注意事项严格按照试剂说明书要求的数量做阴、阳性对照根据阴、阳性对照的值判定实验是否成立严格按照试剂说明书要求计算Cutoff值

11、注意空白原始记录标明空白对照、阳性对照、阴性对照、外部对照以及待检样品的位置试剂盒厂家、测定方法、批号、效期操作人员和复核人员姓名（签名）检测日期其他（环境、设备、实验依据等）注意样本的溯源性废弃物处理消毒液（含氯消毒剂、75%乙醇、2%戊二醛）干烤消毒（140 2-3h）高压蒸汽消毒（121 15-20min）高压灭菌器检定：温度和压力高压灭菌器使用效果监测：化学指示卡，生物监测（嗜热脂肪杆菌芽孢）酶联免疫吸附实验（ELISA）的质量控制试剂盒内部对照：试剂盒内部对照质控品即为试剂盒内提供的阳性和阴性对照血清。试剂盒内部对照用于判断每次实验的有效性，但不能作为室内质控品使用。每一次检测临床样

12、品时，必须有试剂盒内部对照，而且只能在同批号的试剂盒中使用。内部对照结果无效，必须重新试验。室内质控品：为非试剂盒组份的外部质控品，是为了监控检测的重复性而设置的，包括强阳性、弱阳性和阴性质控血清。也可以只设置一个弱阳性质控，以该试剂盒临界值（Cut-off）的23倍为宜。外部质控品的作用是，判断该批临床样品检测的有效性，因此，每次实验必须包含室内质控品，其结果无效，必须重新试验。室内质控品可以是商品或实验室自行制备。酶联免疫吸附实验（ELISA）的质量控制Levey-Jennings质控图：外部质控品的均值和标准差应建立在实验室常规使用方法对质控物重复测定的基础上。一般采用在不同批次检测取得

13、至少20个数据；如果仅做少量批次的检测，也至少做5个批次的检测，每个批次中不少于4个质控血清测定结果，以建立一个临时性的均值和标准差，当达到20批次数据后，替代临时性的均值和标准差。从第21次起，将每次质控血清的检测结果依次点入该质控框架图中，检验进入质控状态。酶联免疫吸附实验（ELISA）的质量控制绘制和分析质控图的要点 改用新批号试剂如外部质控品测定出现较大变化应重新制作质控图。使用新批号或不同厂家的试剂盒必须在质控图上注明使用日期。使用新批次的外部质控品时，如测定值出现较大变化，须重新绘制质控图。变异系数(cv)小于20，表示外部质控品处于稳定状态。酶联免疫吸附实验（ELISA）的质量控

14、制质控规则及其应用告警（2s）：当外部质控品的S/CO值超出2s范围时，系统处于告警状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观察。失控（3s）：当外部质控品的S/CO值超出3s范围时，系统处于失控状态，本次实验结果不能被接受，可能是系统误差、随机误差或外部质控品 稳定性下降所致。酶联免疫吸附实验（ELISA）的质量控制质控规则及其应用漂移：连续几次（35次）外部质控品的S/CO值都落在均值的一侧则称为漂移，提示实验条件发生了较大的变化。趋势：连续几次（57次）外部质控品的S/CO值几乎按一个方向分布时称为趋势，通常由参数的缓慢改变引起。酶联免疫吸附实验（ELISA）的质量控制质控规则的使用应

15、检出随机误差和系统误差，即具有高的检出分析误差的能力，同时应具有较低的假失控概率。考察试验系统的可靠性应采用多规则质控方案，多规则质控方法能提高误差检出，并具有低的假失控概率。其要点为：出现一次2s范围的变化时，系统处于告警状态，应予注意，是否可以继续检测需要进一步观察。出现下列情况时，应暂停检测查找原因：（1）出现一次超出3s范围的变化；（2）连续两次出现同一方向超出2s范围的变化；（3）连续四次出现同一方向的超出1s范围的变化；（4）连续10次结果都在1s范围内，但落在均值线的同一侧。酶联免疫吸附实验（ELISA）的质量控制失控处理的补充：质控点在-2s以下的，实验做出的阳性结果为可靠结果

16、。质控点在+2s以上的，实验做出的阴性结果为可靠结果。酶联免疫吸附实验（ELISA）的质量控制存在问题：外对照值偏高，应以Cutoff值的2-3倍为宜用OD值替代S/CO值来做质控简单罗列数据做质控图随意定质控图靶值无失控原因分析及纠正措施临时性的均值和标准差未被替代掉酶联免疫吸附实验（ELISA）的质量控制“即刻法”质控 “即刻法”质控方法是在对同一批外部质控血清连续测定3次后，即可对第3次检验结果进行质控。“即刻法”实际上是数据统计处理方法中,应用Grubbs 剔除异常值方法在免疫质控中的应用，就是用检验一个室内质控结果是否为异常值的方法来判断其是否失控。“即刻法”可以有效地应用于ELIS

17、A 法检测HIV 抗体的室内质量控制，在样本量较少的艾滋病筛查实验室，可避免其无法使用常规的质控图法来进行质控的不足。酶联免疫吸附实验（ELISA）的质量控制“即刻法”质控规则 当SI上限和SI下限 n3s值时说明该值已在3s范围之外，属“失控”。“即刻法”只能在前20次内使用，超出即可采用L-J质控图方法。 酶联免疫吸附实验（ELISA）的质量控制“即刻法”质控的局限性在失控判断和连续趋势性的判断上，前3 次结果对后续质控结果影响较大。不能对第1、2 次实验结果进行质控。 方法：当更换试剂批号时,在旧批号试剂结束前将新批号试剂部分孔位与旧批号试剂同时试验3 次,两种试剂均加入同批号质控血清和

18、部分相同样本,旧批号试剂的质控结果点入质控图,新批号的质控结果按照“即刻法”分析,从第3 或第4 次实验开始运用新批号试剂对标本进行实验,这样就可以对新批号试剂的第1 、2 次实验结果进行质控。快速检测的注意事项环境温度,尤其是在冬天血清/血浆 全血 稀释缓冲液样本的量反应的时间生物安全 废弃物处理做好实验的原始记录不同厂家的快检试剂操作要求厂家厂家样品要求样品要求血量血量(ul)(ul)样品稀释样品稀释是否加缓是否加缓冲液冲液最小反应最小反应时间时间( (分钟分钟) )最大反应最大反应时间时间( (分钟分钟) )试剂储存要试剂储存要求求明胶颗粒法明胶颗粒法(PA)(PA)血清血清/ /血浆血

19、浆25251:321:32N N120120/ /2-102-10DETERMINEDETERMINE血清血清/ /血浆血浆/ /全血全血5050N N用全血时用全血时加加1 1滴滴151560602-302-30SDSD血清血清1010N NN N5 520201-301-30杭州艾康杭州艾康血清血清/ /血浆血浆/ /全血全血2525N NY Y101020202-30,2-30,勿勿冻存冻存上海科华上海科华血清血清/ /血浆血浆4040N NY Y/ /30304-304-30厦门新创厦门新创血清血清/ /血浆血浆/ /全血全血6060N NY Y1 130304-304-30广州万孚广

20、州万孚血清血清/ /血浆血浆/ /全血全血80-10080-100N N用全血时用全血时加加2 2滴滴101030304-30,4-30,勿勿冻存冻存北京万泰北京万泰血清血清/ /血浆血浆8080N N用全血时用全血时加加1 1滴滴/ /3030室温储存，室温储存，可置可置2-8 2-8 快速检测的质量控制-检测前质量控制样品要求唯一编号，实验前仔细核对，检查。检测人员每日检查室内的温湿度，实验环境温湿度应在试剂盒操作说明书要求的范围内，试剂和样品应按要求存放，并做好记录。检查是否有足够的试剂库存，确认试剂是在有效期内，禁止使用过期试剂。每批实验如果应用不用批号的试剂，应做好记录。快速检测的质

21、量控制-检测过程质量控制准备好试验区域，摆放必要器具。记录样品编码、姓名、试剂名称及批号、操作者姓名等。核对样品标号、标记，检测，防止错号。收集并集中摆放全部待检样品，包括外部质控品。按照试剂厂家提供的说明书开始操作。需要在冰箱保存的试剂，从冷藏环境中取出后放置室温，平衡后再使用。剩余的试剂条应立即放入自封袋中密封2-8度保存。可以在室温条件下保存的试剂也应避免高温。快速检测的质量控制-检测过程质量控制建议每一次最多做10个样品，确保试纸条的编号与标本编号的准确对应，防止错号和交叉污染。结果判定时，质控带必须出现实验才能成立。如实验完成后未呈现质控条带，本次实验结果无效，样品须重检。同时，除每

22、个检测日做一次外部质控品外，下列情况下也需加做外部质控品：更换检测人员时；更换不同试剂批号时；更换不同的试剂包装时；更换不同的试剂厂家时。快速检测的质量控制-检测后质量控制实验结果进行判读时，应保证判读地点光线充足。对于难以判读的条带，最好有2人判读。复核样品编号并填写实验结果。清洁并处理实验废弃物。向实验室负责人报告检测结果。检查试剂库存量，根据实际需要，提前向上级实验室申请补充。快速检测的质量控制-补充收到或检测时发现试剂出现如下问题，提示存在质量隐患，应详细记录：收到试剂时，试剂的外包装盒或内容物已损伤；标签出现错误、缺失或字迹模糊（特别是产品厂家名称，批号和货号，失效期或/和生产日期）

23、；缺失目录或操作说明书；试剂盒内容物出现渗漏等。稀释法评价试剂质量，一般采用5倍梯度稀释。HIV抗体确证试验的方法WB 免疫印迹试验LIA 条带免疫试验RIPA 放射免疫沉淀试验IFA 免疫荧光试验WB检测HIV抗体的原理将提纯的HIV抗原用SDS-PAGE分离成几个不同的抗原蛋白带，再将这些抗原蛋白带转印到NC膜上，然后把NC膜分成条状作为抗原条带，以检测个体血清中是否存在一种或多种抗HIV抗原的抗体。NC膜条上结合了天然灭活HIV-1型病毒蛋白的分离颗粒和特异性的HIV-2型合成多肽。在NC膜条分别加入稀释的血清或血浆标本或对照，孵育。如果标本中含有HIV-1或HIV-2型的特异性抗体，则

24、抗体会与NC膜上的HIV-1蛋白或HIV-2多肽结合，通过TBS缓冲液清洗去除NC膜上的未结合物，与HIV蛋白特异性结合的抗体再通过与带有碱性磷酸酶的羊抗人IgG抗体结合，加入BCIP/NBT底物等一系列反应即可显色。3rd gen ELISA1st gen ELISADetuned ELISA1wk 2wk 3wk 2mo 6mo 1yr 2yr 3yr +8yrgp160gp120p68p55p53gp41-45p40p34p24p18p12gp160gp120p68p55p53gp41-45p40p34p24p18p12gp160gp120p68p55p53gp41-45p40p34p2

25、4p18p12earlyrecent / establishedadvancedHIV抗体不确定非特异性的反应新感染晚期病人（极少数）HIV抗体不确定结果的随访结合流行病学资料，可以在4周后随访检测，如带型没有进展或呈阴性反应，则报告阴性；如随访期间出现阳性反应，则报告阳性；如随访期间带型有进展，但不满足阳性标准，应继续随访到8周。如带型没有进展或呈阴性反应则报告阴性；满足HIV抗体阳性诊断标准则报告阳性，不满足阳性判断标准可视情况决定是否继续随访。HIV感染产妇所生婴幼儿婴儿会由于被动携带母亲的抗体而连续几个月至十几个月出现抗体阳性。婴儿满12个月进行第一次HIV抗体检测。使用两种不同原理或

26、不同厂家筛查试剂进行抗体检测，两种筛查试剂检测结果均为阴性反应，报告HIV抗体阴性，可排除感染。检测结果出现阳性反应（一种为阴性反应一种为阳性反应或两种均阳性反应），不能排除感染，应继续追踪随访，至儿童满18个月时再次进行HIV抗体检测。HIV感染产妇所生婴幼儿婴儿满18个月时应再次进行HIV抗体检测。使用两种不同原理或不同厂家筛查试剂进行抗体检测。两种筛查试剂的检测结果均为阴性反应，报告HIV抗体阴性，可排除感染。检测出现阳性反应（一种为阴性反应一种为阳性反应或两种均呈阳性反应），进一步进行确证试验，根据确证试验的结果判断是否感染HIV。做好检测后咨询。主要内容艾滋病诊断标准样品的采集、处理

27、、保存、运送及接收HIV抗体检测ELISA的影响因素及质量控制快速检测的注意事项及质量控制HIV抗体确证试验艾滋病实验室质量管理艾滋病实验室生物安全实验室质量管理行政支持人员培训环境条件：实验室的设置及其建筑、设施、设备必须符合全国艾滋病检测工作管理办法的要求。HCV，HBV及梅毒等血清学检测在满足实验室管理要求和保证生物安全的条件下，可以与HIV检测共享空间和设备，应避免交叉污染。实验室质量管理样品采集、运送和处理送检单收样登记表HIV抗体复检检测单检测方法和试剂的选择试剂的出入库及使用记录供应品、耗材（试剂）质量验收记录表实验室质量管理设备维护与校准仪器设备温度记录表仪器设备使用、检定、维修、维护记录本强检计量器具周期检定（自校）计划表文件和文件管理实验原始记录表结果报告样品登记和保存（唯一编码）实验室质量管理文件和文件管理标准操作程序（SOP）（1）样品的接收、登记、