第04章 裂殖壶菌生产二十碳六烯酸技术的发展：历史观点与更新介绍童愈元

1、第四章 裂殖壶菌生产二十碳六烯酸技术的发展：历史观点与更新介绍长链- 3脂肪酸对人体健康的重要性对长链多不饱和-3脂肪酸（LC-PUFAs），二十碳五烯酸（EPA,20:5n-3）和二十碳六烯酸（DHA，22:6n-3）营养的重要性的认识，开始出现于80年代中期。前二十年的研究指出：（1）通过引进现代农业的实践，人体摄入脂肪酸要更高；（2）脂肪酸摄入量较高的这些人群表现出慢性疾病，包括心血管疾病，关节炎，哮喘，糖尿病。(3)独特的化合物，叫做花生酸，是从这些不饱和脂肪酸而来，这些花生酸有保护作用，对一些疾病的研究正在逐步发展。在80年代，-3多不饱和脂肪酸在人类饮食中的主要来源是鱼或鱼油胶囊。

2、鱼油消费在北美历来较低，鱼油胶囊不受欢迎因为人们接受不了其劣质感官（味觉、气味）特性。由于其强烈的鱼气味问题，试图利用鱼油作为食品成分亦大多不成功。试图改善鱼油的感官特性仍然不成功，出现了关注环境污染水平（多氯联苯，二噁英和汞）的鱼类报告，这将继续给我们造成麻烦。我们知道现在多不饱和脂肪酸的主要来源不是由鱼的生物合成，而是由他们的饮食产生，是食用浮游生物的结果。我们假设，如果能够开发一种在经济上培养一种微生物菌株，特别是含有丰富的-3多不饱和脂肪酸，这将提供一个可以接受的这些化合物的来源，将会避免在鱼和鱼油中发现的感官和环境污染问题。虽然鱼油含有EPA 和DHA，而且大部分研究表明了鱼油中包含

3、的-3多不饱和脂肪酸的重要性，但是我们作出决定最初专注于DHA的生产。新的研究表明，尽管EPA有明显的抗炎作用，DHA对婴儿营养很重要，对成人血脂及心血管健康产生积极影响，更有效的在人体内保留，并且可以随时产生EPA。这些和其他因素表明，DHA可能更好从-3多不饱和脂肪酸座位食物成分或营养消费与补充中获得。-3多不饱和脂肪酸的来源海洋微藻被确认是生来-3多不饱和脂肪酸的主要微生物。细菌与酵母不知能生产-3多不饱和脂肪酸，后来，少数细菌菌株在深海鱼肠中被发现可以产生EPA，但仅在磷脂中形成。因为磷脂在微生物中的干重最高只有10-15%，一个产生长链-3多不饱和脂肪酸的磷脂在经济上不能算是一个产生

4、DHA的合适的选择。然而，一些微藻和真菌可聚合作为三酰基甘油干重的80%。从微生物菌种中生产DHA的成本需要用到微生物，这能生产大量的三酰基甘油。虽然在一时，室外池塘和光生物反应器是生产微藻最普遍采用的系统，但是这些系统的使用非常昂贵，因为是非常低的生产能力和细胞浓度，而又需要大量的水用来离心回收生物量，缺乏控制形成最大化目标产品，以及无法保障在户外系统生产食品级的。尽管已提出在大型发酵罐生产藻类，但是这个研究主要侧重于淡水微藻，实际生产不出-3多不饱和脂肪酸。此外，由于-3多不饱和脂肪酸与微藻的光合作用无关，但有最初对只用非光合作用生产系统实现这些脂肪酸氧自由基的产生。在一段时间，两个长链-

5、3多不饱和脂肪酸的竞争过程在发展。日本学者试图修改为在花生四烯酸的发酵过程中利用被孢酶的真菌也能产生EPA。修改的过程包括在低温条件下生长的真菌或冷了好几天生产的EPA的收获量。然而，这些修改导致非常低的整体生产力。竞争过程中所涉及的第二个通过发酵培养的隐甲藻生长缓慢。我们相信，这两项技术的改善在他们可以使廉价生产所需的DHA在食品生产成本的有效成分很有必要。替代技术发展的必要认识到一个多不饱和脂肪酸替代来源的需要，在当时在开发具有竞争力技术状态的反应，我们作出决定，追求一种替代技术开发利用的一组不同的假设。第一，我们认为目前还没有已知的微藻在在一定成本下针对鱼油可有效地生产-3多不饱和脂肪酸

6、。一种微生物的生产技术的发展需要-3脂肪酸的新的，自然生产的分离与鉴定过程。第二，这些菌株需要在较高温度下产生长链-3脂肪酸，这在当时是有悖常理的，通常这些脂肪酸的生成是在较低温下，并尝试保持其细胞膜的弹性与运作的。第三，我们认为解决这些重大腐蚀问题根本需要是联系在与海洋微生物生长相关的不锈钢发酵罐的。其他的都生长在玻璃海洋微藻发酵罐里，以免受到腐蚀。然后大规模的发酵罐非常昂贵，在世界各地只有少数商户提供。玻璃发酵罐只是部分解决了这个问题，而忽略了远离海洋的下游加工设备的腐蚀与高盐的废物的位置问题。最有可能的生产候选者将可能是海洋毒株，新的在非常低矿化度的条件下培养他们的新计划就必须发展，以尽

7、量减少海洋发酵介质的腐蚀作用。在确定所有的替代技术以后，我们决定迅速、有竞争力并全面解决所有这些问题的最好的方法是利用一个合理的生物方法来收集、隔离与筛选。这种做法能够确保菌株的富集与鉴定，很有可能是全部或大部分的理想生产技术，极大的方便了发展的需要。本文描述了生物方法产生微藻技术的发展，这种发展在激烈的研究和产品的最终商业化的基础上产生并实现。另外，我们概述了很多微生物技术发展的利益，这种发展导致了这种类型的方法的使用。自从我们从1987年开始开发这种技术，许多研究人员开始认识到这个微生物组的生物技术潜力，并致力于了解他们的生产潜力和生产其他可能生产脂肪酸化合物的潜力。生物技术的发展一个生物

8、合理的方法首先确定为最可取的特点，一个理想的生产菌株应具备，无论是在系统实现的目标的生产条件或是目标产物。像这样一个孤立的变化随后被发展，借鉴从生态学，生理学生物化学进化学所派生出来的概念。我们提出的技术的最终目标是在要在传统的廉价生产的不锈钢发酵罐中利用葡萄糖为碳源生产大量的DHA异养微藻。考虑到这一点，一个生物合理的收集、隔离、过筛用于计划使用组合特点孤立微生物，表4.A中有概述。这些特点在微生物中是可取的，并且在经济上适用于-3脂肪酸的生产。以互补的方式，制定了一项计划，从温度与盐度广泛的栖息地收集微生物。这些收集物的样品包含的微生物有以下几个地方：海洋潮池，河口和内陆咸水湖泊，普拉亚斯

9、。这种工作的假设是，除了他们能够在低盐度与高温下生长之外，有些菌株可能天生能生产DHA在这些极端恶劣环境中生存的一种是适应DHA在极其波动的环境中帮助稳定细胞膜功能中具有重要的作用。表4.A 在有针对性的生产和选定的生物合理的采集、隔离、筛选方案与产品相关的特性和生物特性的背后，这些选择的理由重要的发酵罐生产特性生物理由异样生长的能力在廉价的碳源下生产（玉米糖浆）非丝状单细胞与直径小于等于25m尽量减少混合发酵罐需要的能源耐热性（在大于30生长）较高的温度等同于加快生产速度广盐性（在低盐度下生长）尽量减少不锈钢发酵罐的腐蚀全细胞藻类在食品中使用或提取DHA油的重要特性-3多不饱和脂肪酸的含量目

10、标产品的高含量合适的低饱和与-6脂肪酸在一些应用中不合意合适的无色素的，白色或无色的细胞目标是在食品中看不见的成分这种收集、隔离与过筛方案的实施已经在Barclay中详细列出了。简单的说，从目标生态水样中贯穿一个三明治过滤系统消除的细胞要长于25m；从1-25m的含生物材料聚碳酸酯过滤器被放置在盐度低，温度为30的平板营养琼脂培养基上。清晰与白色的菌落，这些菌落没有酵母菌菌落，这些菌落被挑选，培养，然后和脂肪酸含量一起用气相色谱分析。初步结果表明，生物合理收集、隔离有两个藻类或微藻类微生物组选择：硅藻和海洋真菌。硅藻的新分离株主要生产EPA，然而增长相对缓慢。此外，硅藻已知细胞壁含有二氧化硅，

11、这可能使得他们很难在高浓度发酵罐中生长，因为与其脆弱性和提供硅生长发酵有关。因此，我们决定把重点放在破囊壶菌属株。破囊壶菌属在当时的生物技术角度而言相对不详。破囊壶菌属是微藻或微藻类微生物。最早对破囊壶菌的研究是把它们放在异养菌中，因为它们的性质和它们的表面和壶菌相似。后来利用分子生物技术分析表明，破囊壶菌没有真菌，而是关于异鞭毛类藻类。在20世纪80年代末以前，对破囊壶菌的研究大多侧重于它们的分布、分类、超微结构与生理学。因为破囊壶菌一般都是很浅的色素，它们很可能是根据上报的浮游植物样品。后来的分析表明，它们包括了相当一部分的浮游植物群落。在我们无公害收集、隔离方案实施以前，在科学文献中并没

12、有任何报道认为破囊壶菌是良好的脂质生产者。有两份报告认为在破囊壶菌在其脂类中存在长链-3脂肪酸，但是迟至1992年，肯德里克和拉特利奇在他们自己的数据报告中指出，破囊壶菌中只含有10-15%的生物油，并为促进本微生物脂量高的前景似乎是有限的，由于它的一个关键酶缺乏脂肪堆积。然而，我们相信通过使用到收集、隔离与筛选这种程序后，我们能够隔离破囊壶菌株产生大量脂质，并在同一时间，有所有的发酵生产的产品具有的针对性的特点。最重要的是，这些菌株也有三个重要的属性：（1）相比现有的破囊壶菌株的技术（每天3-5倍），分离菌株拥有快速的增长（每天6-9倍）；（2）在总脂肪酸中占有大量比例的-3脂肪酸在高温下（

13、30）仍然能产生；（3）加强菌株产脂与DHA产品能够在低盐度下生长，并提高富含脂质的DHA的生产。即使在非常低的盐度下-3脂肪酸有所降低，我们发现通过改变钠盐和氮盐发酵在发酵中使用的介质类型，在油中的DHA浓度可以提高21%到43%，这在一个非常低盐度的情况下不需要生物质的重量损失。由于氯是海洋媒介的一部分，其造成了大部分的金属腐蚀，于是我们致力于发展使用低含量钠和氯来栽培。为了尽量减少应力腐蚀开裂，建议用来发酵培养基的不锈钢发酵罐中氯化物的含量小于300ppm。表示可能是硫酸钠氯化物的栽培介质有效代替品，而我们最终能够发展在氯化物含量小于300ppm的介质。因此，通过实验来解决严重的腐蚀问题

14、，并提出通过在不锈钢发酵罐中培养海洋生物，我们惊讶的发现了也可以在破囊壶菌株中增加DHA产品。一个额外的惊喜是，钠硫酸盐中也呈现出在裂殖壶菌中进一步限制网状结构。破囊壶菌的一个独特的特点是他们产生ectoplasmic 网，他们把细胞连接起来。这些网可导致集中分布在液体培养基产生的细胞缓慢生长。增长最迅速的品种被裂殖壶菌所分离。ATCC20888，但唯一的特点是部分产生有限的ectoplasmic 网。奇怪的是，我们在钠硫酸盐基中培养一个细胞时ectoplasmic 网产品呈现出更进一步的减少，一个额外的好处反应在我们解决腐蚀问题的尝试中。初步毒理学筛选在20世纪80年底后期，很少有人知道破囊

15、壶菌的生理与生化是一起的，并没有公布有关情况下微藻毒素组存在。这样的结果，我们决定早在技术开发过程中的毒素进行了初步筛网，以确保本组的微藻可以安全作为富含DHA的可以作为食品配料的油脂，这些微藻正在成为一种从新的生物技术角度科技发展的重点。关于Heterokonta文献的调查，对其中的破囊壶菌所属未有任何报道，并且在Heterokonta，只有两个非常不相关的产生毒素微藻的报告：（1）the diatom Pseudonitzschia sp.生产一种叫做domoic酸的神经毒素，（2）two species of Prymnesium，生产一种叫做Prymnesium毒素的磷酸化蛋白脂质毒素

16、。为了安全起见，我们用劳伦斯标准高效液相色谱法为domoic酸分析了裂殖壶菌的生物数量，但并没有发现一丝这种化合物。此外，Prymnesium毒素的存在直接关系到Vanhaecke与Larsen的敏感生物测定。结果表明在裂殖壶菌中缺少Prymnesium毒素。从其他的简单的毒性筛选结果表明，在破囊壶菌生物量中没有任何其他的毒素。这些初步结果使得有信心使操作系统安全向前，并开始扩大生产技术。扩大发酵多个公司正在合作进行发酵的扩大技术，其中包括Kelco Niopolymers、San Diego与随后的Monsanto。这项工作是结合了经典的品种进行内部改良的方案。关于几个DHA的生产参数的扩大

17、工作的进程做了总结。在我们实验室的最初生产能力在14公升阶段水平为在48小时内用40g/L 葡萄糖中的生物量为22g/L。几种方法被用来实现这些目标，其中包括多元统计，各种营养的实验设计，初步率调查，还有多种营养喂养及过程控制等多种方法。Kelco 工程师们很快加倍的在14公升水平上增加生产DHA的生产力。用他们的数据与一种介质的最佳系统，工程师们通过滴定大约8 g/L DHA能够实现细胞浓度达到65-70g/L，双倍于0.1g/L/hr。发酵技术的扩大继续以补料的方法来提供碳与氮源而进行。美联储饲料优化允许在整个发酵中控制血糖浓度。这种控制在高细胞密度中尤其重要，论证通过了进一步改进工艺，因

18、为需要更高水平的碳来源。在这快速与成功的扩大中，消毒与饲养系统设计同样也被采用。一个简单，但是有效且操作简单的方法是采用氮饲料中氮的来源来自动调节pH。大体来说，扩展到大型非常成功，此外，迅速改善和扩大这一计划也被纳入下面讨论的安全评估。在此期间，我们还开发了数据显示，低溶氧量极大地促进产生DHA。这一发现有悖于常规生化智慧，不便于高溶氧量产DHA，因为被认为是分子氧酶的过程，涉及双键脂肪酸的形成的必要性。直到最近，人们还以为所有的多不饱和脂肪酸是通过一个单一的，基本的生化途径变化合成的。能够实现增强DHA高水平生物量密度，而在溶解氧非常低的水平上运行，有可能允许更大的发酵罐在配置和规模具有灵

19、活性，从而使资本和能源需求减少。一些研究证据表明多不饱和脂肪酸合成的一种替代途径最从从海洋细菌中来。虽然许多如Ecoli的细菌被知能够生产单不饱和脂肪酸，但是普遍认为细菌不能生产PUFA组织。这种看法改变了当DeLong与Yayanos报告检测嗜冷海洋细菌株的EPA与DHA。第二个主要的发展发生在Yazawa确定了从基因组DNA片段中的EPA制作海洋细菌，0转移到E.coli ，赋予这些细胞合成EPA。进一步分析导致的EPA积累必要和足够的转化基因。虽然通过引入Shewanella基因编码的蛋白质含有与脂肪酸合成酶相关的区域，但现在还不清楚如何活动有助于合成EPA。从Shewanella，Wa

20、tanabe 提取物的生化分析为基础中提出，EPA是一种有氧脱氢酶和延长酶通过的产品，大概是五个基因编码。Metz et al.提供了不同的解释。他们指出，新生成的不饱和脂肪酸合成所需酶都可以确定Shewanella蛋白。个别领域在一些聚酮合成酶中发现的，而另一些更像脂肪酸的合成系统。聚酮合成酶系统使用相同的FAS基本反应，但往往不完整，在高度衍生产品周期结束通常包含在酮和/或羟基中，以及碳碳双键中产生。此外，聚酮合成酶系统的线性产品可环化生产，如抗生素、毒素以及其他副产品。规则上已知脂肪酸去饱和酶结构尤其缺乏Shewanella蛋白。培养E.coli在厌氧的条件下Shewanella基因的表

21、达提供了更多的证据，消除了潜在的去饱和酶；EPA的积累并没有抑制氧。为独联体双键厌氧团提供同源蛋白在两个领域存在。Fab A 是一个双功能酶，它通过脱水反应形成动脉vaccenic酸，并带可逆顺反应。一组数据表明，在Shewanella基因编码中四个正常利用脂肪酸合成酶的分子从头合成EPA亚基。编码一个单一结构域蛋白的其他基因被认定作为除了几个复杂区域外，激活一个重要辅助因子的编码。包含在同源性蛋白到Shewanella EPA 合成蛋白的基因中发现其他一些海洋细菌中含有PUFA，包括那些积聚的DHA，而不是EPA。因此第一次被认可只有少数细菌中有，PUFA合成酶的基因序列。基因组测序的基因近

22、几年大大增加，现在的公共数据库的搜索中发现数十个新的同源基因。所有包含合成酶基因组的细菌都是海洋种类，而且大多数来自于少数基因。虽然在PUFA合成酶基因簇的存在与PUFA的累积之间的直接联系已经在少数情况下成立。但是现在看来可能是发现所有的PUFA通过海洋细菌中的途径生产PUFA合成酶。虽然有些差异性被发现，但是这些基本架构可以确定为这些基因组的转译产物。我们与我们的在Calgene Campus of Monsanto的合作者发现在海洋细菌中的EPA合成相关的含有同源裂殖壶菌基因编码。裂殖壶菌具有的合成类似DHA的途径提供了一个理由，这个理由反映在DHA产物上厌氧。裂殖壶菌代表了一个有史以来

23、第一个鉴定为含有PUFA合成酶系统的真核微生物。在2001年提出了PUFA合成酶的反映的假设，直接测试这些复合酶的作用取得了一些进展。迄今所有PUFA合成酶的显著特点之一是存在多种连串的非环状蛋白质结构。Jiang检查ACP重复发现在Shewanella japonica中使用定点突变和在E.coli中这些酶的基因表达。他们证明，每个区域的个别ACP可以支持自行产生PUFA。PUFA在异物中的积累量取决于在ACP功能区域的数量。建议PUFA合成酶一周期的计划的重要一步是通过完全还原碳烯酰-还原酶活性的行为。从Streptococcus pneumonia中的三氯抗雌激素书受体的同源性的基础上，

24、实践提出了要与由细菌基因编码有关的蛋白质。最近这一假设被证实了雌激素受体蛋白从Shewanella oneidensis MR-1中来，这在E.coli中过度化验检测。有关包含在细菌系统的ACP与ER的发现可能直接用于在裂殖壶菌中发现的PUFA合成酶。虽然很少的基因序列可用于破囊壶菌的PUFA合成酶，但是在这一领域也取得了进展。Hauvermale et al.表示裂殖壶菌在E.coli的PUFA合成酶基因中，并再这些细胞中发现了DHA与DPA n-6产物。结果证明在裂殖壶菌中的单核酶在生物体中产生两个PUFA。从标准脂肪酸合成途径与相对纯净的最终产品的轮廓中而来的独立PUFA合成酶使它们成为

25、独立表达的吸引目标。尤其是PUFA合成酶的生产能力与温度特性有特定的应用价值。此外，最近发现裂殖壶菌合成酶的DHA 与DPA n-6产物是不饱和脂肪酸，而这是一个活性硫酯酶的组成部分。释放机制的原理解释了试图用如农作物油代替宿主中的PUFA产品系统。裂殖壶菌不需要氧作为长链不饱和脂肪酸产物合成酶的发现帮助我们开始在非常高密度的环境下培养这种有机体。最终扩大发酵主要涉及到四个主要主要组成部分：（1）低氯介质；（2）碳、氮源补料用品；（3）使用低含量溶解氧促使DHA的形成；（4）由此产生的生物量直接促使发酵液恢复。Bailey et.al概述在使用此过程中大于200g/L生物产量能够达到DHA浓度

26、大于20%。这个过程中所产生的DHA的生产能力大于0.55g/L.h。在发酵过程中扩大了实验室的规模，从14升发酵罐到150000商业发酵罐，在DHA产品的生产参数取得了以下主要改进：（1）最终细胞干重浓度从21提高到了170-210g/L；（2）油中的DHA在总脂肪酸中所占的含量从26%提高到了35-45%；（3）DHA的浓度在细胞干重中的比例从10%提高到了22-25%；（4）DHA的生产率从0.05 g/L.h提高到了0.45-0.55 g/L.h，增加了10倍。这些细胞浓度与DHA的生产能力是不断从高含量不饱和脂肪酸产品的微生物技术报告中得来的。用高压冻结替代裂殖壶菌的油体的电子显微分

27、析，建议在油的甘油三酯二级与三级半结构存在晶体。类似的在裂殖壶菌的油体中观察也有报道。反应在裂殖壶菌含量的传统的提取与完善富含DHA的油的商业方法，已经由Zeller et al.提出，并且精制DHA的脂肪酸含量如表4.E所示。表4.E脂肪酸脂肪酸含量mg/g%12：020.214：0717.614：110.115：040.416：020522.116：140.418：050.518：170.818：250.518：3(n-6)30.318：430.320:010.120：4(n-6)91.020：4(n-3)91.020：5(n-3)212.322:010.122：5(n-6)15416.6

28、22：6(n-3)38040.924：020.224：120.2其他404.3提取富含DHA油脂的安全性之后扩大的具有代表性的是发现了发酵过程是有颜色的，以毒理学标准进行了一系列研究，验证了整个细胞及提取富含DHA油脂是安全的。在后面的第5章讨论了这些研究的结果与选择。这些研究包括：（1）致突变性研究；（2）13周的亚慢性大鼠培养研究；（3）大鼠与家兔发育毒性的评价；（4）单代鼠繁殖研究。小鼠的急性灌胃试验，还进行包括下蛋鸡、肉鸡与猪等动物安全性的研究。为所有安全测试的无毒副反应水平为最高食用油每项研究的水平测试。基于富含DHA油到实验动物的数量水平有：（1）一代大鼠的繁殖研究：8800mg

29、油/kg.d；（2）畸形鼠的研究：8400mg 油/kg.d；（3）13周大鼠喂养的研究：1600mg 油/kg.d；（4）下蛋鸡动物安全性试验，16周：1600mg 油/kg.d；（5）肉鸡目标动物安全性试验，7周：950mg 油/kg.d；这项安全研究的结果允许由食品安全专家委员会提出的GRAS的决心，以科学的训练经验，在家禽饲料中使用的全细胞生物量，以及提取的富含DHA油在食品中合格。随后在2004年，美国FDA并没有凡是对GRAS的测试，为了在食品中的裂殖壶菌的DHA油的安全使用。产品富含DHA的生物发酵过程这一评价已经应用到浓缩饲料中，并作为小鱼与虾的营养成分。它在许多国家也被用于家

30、禽饲料生产富含DHA的鸡蛋与禽肉，并已在欧洲用于从奶牛中生产富含DHA的牛奶。研究表明，富含DHA的生物质也可以用来喂猪，结果是没有任何肉的特点与感官性状。提取的富含DHA油往往作为补充胶囊来卖，并已用来作为营养酒，豆奶饮料，烘焙食品，包括面包、饼干、松饼等商业成分，而在乳制品中包括牛奶，酸奶，人造奶油与奶酪。裂殖壶菌产品的新的研究在这篇文章中描述的这项技术的成功已经影响到裂殖壶菌与破囊壶菌的进一步研究的商业潜力。这项研究主要集中在以下四个重点区域：（1）新菌株的隔离；（2）为改善DHA产品的文化认同的鉴定；（3）不同生产裂殖壶菌的发酵策略；（4）包括裂殖壶菌在内的破囊壶菌用来生产混合物与在各种处理回收的废物中的PUFA。关于新菌株的筛选研究主要集中在寻找不同的PUFA与PUFA介质的新品种，PUFA或脂质含量高的，并且改善其生产能力。关于从破囊壶菌中增加包含脂类提取的LCPUFA，研究主要集中在控制培养和细胞的处理及油的提取。Raghukumar et al.与Raghukumar&Jain 描述到一种方法，这种方法为增加EPA与DHA挑选破囊壶菌的含量，包括裂殖壶菌，在一个高粘度含量的培养基中培养。其他研究者