中药药理毒理研究技术规范若干问题的探讨

1、 中药药效毒理研究 技术规范若干问题的探讨北京中医药大学 中药学院 中药药理系 孙建宁 教授 o 中药药效评价的现状与探索 中药新药的基本要求是安全、有效、可控安全、有效、可控和稳定。稳定。 侯选样品侯选样品 - 药效学药效学 -侯选药物侯选药物 毒性研究毒性研究药效学研究的基本目的药效学研究的基本目的（一）通过药效学研究确定（一）通过药效学研究确定有效性有效性 是否有效、作用的强弱、优缺点和特色，确定有无开发前景。 重视前期药效的筛选，力求得到较准确的药效评价。设法找出主要药效学的特点、有效作用剂量范围（量效关系）、有效作用时间长短（时效关系）。（二）提高临床疗效二）提高临床疗效 应充分运用

2、现代科学特别是现代医学的理论、方法和手段，制定科学、严密、具有中医药特点的试验计划 ，建立与临床相符的 “病” “症”或“证”相似的动物模型与指标，对新药的有效性作出科学的评价。 o 药效研究参考资料:o1、中药新药研究指南（药学药理学 毒理学）中华人民共和国卫生部药政管理局，1994：66-67o2、中药新药研制开发技术与方法 王北婴、李仪奎主编 上海科学技术出版社2001.12o3、中药复方研究思路与方法 （2004年出版）o4、中药药理研究方法学 陈奇主编 人民卫生出版社（1993年版、新版待出）o5、中药药理方法学李仪奎主编 上海科学技术出版社 1991o6、国内外研究论文 二二.药效

3、学研究的基本要求药效学研究的基本要求 o 试验负责人试验负责人 o 受试药物受试药物 o 研究单位研究单位 o 实验动物实验动物 o 试验记录试验记录 o 统计处理统计处理 三、药效学研究的方法及注意事项三、药效学研究的方法及注意事项 o 1、实验设计、实验设计 符合中药特点；符合国家新药研究申报的有关规定；随机、对照、重复 重视中药复方配伍规律性的研究:o (1)单味研究法o (2)药对研究法o (3)药物组间关系法o (4)撤药分析法 (5)聚类分析法 (6)正交设计法 (7)正交t值法 (8)均匀设计法 (9)量效关系法o 撤药分析法: 从复方中撤出一味或一组药进行实验 黄芩汤:黄芩、芍

4、药、甘草、大枣 结果：减黄芩显著影响药效，分别减芍药、甘草、大枣变化不大。说明君药在全方中起主导地位。均匀设计法： 按均匀设计表安排，实验次数与各因素所取水平数相等。 如治疗感染复方（五种中药x1、x2、x3、x4、x5）。根据因素与水平，选用u11表设计，结果算得回归方程，有显著性意义，从标准相关系数可看出药物（抗炎）作用大小，进行优选。o 量效关系法： 四君子汤：党参、白术、茯苓、甘草 1 ： 1 ： 1 ：0.5 巨噬细胞吞噬功能增强，调整甘草到1/3，功能减弱。 当归补血汤: 黄芪、当归 5 ： 1 免疫增强作用，调整黄芪剂量（1/2、2、4倍）均作用不明显。o 2、动物选择、动物选择

5、 o 种类：实验常用小鼠和大鼠 、豚鼠 、家兔 、狗o 品系 o 动物等级：二级动物即清洁动物（cl）性别：一般试验选用雌雄各半动物。 o 数量：一般小鼠不得少于10只，大鼠为8只，猫、狗为4只以上 3、方法的选择方法的选择（一）根据主治，参考功能，选择试验方法 针对性强、重点突出、主次分明。 如缺血性中风: 1增加缺血区脑血流量 2神经细胞的保护治疗 o中药治疗缺血性中风主要药效学研究方案中药治疗缺血性中风主要药效学研究方案o（一）对脑缺血试验脑缺血试验 o 选用大鼠大脑中动脉血栓模型(middle cerebral artery thrombosis,mcat)和双侧颈总动脉阻断致不完全性

6、脑缺，观察连续给药2-3天对局部脑缺血和不完全性全脑缺血性损伤的保护作用。o (1) 大鼠神经症状检测：根据改进的 bedorson等人的分级打分法记分。 (2)对 mcat大鼠脑水肿的影响：分别称量脑缺血侧和非缺血侧脑组织湿重和干重，以脑水含量百分比为指标。 (3)药物对mcat大鼠脑梗塞范围的影响：采用ttc染色法，以梗塞组织重量占总脑重量的百分比为指标。 o (4)生化指标:包括能量代谢和毒性产物，如三磷酸腺苷（atpase）、磷酸肌酸（per）、乳酸（la）、乳酸脱氢酶（ldh）、自由脂肪酸（ffa）、脂质过氧化物（lpo）、兴奋性氨基酸（eaa）及基因表达等。o (5) 药物对模型大

7、鼠脑组织病理改变的影响：采用he染色和尼氏体染色法，以病理切片尼氏体数量和神经细胞形态为指标。o（二）血流动力学试验（二）血流动力学试验 采用麻醉犬进行试验，用电磁流量计测颈内动脉血流量，脑血管阻力、血压、心电图和心率，观察受试药物对脑血管及脑血流量的影响。o(三三)毛细血管通透性试验：毛细血管通透性试验：试验用大鼠，采用比色法观察药物对伊文思蓝等染料通透性的影响。o（四）（四）抗血栓形成试验和溶栓试验血栓形成试验和溶栓试验o（1）大鼠动-静脉旁路血栓形成试验：以血栓湿重和干重为指标。o（2）溶栓试验：o体外试验（血清药理） 新鲜血块溶解试验：指标为给药前、后血块重量并计算血块溶解百分率。o（

8、五）血小板聚集试验：（五）血小板聚集试验：实验用大鼠或家兔，观察受试药物对adp、胶原所致血小板聚集的抑制作用。o（六）（六）药物对血液凝固性的影响：凝血时间、凝血酶时间（tt）、凝血酶原时间（pt）和部分凝血活酶时间（aptt）。（二）采用能够反映中药特点的试验方法及动物模型o 抗病毒感染中药复方研究实验设计o 急性感染期用药o 1、对病原体的抑制作用o 2、对症治疗 退热作用 抗渗出抗炎作用 抗肺纤维化作用 抗多脏衰作用（1）感病毒所致小鼠肺炎的保护作用；选择流感病毒肺炎模型，以肺指数、死亡率、血清no含量为观察指标（2）抗高热作用o *对毒素所致家兔发热模型的退热作用o *酵母所致大鼠发

9、热模型的退热作用o（3）抗渗出、抗炎：选择油酸致呼吸窘迫症模型油观察所选药物对呼吸功能的影响。o（4）对吸入性肺炎的保护作用：选择内毒素吸入性肺炎损伤模型以balf中弹性蛋白酶、蛋白含量为观察指标o（5）抗炎作用：（急性炎症）o对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响（常规药理试验）o对角叉菜胶所致大鼠足肿胀的影响（常规药理试验）o（6）对内毒素所致大鼠多脏器衰竭的保护作用：选择内毒素或角叉菜胶多脏器损伤模型观察所选药物对重要脏器的保护作用。评价指标：生化指标（alt、ast、grea、bun ），脏器指数（心、肝、脾、肺、肾），血象测定（wbc及分类、rbc、plt、凝血时间）o 恢复期用药o 1、对过

10、量甲状腺激素所致阴虚模型的改善作用o 2、对过量皮质激素所致阴虚模型的改善作用o 3、对过量皮质激素所致消化道功能障碍的改善作用o 4、强壮作用：以耐缺氧时间、小鼠游泳时间为观察指标o 5、对免疫功能的影响（三）主要药效为主，配合辅助试验 治疗神经根型颈椎病治疗神经根型颈椎病 主要药效：1、对神经根无菌性炎症模型的影响 （1）一般行为学（步态、患肢运动等）、肌张力、感觉（触觉、痛觉）； （2）神经电生理检测：测定神经纤维的传导速度，观察药物的改善作用； （3）神经纤维轴索计数和再生率：观察药物对损伤神经的再生作用； （4）对致炎物重量的影响：观察药物对模型动物致炎物重量的抑制作用；（2）对模型

11、鼠脑组织内camp与cgmp的影响；（3）病理组织学检查：异物巨细胞反应、肉芽组织、炎性细胞等。 2、抗炎作用 3、镇痛作用o对血液流变学的影响o 采用血瘀大鼠模型，测定全血粘度、血浆粘度、红细胞压积、红细胞聚集性、红细胞变形性，观察药物对血液流变学的作用，初步分析该方治疗神经根性颈椎病的作用环节。（四）整体和离体方法选择 中药由于成分复杂，特别是复方粗制剂，为多种化学成分(或有效部位)的混合体，除有效成分外，尚有一些无关成分及干扰成分。因此，药效学试验应以体内试验为主，体外试验为辅；以消化道给药为主，其他给药途径为辅。 若为中药有效成分(或部位)制剂较纯者，或临床为注射给药者，可用体外试验或

12、注射给药进行主要药效学试验。 o 4 4、指标的选择、指标的选择o （一）特异性强 o （二）敏感性高 o （三）重现性好 o （四）客观性 o （五）定量指标 o （六）多指标综合运用 ：生理、生化、形态等各类指标合理搭配，综合运用 5、试验组给药剂量试验组给药剂量（一）根据半数致死量（一）根据半数致死量(ld(ld5050) )计算计算 凡是能够测出ld50者，可用其1/10、1/20、1/30、1/40等相近剂量，作为药效学试验的高中低剂量组。（二）根据临床用量计算（二）根据临床用量计算 其粗略的等效倍数为1（人）、3（狗、猴）、5（猫、兔）、7（大鼠、豚鼠）、1011（小鼠）（三）根据

13、文献估计剂量（三）根据文献估计剂量 （四）根据体表面积估计剂量（四）根据体表面积估计剂量 根据体表面积折算法换算的同等体表面积（m2、cm2）单位时的剂量 6、给药方式给药方式7、对照药的选择对照药的选择（一）阳性对照药（一）阳性对照药 1.可比性：其功用、主治、剂型、给药途径应与新药相似 2.合法性：阳性药应是国家中国药典或部颁标准，或新批准生产的合法药物 3.择优选用：学术界或社会公认有效的、有代表性的“好”药 （二）原剂型对照（二）原剂型对照 改剂型新药的阳性对照药 （三）空白对照品（三）空白对照品 四、随着科学技术发展涌现出中药复方药效研究的创新思路和方法 ：o（一）（一）建立中医药信

14、息系统，将大大建立中医药信息系统，将大大提高中药复方药效的研究效率提高中药复方药效的研究效率 中医药信息系统：方剂库、药用植物库、中药有效成分三维结构数据库及靶酶结构数据库 。 o （二）引入基因组学与蛋白质组学及基因芯片（二）引入基因组学与蛋白质组学及基因芯片技术技术 q 中药复方突出的特点是活性多组分、作用多靶点、多途径；突出多层次、多脏器、多水平调理过程。（复制证的动物模型）q 基因芯片对中药复方研究和中药药物筛选,指通过用药前后表达谱的变化,找出靶基因及受靶基因调控的基因 。q 培养的人细胞(细胞水平)和动物模型(整体水平)两种方法 相互参照和比较。 中药的毒性及安全性研究o 一、药物

15、毒理学的研究目的一、药物毒理学的研究目的 o 1、量化人体安全用药的剂量和时程：包括中毒剂量及其与有效剂量的比值、安全剂量范围、服药周期 o 2、毒性反应的表现和特点（急性毒性反应、慢性毒性反应、或蓄积性，毒性反应可逆与否等）、毒性的靶器官及作用机理 o 3、毒性成分的体内过程或毒代动力学研究 o 4、毒理学方法学的研究 o 5、毒性反应的预防、治疗 o 6、如何将动物毒理学数据外延或推论到人体： 啮齿和非啮齿两种动物进行毒理学试验，它们所表现出来的毒性反应和人体的毒性反应之间的一致性有约70%的概率；而单用啮齿动物所作的毒性试，其和人的一致性概率仅为43%；单用非啮齿动物的一致性概率为63%

16、 。 （1）一致性：94%的人体毒性反应可在给药和观察周期为一个月的动物试验中发现。多数人体毒性反应可在单次给药的毒性试验中发现。25%的人体毒性反应可在安全性药理学（一般药理学）实验中发现。 （2）不一致性：贯叶连翘对不同动物生殖系统的影响不一致。 二、中药毒理学研究内容 o 1、急性（单次给药）毒性试验o 2、长期（慢性或重复给药）毒性试验o 3、一般药理学（安全性药理学）试验o 4、“三致”试验（遗传毒性、生殖毒性、致癌性）o 5、免疫学毒性试验o 6、药物依赖性试验o 7、局部（皮肤/黏膜）给药的毒性试验o 8、注射剂的制剂安全性试验（局部刺激、过敏试验、溶血试验）o 9、毒代动力学研

17、究o 10、其它（光敏试验等） 三、毒性安全性评价中的注意事项 一般药理学试验研究 （安全性药理） （safety pharmacology）研究目的o 通过一般药理学研究，可以确定受试物非期望出现药物效应的情况，它可能关系到人的安全性；评价受试物在毒理学和/或临床研究中观察到的药物不良反应和/或病理生理作用；研究所观察到的和/或推测的药物不良反应机制。o 通过一般药理学研究，它可为长期毒性试验设计提供参考，为临床研究和安全用药提供信息，为开发新的适应症提供信息。o 一、受试物：o 建议受试物采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的中试样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、

18、保存条件及配制方法等。如不采用中试样品，应有充分的理由。如果由于给药容积或给药方法限制，可采用原料药（提取物）进行试验。 二、剂量设置二、剂量设置 中、高剂量应高于药效学的有效剂量，并与低剂量呈倍数关系 ，应设至少4个剂量组 三、试验指标的选择三、试验指标的选择（一）心血管系统（一）心血管系统测定并记录给药前后血压（包括测定并记录给药前后血压（包括收缩压、舒张压和平均压）、心电图（包括收缩压、舒张压和平均压）、心电图（包括qt间期、间期、pr间期、间期、qrs波、波、st段和段和qrs波等）和心率等的变化。治疗剂量出现明显波等）和心率等的变化。治疗剂量出现明显血压或心电图改变时，应进行相应整体

19、或离血压或心电图改变时，应进行相应整体或离体的进一步研究。体的进一步研究。 o （二）呼吸系统o 测定并记录给药前后的呼吸频率、节律和呼吸深度。治疗剂量出现明显的呼吸兴奋或抑制时，应进行相应整体或离体进一步研究。o （三）精神神经系统（三）精神神经系统 动物自主活动、平衡能力、与戊巴比妥钠的协同 。o 四、结果及分析o 应根据详细的试验记录，对结果进行定量和定性统计分析，说明具体的统计方法和选择理由，同时应注意对个体试验结果的评价。根据统计结果，分析受试物的一般药理作用，结合非临床药效学、毒理学及临床试验结果，综合分析这些药理作用所提示的临床意义。追加的安全药理学研究内容o 中枢神经系统：观察

20、药物对行为药理、学习记忆、神经生化、视觉、听觉和/或电生理等的影响o 心血管系统：观察药物对心输出量、心肌收缩作用、血管阻力等心血管功能的影响，并探讨其作用机制。o 呼吸系统：观察药物对气道阻力、肺动脉压力、血气分析、血液ph值等的影响。补充的安全药理学研究o泌尿系统：泌尿系统：观察药物对肾功能的影响，如对尿量、比重、渗透压、ph、电解质平衡、蛋白质，细胞和血生化（如尿素氮、肌酐、蛋白质）等指标的检测。o自主神经系统自主神经系统：观察药物对自主神经系统的影响，如与自主神经系统有关受体的结合，体内或体外对激动剂或拮抗剂的功能反应，对自主神经的直接刺激作用和对心血管反应、压力反射和心率的影响。o胃

21、肠系统胃肠系统：观察药物对胃肠系统的影响，如胃液分泌量和ph、胃肠损伤、胆汁分泌、体内转运时间、体外回肠收缩的测定。o其它器官系统：当出于对安全性的关注时，在其它有关研究中尚未研究药物对下列器官系统的影响，如潜在的依赖性、骨骼肌、免疫和内分泌功能等的影响，则应考虑药物对这方面的影响。o 三、其它相关问题三、其它相关问题 o （1）给药途径原则上应与临床拟用途径一致 o （2）监测的仪器设备o （3）麻醉状态o （4）监测的时间o （5）数据统计o 急性毒性试验 （acute toxicity testing） 是指在一日内一次或多次应用受试药物给予动物后，短期内所产生的毒性反应及死亡情况。 o

22、 一、受试物：o 建议受试物采用制备工艺稳定、符合临床试用质量标准规定的中试样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等。如不采用中试样品，应有充分的理由。o （一）动物 o 一般应选择与受试药物的药效学、药代动力学、长期毒性试验相关的动物；小鼠、大鼠，要求雌雄各半 o （二）给药途径、溶媒、体积 o （三）剂量和试验周期 o （四）观察指标及记录 o （五）试验方法 o 半数致死量（ld50）o 最大耐受量（maximum tolerated dose，mtd）试验 长期毒性试验研究 （chronic toxicity testing) 试验设计至关重要。试验设

23、计应作到科学、周到、合理 。o 一、试验动物 选用动物的生长敏感期阶段进行试验。即大鼠5-8周龄、体重80-100g左右，beagle犬4-12月龄 o 二、剂量设置 高剂量应使动物出现明显毒性或严重的毒性反应，或个别动物出现死亡；中剂量应使动物出现轻微的或中等程度的毒性反应。o 应注意的问题：（一）剂量设置较低，与药效学剂量间无安全范围（一）剂量设置较低，与药效学剂量间无安全范围（二）与药效学剂量的表示方法不一致（二）与药效学剂量的表示方法不一致 （1）参考急性毒性试验的ld50值：大鼠大、中、小三剂量一般为ld50值的1/10、1/50、1/100 （2）参考最大给药量 （3）参考拟用临床

24、剂量 （4）参考药动学试验结果 （5）据等效剂量推算 （6）据体表面积折算 o （三）样品提供和给药途径 o 一次性提供中试样品，要求与临床拟用途径一致 。o 三、预试验 易被忽略。实验全程耗时耗力，一般重复不起。用少量动物进行预实验很有必要，其中重点解决最大给药量的问题。四、给药周期长期毒性试验的给药周期 长期毒性试验的给药周期 临床疗程 长期毒性给药周期 啮齿类动物 非啮齿类动物o 1周 2周 2周 2周 1个月 1个月 1个月 3个月 3个月 3个月 6个月 6个月 3个月 6个月 9个月o 对于一些慢性病需长期反复应用的药物，长期毒性试验则要求根据临床实际用药的疗程，按照最长试验周期进

25、行试验，即观察大鼠给药6个月、犬给药9个月的长期毒性试验 o 五、指标选择 o 一般状态、血液学、血液生化学、尿常规、主要脏器的病理组织检查 o 1、血液学指标、血液学指标o 红细胞计数 血红蛋白o 红细胞容积 平均红细胞容积o 平均红细胞血红蛋白o 平均红细胞血红蛋白浓度o 网织红细胞计数o 白细胞计数及其分类o 血小板计数o 凝血时间o 骨髓涂片o 2、血液生化学指标、血液生化学指标 天门冬氨酸氨基转换酶 丙氨酸氨基转换酶 碱性磷酸酶 -谷氨酰转移酶 尿素氮、肌酐、总蛋白、白蛋白、血糖 总胆红素、总胆固醇、甘油三酯、 （钠离子浓度、钾离子浓度、氯离子浓度、肌酐磷酸激酶）3、非啮齿类动物尿液

26、分析指标：尿液外观、比重、ph值、尿糖、尿蛋白、尿胆红素、尿胆原、酮体、尿液沉渣的显观察o 4、长期毒性研究中需称重并计算脏器系数的器官： 脑、心脏、肝脏、肾脏、肾上腺、胸腺、脾脏、雄性动物睾丸、雄性动物附睾、雌性动物卵巢、雌性动物子宫o 5、啮齿类动物需进行病理组织学检查的组织：脑（大脑、小脑、脑干）、脊髓（颈、胸、腰段）、垂体、胸腺、甲状腺、甲状旁腺、食管、唾液腺、胃、小肠和大肠、肝脏、胰腺、肾脏、肾上腺、脾脏、心脏、气管、肺、主动脉、雄性动物睾丸、雄性动物附睾、雌性动物子宫、雌性动物卵巢、雌性动物乳腺、雄性动物前列腺、膀胱、坐骨神经、骨髓、给药局部、淋巴结（包括给药局部淋巴结、肠系膜淋巴

27、结）o 6、非啮齿类动物需进行病理组织学检查的组织： 脑（大脑、小脑、脑干）、脊髓（颈、胸、腰段）、垂体、胸腺、甲状腺、甲状旁腺、食管、唾液腺、胃、小肠和大肠、肝脏、胆囊、肾脏、肾上腺、脾脏、胰腺、气管、肺、主动脉、心脏、雄性动物附睾、雄性动物睾丸、雌性动物卵巢、雌性动物子宫、雄性动物前列腺、雌性动物乳腺、坐骨神经、膀胱、视神经、给药局部、骨髓、淋巴结（包括给药局部淋巴结、肠系膜淋巴结）o 六、六、恢复期恢复期 o 了解毒性反应的可逆程度和可能出现的迟发性反应 o 停药后2-6周。o 某些检查指标出现异常，可将恢复期相应延长o 七、结果的判断七、结果的判断o 应事实求是地科学地分析结果，报告毒性反应出现和恢复的时间，分析有无蓄积的情况 o 没有统计学意义，不等于没有生理学意义，有统计学意义也不等于有生物学意义 o 要有本实验室的背景资料中药的特殊毒理学研究 包括致突变性、致癌性、生殖毒性、致敏性、依赖性。 其他毒性研究o 一