不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳课件

1、不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳1不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳2不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳3不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳4实验分组（每人做一管，每组配一份胶）实验分组（每人做一管，每组配一份胶）认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）认清试剂（试剂和吸管对号、量器的使用）封管封管分离胶配制与灌胶（浓度为分离胶配制与灌胶（浓度为6%，化学聚合，每组总体积为，化学聚合，每组总体积为10ml，灌胶高度为，灌胶高度为78cm）封正丁醇封正丁醇3mm（手法、高度、观察界面变化和判断凝固、时（手法、高度、观察界面变化和判断凝固、时间掌握间掌握25min）不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳5不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳6不连续聚丙烯酰胺凝胶

2、电泳7不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳8不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳9不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳10不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳11不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳12不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳13不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳14不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳15原原 理理聚丙烯酰胺凝胶是由单体聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺丙烯酰胺(acrylamide(acrylamide，简称，简称acr)acr)和交联剂和交联剂n,n-n,n-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(n(n，nmethylene-nmethylene-bisacylamidebisacylamide，简称，简称bis)bis)在加速剂在加速剂n n，n n，n n ，

3、n n 四甲基乙二四甲基乙二胺胺(n(n，n n，n n ，n n tetramethyl ethylenedia minetetramethyl ethylenedia mine，简称，简称temedtemed) )和催化剂和催化剂过硫酸铵过硫酸铵(ammonium persulfate (nh(ammonium persulfate (nh4 4) )2 2s s2 2o o8 8，简称简称ap)ap)或或核黄素核黄素(ribofavin(ribofavin即即vita min bvita min b2 2，c c1717h h2020o o6 6n n4 4) )的作的作用下聚合交联成三

4、维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel (polyacrylamide gel electrophoresiselectrophoresis，简称，简称page)page)。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳16聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；(3)对ph和温度变化较稳定；(4)几乎无吸附和电渗作用，只要acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；(5)样品

5、不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳17凝胶浓度(t)的选择与被分离物质分子量密切相关。 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 蛋 白 质 104 20-30 1-4104 15-20 1-5104-1105 10-15 1105 5-10 5105 2-5 核酸(rna) 104 1520 104105 5-10 1

6、05-2106 2-2.6不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳18 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。 目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳19不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳20不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳21不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳22不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳23蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的

7、大移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，年，shapiro等发现阴离子去污剂等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（sds）具有这种作用。）具有这种作用。当向蛋白质溶液中加入足够量当向蛋白质溶液中加入足够量sds和巯基乙和巯基乙醇，巯基乙醇，巯基乙醇可使蛋白质分醇可使蛋白质分子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白子中的二硫键还原。由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质质sds复复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分

8、子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，sds与蛋白质结合后，还可与蛋白质结合后，还可引起构象改引起构象改变，蛋白质变，蛋白质sds复合物形成近似复合物形成近似“雪茄烟雪茄烟”形的长椭圆棒，形的长椭圆棒，不同蛋白质的不同蛋白质的sds复合物复合物的短轴长度都不一样，约为的短轴长度都不一样，约为18a，这样的蛋白，这样的蛋白质质sds复合物，在凝胶中的迁移率，不复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原来的电荷和形状的再受蛋白质原来的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，因而影响，而取决于分子量的大小，因而sds聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测聚

9、丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。定蛋白质的分子量。sds-page不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳24不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳25不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳26gly-pro-cl-gly-pro-cl-cl-cl-cl-pro-pro-pro-gly-gly-gly-不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳27 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由ap催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为ph6.7的tris-hc1。分离胶是由ap催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为ph8.9 tris-hc1。电极缓冲液是ph8.3 tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种ph值使不连续体系形成了凝胶孔径、ph值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳28样品浓缩效应(1)凝胶孔径不连续性：(2)缓冲体系离子成分及ph值的不连续性； 在ph6.7的凝胶缓冲体系中 前导离子或快离子：hc1解离出的氯根(c1-) 尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根(甘氨酸等电点：5.97) mclclmppmgg(cl代表氯根，p代表蛋白质，g代表甘氨酸根)