常 用 实 验 方 法

1、常 用 实 验 方 法实验设计一、实验设计的意义实验设计是科学研究计划内关于研究方法与步骤的一项内容。在医学科研工作中，无论实验室研究、临床疗效观察或现场调查，在制订研究计划时，都应根据实验的目的和条例，结合统计学的要求，针对实验的全过程，认真考虑实验设计问题。一个周密而完善的实验设计，能合理地安排各种实验因素，严格地控制实验误差，从而用较少的人力、物力和时间，最大限度地获得丰富而可靠的资料。反之，如果实验设计存在着缺点，就可能造成不应有的浪费，且足以减损研究结果的价值。总之，实验设计是实验过程的依据，是实验数据处理的前提，也是提高科研成果质量的一个重要保证。众所周知，科研工作者在进行医药方面

2、的科学研究之前，需要制定完善的统计研究设计方案，那么什么样的设计方案才称得上是完善的呢？一般来说，完善的设计方案需具备以下几个条件：实验所需的人力、物力和时间资源；实验设计的“三要素”和“六原则”均符合专业和统计学要求，对实验数据的收集、整理、分析等有一套规范的规定和正确的方法。而其中准确把握统计研究设计的“三要素和六原则”，是科学实验设计的核心。二、实验设计的“三要素” 1实验对象：实验所用的材料即为实验对象。如用小鼠做实验，小鼠就是本次实验的实验对象，或称为受试对象。实验对象选择的合适与否直接关系到实验实施的难度，以及别人对实验新颖性和创新性的评价。一个完整的实验设计中所需实验材料的总数称

3、为样本含量。最好根据特定的设计类型估计出较合适的样本含量。样本过大或过小都有弊端。    2实验因素：所有影响实验结果的条件都称为影响因素，实验研究的目的不同，对实验的要求也不同。影响因素有客观与主观，主要与次要因素之分。研究者希望通过研究设计进行有计划的安排，从而能够科学地考察其作用大小的因素称为实验因素（如药物的种类、剂量、浓度、作用时间等）；对评价实验因素作用大小有一定干扰性且研究者并不想考察的因素称为区组因素或称重要的非实验因素（如动物的窝别、体重等）；其他未加控制的许多因素的综合作用统称为实验误差。最好通过一些预实验，初步筛选实验因素并确定取哪些水平较合

4、适，以免实验设计过于复杂，实验难以完成。    3实验效应：实验因素取不同水平时在实验单位上所产生的反应称为实验效应。实验效应是反映实验因素作用强弱的标志，它必须通过具体的指标来体现。要结合专业知识，尽可能多地选用客观性强的指标，在仪器和试剂允许的条件下，应尽可能多选用特异性强、灵敏度高、准确可靠的客观指标。对一些半客观（比如读pH试纸上的数值）或主观指标（对一些定性指标的判断上），一定要事先规定读取数值的严格标准，只有这样才能准确地分析自己的实验结果，从而也大大提高了自己实验结果的可信度。三、实验设计的“六原则” 1. 随机原则：即运用“随机数字表”实现随机化；

5、运用“随机排列表”实现随机化；运用计算机产生“伪随机数”实现随机化。尽量运用统计学知识来设计自己的实验，减少外在因素和人为因素的干扰。2. 对照原则：空白对照组的设立只有通过对照的设立我们才能清楚地看出实验因素在当中所起的作用。当某些处理本身夹杂着重要的非处理因素时，还需设立仅含该非处理因素的实验组为实验对照组；历史或中外对照组的设立一一这种对照形式应慎用，其对比的结果仅供参考，不能作为推理的依据；多种对照形式同时并存。3. 重复原则：所谓重复原则，就是在相同实验条件下必须做多次独立重复实验。一般认为重复5次以上的实验才具有较高的可信度。 4. 平衡原则：一个实验设计方案的均衡性好坏

6、，关系到实验研究的成败。应充分发挥具有各种知识结构和背景的人的作用，群策群力，方可有效地提高实验设计方案的均衡性。在实验设计的过程中要注意时间上的分配，只有在时间上分配好了，才不会出现一段时间特别忙而一段时间特别闲的情况。5. 弹性原则：所谓空格，指的是在时间分配图上留有空缺。适当的空缺是非常必要的，只有这样才能富有弹性的实施实验计划，并不断地调整好自己的实验进度。6. 最经济原则：不论什么实验，都有它的最优选择方案，这包括在资金的使用上，也包括人力时间的损耗上，必要时可以预测一下自己实验的产出和投入的比值，这个比值越大越好，当然是以你所拥有的实验条件作基础的。组织切片的制备【目的】组织标本必

7、须首先被制成组织切片，再经过染色处理，然后才能在显微镜下进行临床诊断和科学研究。【原理】苏木素染色结合伊红染色是常规组织学染色技术，也称为H & E染色。苏木素是碱性染色，细胞核被染成深紫或兰色，常用作核染色；伊红是酸性染色，细胞浆染呈红色，常用作胞浆染色。【材料】1.试剂和溶液（1）2-甲基丁醇(异戊醇)（2）干冰（3）O.C.T.(Tissue-Tek, SAKURA)（4）冰冻或石蜡组织块（5）酸性Harris 苏木素染料（6）1酸性酒精70酒精 99 ml浓盐酸 1 ml（7）醇溶性伊红染料（8）酒精（9）二甲苯（10）树脂封片液2.设备（1）塑料模具（2）长镊子（3）Supe

8、rfrost Plus玻片(Fisher Scientific)（4）盖玻片（5）刀片(一次性或非 一次性)；（6）冰冻或石蜡切片机(Leica , Micorm 或其它)【方法】方法1、冰冻切片的制备一、准备冰冻组织1. 用塑料或不锈钢容器盛上2-甲基丁醇(异戊醇)，然后不时放入小块干冰，使温度降至-40ºC到-50ºC,并保持低温。2. 标记塑料模具并将O.C.T灌入模具，覆盖其底部。3. 收集组织标本。快速，轻柔和准确地取材以保证组织标本的质量，是获得高质量免疫标记染色的最基本条件。4. 将取下的组织标本置入灌有O.C.T 的模具，用O.C.T 灌满模具，直至标本完全

9、被其覆盖。组织标本应尽量贴近模具底部，使标本在切片时易于暴露。酌情调整组织标本的位置。用长镊子挟住模具，放入冷却了的2-甲基丁醇(异戊醇)溶液中。为了避免产生空泡，先将模具底部触及溶液，盛有标本的模具从底部开始向表面冷冻，然后将整个模具放入溶液中5-10分钟。（1）多数取下的组织标本可以直接放入模具。如标本沾有大量液体，应当用吸水性能好的纸沾去多余的液体，然后冷冻包埋。不要用溶液清洗标本。（2）需要先固定处理的组织标本，可以在完成固定后，用10到30蔗糖-缓冲液处理，再冷冻包埋。5. 将冻好的组织标本保存在-80ºC 冰箱以待使用。二、制作冰冻切片1. 切片前先将冰冻组织标本从-80

10、ºC冰箱里取出，放在冰冻切片机(-20ºC) 内复温。2. 用O.C.T.将冰冻组织块冻在冰冻标本盘上，然后将其固定在切片机上。调整好组织块平面与刀片的位置后，开始切片。直至切到预想的部位后，开始收集切片。根据研究目的的不同，切片可选择不同的厚度。3-6 µm是常用的切片厚度，也可以是25-50 µm厚。3.切片在室温下晾干，然后用理想的固定液固定。如果选用冷丙酮或丙酮/甲醇，切片在经过20 分钟固定，并在室温下晾干后，可以直接用于染色，或者将其放在密封的切片盒并存入-80ºC冰箱，以待使用。4. 余下的冰冻组织块，可用O.C.T.覆盖其暴露面

11、，然后存入-80ºC冰箱以待下次使用。方法2、石蜡切片的制备1收集组织标本并将其固定。10福尔马林缓冲液是最常用固定液，也可根据实验的需要选用其它固定液。根据标本的大小，将其在室温下固定8-24小时，或更长。标本的厚度以不超过3 mm 最佳。完成固定后，标本即可进行下一步的处理。2制作石蜡组织块需要专用的设备，以及复杂的组织处理过程。通常由组织学或病理学实验室完成。3石蜡切片。准备好盛有40ºC蒸馏水的水浴箱，把包有组织的石蜡块固定在石蜡切片机上，根据需要切成一定的厚度(常用4-6 m)，将切片浮在水浴箱的水面上，再转到Superfrost Plus片子上。切片在室温下自然

12、风干过夜，贮存待用。苏木素-伊红（HE）染色苏木素-伊红染色即通常所说的普通染色或常规染色，又称H.E染色。是目前应用最广泛的染色方法。在病理诊断、教学和科研中具有重要的价值。适合于各种固定、包埋方法制作的石蜡切片以及冰冻切片等。且切片不易褪色，可以长期保存。HE染色主用于显示各种组织的正常成份和病变的一般形态结构，各种组织或细胞的一般形态、结构特点和病变的发生、发展及修复的全过程，在质量较佳的HE染色切片上，基本上都可以观察到，从而进行判定或研究。【实验步骤】1. 二甲苯脱蜡3-5分钟。×22. 95%酒精3-5分钟。×23. 水洗。4. 苏木素3-15分钟。根据所配制的

13、苏木素染液决定。5. 水洗。6. 分化。7. 流水冲洗或弱碱性溶液返兰。8. 伊红3-15分钟。根据所配制的伊红染液决定。9. 95%酒精脱水1-2分钟。×210. 无水酒精脱水1-2分钟。×211. 二甲苯透明1-2分钟。×212. 中性树胶封固。免疫组织化学染色方法（S-P法）免疫细胞化学（immunocytochemistry）是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子相结合的小分子；抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的球蛋白。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该

14、抗原存在于组织中的部位。常用的标记物有荧光素和酶。荧光素标记的称为免疫荧光法（immunofluorescent technique），常用的萤光素有异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate）、罗丹明（rhodamine）等。酶标记的称为酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method），常用的酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase），酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。抗体与抗原的结合方法可分为直接法和间接法两种，直接法是将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位。而间接法则是在抗

15、体抗原初级反应的基础上，再用带标记的次级抗体同初级抗体反应，从而使初级反应得到放大，显示增强。【实验步骤】1、石蜡切片4-5m；2、切片脱蜡至水；3、3%甲醇双氧水阻断室温10分钟；4、 0.01M(PH 7.2)磷酸盐缓冲液（PBS）洗5分钟´3次；抗原修复，加入0.01M（PH 6.0）柠檬酸缓冲液置微波炉中10档3分30秒，之后可进行2档1分至1分30秒微波维持。5、自然冷却后PBS洗，加二抗同种动物非免疫血清封闭，室温10分钟；6、免洗，倾出血清，分别滴加配制好的一抗4过夜；7、PBS洗5分钟 ´ 3次；8、滴加生物素标记的第二抗体，室温孵育10分钟；9、PBS洗5

16、分钟 ´ 3次；10、滴加链亲和素-过氧化物酶，室温10分钟；11、PBS洗5分钟 ´ 3次；12、新鲜配制的DAB溶液显色3-10分钟；13、自来水洗，苏木素浅染细胞核，分化。自来水冲洗返兰，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。细胞培养一、操作规程：1.实验前,无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30-60分钟灭菌,用70酒精擦拭无菌操作台面,并开启无菌操作台风机运转10分钟后,才可开始实验操作.每次操作只处理一株细胞,以免造成细胞交叉污染.实验结束后,将实验物品带出工作台。如需要继续进行下一个实验,则用70酒精擦拭无菌操作台面,再让无菌操作台风机运转10分钟后,才可进行下

17、一个实验操作。2.无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞,必要物品,如试管架,移液器或吸管头等可以暂时放置,其它实验用品用完后应及时移出,以利气体流通.实验用品要用70酒精擦拭后才能带入无菌操作台内。实验操作应在操作台中央无菌区域内进行,勿在边缘非无菌区域操作。3.小心取出无菌实验用品,避免造成污染。切勿碰触吸管与吸头头部或容器瓶口,不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后,用手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45°角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。4.工作人员应注意自身的安全,必须穿戴实验衣与手套后才进行实验。对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心,并选择适当等级的无菌操作台(至少

18、两级)。操作过程中,应避免引起气溶胶的产生,小心有毒性试剂,例如DMSO及TPA等,并避免尖锐物品伤人等。5.定期检查下列项目：CO2钢瓶内的CO2压力；CO2培养箱内的CO2浓度,温度,及水盘是否有污染；无菌操作台内气流压力是否正常,定期更换紫外灯管及HEPA过滤器滤膜,预滤网（300小时/预滤网,3000小/HEPA)。二、粉末细胞培养基的配制(以1 升为例)： 细胞培养基通常须添加10血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH 为 7.2 - 7.4。NaHCO3另外添加，若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成 pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉

19、末应分别溶解后才混合，然后用CO2 气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。【试剂与设备】1. 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要) 2. 粉末培养基 （1640、DMEM等）3. NaHCO3 (Sigma S-4019) 4. 电磁搅拌器 5. 无菌血清瓶 6. 0.22 微米无菌过滤膜 7. pH meter 8. 真空瓣9. CO2 气体 【配制步骤】 1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解。 2. 称取适量之NaHCO3粉末(数量依培养基种类而异)溶

20、于200ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2气体至饱和，约3-5 分钟。 3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH 应为7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2 气体调整pH。培养基以真空帮助通过过滤膜时，pH 会升高0.1-0.2。 4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4 (血清亦可加入培养基中一起过滤)。 5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。 【注意事项】1. 液体培养基贮存于4 冰箱，避免光

21、照，实验进行前放在37水槽中温热。2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。PCR（聚合酶链式反应）【原理】PCR（polymerase chain reaction）用于在体外将微量的目标DNA大量扩增，以便进行分析。反应体系：样品DNA；引物（primer），是人工合成的一对寡核苷酸链（约15-20个核苷酸），用于扩增夹在双引物与模板DNA互补区之间的区域；4种dNTP；Tag DNA聚合酶，是从一种嗜热水生菌（Thermus aquaticus）中分离出来的。此酶最适作用温度为7580，但短时间在95

22、下不失活。适宜的缓冲体系和适量的Mg2+。反应过程：变性：将反应液置于PCR仪中，提高温度（约90-95）使DNA双链解离；复性：降温（约60左右）退火，使引物与模板结合；延伸：升温度至70-75，在引物的引导下合成模板单链的互补链，从而形成DNA双链片段；重复上述“变性复性延伸”的过程。最初几次循环中形成的长链DNA较多，但随着反应的进行，长链DNA以算术级数增加，而夹在两个引物之间的目标DNA以指数级数增长，经大约2030次循环后，扩增产物中主要是目标DNA。【材料】1. 试剂和溶液 （1）10 × PCR缓冲液500 mM 氯化钾100 mM Tris-Cl (室温时

23、pH 8.3)15 mM 氯化镁（2）10 mM脱氧三磷酸核苷(dNTPs) 溶液含有所有四种dNTPs(pH 8.0)（3）耐热的DNA 聚合酶： Taq DNA 聚合酶是从表达克隆嗜热水生菌的DNA 聚合酶基因的大肠杆菌提纯而来。此酶有53 DNA聚合酶和53外切酶活性，但是缺乏35 外切酶活性。此酶由分子量约为94 千道尔顿的多肽组成。Taq DNA聚合酶对热稳定，能在较高的温度下利用引物将单链模板合成为DNA。 催化一典型的PCR所需酶量约为2单位。加酶量过多则有可能导致非靶序列的扩增。Taq DNA 聚合酶缺乏校正功能，在PCR过程中核苷酸掺入错误率可达每循环2 × 10-

24、4个核苷酸，约比使用大肠杆菌DNA聚合酶 I 的Klenow片段时高4倍。对于一个30轮循环的扩增反应来说，这一掺入错误率将导致0.25的总错误频率。这一频率似随和浓度的升高而增大。这些错误的掺入可以发生在扩增产物的任何位置，既有颠换也有转换（但并无长的缺失、嵌合或插入）。单位的定义：一单位是指于74ºC将l0 nmol的脱氧核糖核苷酸30分钟内掺入到酸性沉淀的物质中。其实验条件是：25 mM TAPS (pH9.3), 50 mM 氯化钾, 2 mM 氯化镁, 1 mM DTT, 0.5 mg/ml 有活性的鲑鱼精液DNA, 0.2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTT

25、P。 rTth DNA聚合酶是Thermus thermophilus(Tth)和Thermococcus litoralis(Tli)两种菌中耐热DNA聚合酶的混合。这种混合酶特别具有53DNA 聚合酶和35外切酶（校正）的双重活性。当按推荐量使用时，此酶可提高保真度及长链PCR的产量。常规PCR扩增靶DNA序列一般在5 kb以内。而rTth DNA 聚合酶可从人类基因组DNA中扩增至19.6 kb的球蛋白基因群和噬菌体DNA的42 kb的片段。 （4）琼脂糖凝胶（5）10 µM的上游和下游引物（6）DNA模板（7）对照DNA（含有靶序列的DNA）（8）DNA长度标准参照物2. 设

26、备（1）0.2 ml PCR扩增管（2）可预先设定扩增方案的温度循环器(PCR仪)【方法】方法一、基本的PCR方法下面介绍的基本PCR方法可作为任何PCR扩增的一般指导和出发点。由于各种PCR反应条件（如PCR扩增次数、温度、Taq DNA聚合酶的浓度、引物、氯化镁以及模板DNA）变异极大，应根据具体情况，对各种PCR反应条件进行相应调整。1按以下次序，将各成分加入0.2 ml灭菌扩增管中：成分 体积 终浓度10 × PCR缓冲液 5 µl 1 ×10 mM dNTP溶液(pH 8.0) 1 µl 每种0.2 mM10 µM 上游引物 2.5

27、µl 0.5 µM10 µM 下游引物 2.5 µl 0.5 µM5单位/µl 耐热DNA聚合酶 0.5 µl 2.5单位DNA模板 1-10 µl 1 pg-1µg消毒的蒸馏水 至50 µl * 我们主张，对于多管反应可配制混合液于一管中，然后分装至各管，以减少试剂损失和各管分别加样的不准确性。2将小管中的混合物混匀，并加入50 µl矿物油或硅化油覆盖小管中的混合物。3盖紧小管，短暂离心，以使PCR混合物沉于管底。4小管在温度循环器（PCR仪）中94ºC温育3分钟，以使模板

28、DNA完全变性。5. 按以下方法进行25-35个循环的PCR扩增：变性 94ºC 30秒 退火 55ºC 30秒延伸 72ºC 1分钟/1 kb672ºC温育PCR样本10分钟，可于4ºC维持。样本可贮存于-20ºC直至使用。7采用琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应产物，溴化乙锭染色显影DNA，用合适分子量标准的DNA作参照。方法二、热启动方法热启动PCR的方法是在反应温度降至80ºC时添加Taq DNA聚合酶，以保证高特异性PCR产物的合成。1如基本的PCR方法所述，添加所有的PCR反应的混合物，但不加Taq DNA 聚合酶。2

29、将小管中的混合物混匀，并加入50 µl矿物油或硅化油覆盖之。3盖紧小管，短暂离心，以便于PCR混合物沉于管底。4小管在PCR仪中94ºC温育3分钟，以使模板DNA完全变性。5. 94ºC温育后，维持PCR反应在80ºC。6每一PCR反应管添加0.5 µl (2.5 U)的 Taq DNA 聚合酶，注意应保证酶加入到油下面的PCR混合物中。7按照基本的PCR方法所述，继续完成25-35个循环的变性、退火和延伸。【注意事项】1. PCR引物设计：引物设计可能是PCR扩增成功最关键的因素。如引物设计欠佳，可能导致扩增产物不足，甚至扩增失败，其原因是设

30、计欠佳的引物可导致非特异扩增和/或形成引物二聚体，此又成为PCR反应的竞争性产物，从而进一步抑制PCR产物形成。在引物设计时必须考虑以下几个因素，其中最重要的是引物长度、溶解温度(Tm)、特异性、引物序列互补问题、G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸、3-末端序列等。 （1）引物长度：由于PCR反应的特异性、退火温度以及时间均至少部分与PCR引物长度相关联，因此引物长度是PCR扩增是否成功关键的因素。一般PCR引物长度为15-30核苷酸。（2）溶解温度(Tm)：因加热而断开H键，使双链DNA分开或“溶解”为单链DNA。溶解温度(Tm)即指使一半双链DNA变为单链DNA的温度

31、。Tm可采用下列公式计算：Tm2(A+T) + 4(G+C)。需注意PCR反应至少有两个（一对）引物，两个寡核苷酸引物Tm 值应比较接近，不可差异过大。因有较高的Tm值的引物在较低的反应温度时可发生错配，而引物Tm值较低，反应温度较高时则可能不能发生作用，因此如引物的Tm值差异较大，可导致PCR扩增效率低下甚至扩增失败。（3）引物序列互补：设计引物时应绝对没有3个碱基以上的内引物配对，如引物有这样具有自我配对的区域，“弹回”即部分双链结构将发生在退火反应时。（4）G/C 含量和多嘧啶(T,C) 或多嘌呤(A, G)延伸：待选择的引物序列应尽可能是碱基随意分布，G+C含量平均-避免长A+T和富含

32、G+C的区域。在引物的碱基组成中GC含量一般为45-55。在选择的引物序列中应没有多G 或多C延伸，因其可促进非特异性退火，多A 和多T延伸也应避免，因其可“呼吸”和使引物模板复合物展开延伸，降低扩增的效率。同时多嘧啶(T,C)和多嘌呤(A,G)延伸也应被避免。 （5）3-末端序列：为控制引物错配，应认真地确定PCR引物中3末端的位置。总而言之，应重视PCR引物设计，设计PCR引物时应认真小心。对于一个成功的PCR来说，几个重要因素如引物长度、GC含量和3序列必须优化。理想的引物应为差不多随意分布的核苷酸混合、GC含量50、长度约为20个碱基，因此能使Tm值处于56-62ºC范围。分

33、析靶基因潜在引物位点时，应考虑无单聚合体, 没有明显的二级结构形成的倾向，不自我互补，与其他双链靶基因序列没有明显的同源性。为避免枯燥无味的设计，节省时间，减少错误，可应用计算机程序优化设计、选择、确定寡核苷酸引物。最常用的引物设计软件和网站是：/cgi-bin/primer/ primer3_www.cgi2. 模板DNA：溶解模板DNA于含有低浓度的EDTA（<0.1 mM）的10mM Tris-Cl（pH 7.6）中。DNA的浓度分别为：哺乳动物基因组（100 µg/ml），酵母基因组DNA（1 µg/ml）

34、，细菌基因组DNA（0.1 µg/ml），质粒DNA（1-5 µg/ml）。3. 防止污染：由于PCR能够使单个DNA分子得以扩增，所以应当注意防止反应体系被痕量DNA模板污染，尤其是在待扩增靶序列浓度低的情况下，更有必要采取防备措施。（1）如有可能，应在装有紫外灯的层流式工作台内吸加PCR试剂和进行反应。凡不用工作台时应打开紫外灯。应使工作台内始终置有PCR专用的微量离心机、一次性手套、整套移液器和其他必需品。由于自动移液器的管部是常见的污染源，因此配液和移液时应当使用配有一次性吸头和活塞的正向排液式移液器。准备一套特殊的试剂和溶液专用于PCR。所有的玻璃器皿于150&#

35、186;C下烘烤6小时，所有塑料器皿、缓冲液、吸头和离心管使用前必须经过高压处理。（2）一旦进入吸加PCR试剂的专用场所并开始工作，就应戴上一副新手套，并应勤于更换。（3）准备专供自己使用的成套试剂，分装为小份，而且最好在靠近工作台的冰箱中设立专门位置来保存。这些试剂不得用于其他用途。配制这些试剂时，要用从未接触过实验室内所用任何DNA的新玻璃用具、塑料用具和移液器。使用后便将这一小份全部废弃，不得重新置存。（4）装有PCR试剂的微量离心管打开之前，应先在专用工作台内的微量离心机上作瞬时离心（10秒）。这样可使液体沉积于管底，从而减少污染手套或加样器的机会。（5）最好在加完所有的其他反应成份、

36、包括防止蒸发用的矿物油后才吸加模板DNA。将模板加入微量离心管后，盖好离心管并用戴有手套的手指轻轻弹击管侧壁，以混匀液体。再作瞬时离心（10秒），使水相和有机相分开。（6）将模板DNA加入PCR系统时，注意切勿形成喷雾，后者有可能污染别的反应。所有并非即用管均应盖严。拿过模板DNA管后应更换手套。 （7）每一次PCR必须包含阳性和阴性对照。阳性对照用于监测PCR反应的效率，而阴性对照用于确定是否存在DNA靶序列的污染。（8）只要有可能，就应当设置阳性对照反应（即由少量适当的靶序列参与的PCR）。对靶序列DNA所作的适当稀释工作应于实验前在实验室内别的位置进行，这样可防止将靶DNA的浓溶液带到实

37、验室专门进行PCR的位置。（9）必须设置一个不含模板DNA，但含有PCR系统中所有的其他成份的对照反应，这一对照管须在准备好其他所有PCR以后才进行吸加。4我们上面介绍的只是一种基本的PCR反应条件，对于具体的每一种PCR反应，反应条件差异很大，需要根据情况调整。（1）时间：上面介绍的时间适用于在0.2 ml薄壁管进行PCR反应，其反应体积为50 µl，热循环仪为Perkin-Elmer 9600 或9700、Master Cycler PCR仪（Eppendorf公司）和PTC 100（MJ Research公司）。如PCR的设备和反应体积发生改变，则时间和温度均需要调整。每一步的

38、时间应从反应混合物达到所需要的温度后开始计算。一般来说，由混合液原温度达到所要求温度的时间需要30-60秒。温度滞后时间的长短取决于以下几个因素，包括反应管的类型、反应混合物的体积、热源（水浴或加热块）以及两个连续步骤间的温度差。因此调节温育时间以补偿这一滞后时间是非常重要的。两寡核苷酸引物之间的距离越远，合成靶序列全长所需的时间也越长。上面给出的反应时间是按1000个核苷酸的靶序列拟定的。（2）温度：选择寡核苷酸引物到DNA模板的退火温度是一个折衷的方案。如果降低退火温度则扩增效率提高，但引物与模板间的错配现象又可明显增加。若将温度提高，则扩增反应的特异性增加，但总的反应效率则会下降。因此理

39、想的办法是设置一系列对照反应，以确定某一特定扩增反应的最适退火温度。（3）循环次数：扩增反应的循环数取决于反应混合液中靶DNA的浓度，若将哺乳动物基因组中单拷贝基因扩增至能为琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳所见，至少需要25个循环。靶序列的指数式的扩增不是一个无限制的过程。在正常反应条件下，经过25-30个循环扩增（即扩增约106倍）后，Taq DNA聚合酶的酶量便成为制约反应进行的因素。如需进一步扩增，应将所得的DNA样品稀释1000至10000倍后，再作为模板进行新的PCR。（4）缓冲液：当标准缓冲液于72ºC温育时，反应体系的pH值将下降1个多单位，致使缓冲液的pH值接近7.2。二价

40、阳离子的存在至关紧要，镁离子优于锰离子，而钙离子则无效。镁离子的最佳作用浓度相当低(1.5 mM)，因此重要的是，所制备的模板DNA中不应含有高浓度的螯合剂，如EDTA；也不应含有高浓度的带负电荷离子基团，如磷酸根。所以，用作模板的DNA应溶于10 mM Tris-Cl (pH 7.6), 0.1 mM EDTA (pH 8.0)中。在较为广泛的范围内，这种标准缓冲液对于各种模板的寡核苷酸引物都能行之有效，当它并非对于模板与引物的任何一种特定组合都是最佳的。因此，应当将以上所列条件作为出发点进行修饰和改良。每当首次使用靶序列和引物的一种新组合时，或者，dNTPs或引物的浓度变化时，特别要将Mg

41、2+浓度调至最佳。dNTPs是反应中磷酸根的主要来源，其浓度的任何变化都将影响到Mg2+的有效浓度。我们建议设置一组反应，其中每一反应的Tris-Cl (10 mM)和氯化钾 (50 mM)浓度相同，而氯化镁浓度不同（0.05-5 mM，每次增加0.5 mM）。反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色来比较各扩增产物的量。PCR可在热循环仪（即PCR仪）中自动进行，以使反应各循环标准化。5. 一般来说，如第一次用新的模板DNA、新的引物或者新制备的耐热DNA聚合酶作PCR，扩增将不如预期理想。PCR反应条件需仔细调整，以抑制非特异扩增和（或）提高目标DNA的产量。6. 一个成功的PCR扩增

42、反应，可出现一个显而易见的与预期大小一样长度的DNA片段，此可通过DNA序列分析、Southern 杂交和或限制性图谱分析确定。RNA抽提制备【试剂准备】1、无RNA酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 2、75乙醇：用DEPC处理水配制75乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/L Tris·Cl(pH 7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH 8.0)，0.1SDS。4、洗脱缓冲液：1

43、0mmol/L Tris·Cl (pH 7.6)，1mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.05SDS。一、动植物总RNA提取（Trizol法）：【操作步骤】Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。 1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100 mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10。 2、研磨液室温放置5分钟，然后

44、以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。 3、取上层水相于一新的离心管，按每ml Trizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。 4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75乙醇，涡旋混匀，4下7500g离心5分钟。 5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55-60水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70乙醇并保存于-70。【注意事项】1、 整个操作要带口罩及一次性手套

45、，并尽可能在低温下操作。2、 加氯仿前的匀浆液可在-70保存一个月以上，RNA沉淀在70乙醇中可在4保存一周，-20保存一年。二、mRNA提取由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。【操作步骤】1、 用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g Oligo(dT)纤维素。 2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0

46、.5-1.0ml，用3倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。 3、用1柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。4、将提取的RNA液于65温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2 × 柱层析缓冲液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1 × 层析柱加样溶液。5、测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。 6、测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。 7、加入1/10体积的3M NaAc(pH 5.2)，2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀，-2030分钟

47、。 8、4下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70乙醇洗涤沉淀，4下12000g离心5分钟。9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。 10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70乙醇中并贮存于-70）。 【注意事项】1、 mRNA在70乙醇中-70可保存一年以上。 2、 Oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。用碱裂解并SDS法制备小量质粒DNA【目的】用碱裂解并SDS法从小量（12 ml

48、）培养的细菌制备质粒DNA。【原理】碱裂解法是纯化质粒前最常使用的裂解细菌的方法之一。产生碱裂解产物包括四个基本步骤。1悬浮：将收获的细菌悬浮在含有RNA酶A的Tris-Cl/EDTA缓冲液中。2裂解：细菌被氢氧化钠/SDS裂解。十二烷基硫酸钠（SDS）溶解细胞壁的磷脂和蛋白成分，导致细胞内容物的裂解和释放。氢氧化钠使染色体和质粒DNA以及蛋白质变性。RNA酶A使得裂解期间释放出来的细胞内RNA被消化。3中和：裂解物被酸性的醋酸钾中和。高盐浓度的溶液使十二烷基硫酸钾沉淀，加上变性的蛋白质、染色体DNA和细胞残骸共同沉淀在不溶性的含盐去污剂的复合物中。可复性和以共价键结合关闭的质粒DNA通过复性

49、保留在溶液中。4裂解物的澄清：高速离心清除沉淀的残骸，得到清亮的裂解液。【材料】1. 试剂和溶液（1）碱性裂解溶液I50 mM 葡萄糖25 mM Tris-Cl (pH8.0)10 mM EDTA (pH8.0)（2）碱性裂解溶液II0.2 N 氢氧化钠1% SDS（3）碱性裂解溶液III (100 ml)5 M 醋酸钾 60 ml冰醋酸 11.5 ml水 28.5 ml （4）质粒选择性抗生素（5）乙醇（6）含20 µg/ml RNA酶A的TE液 (pH 8.0)10 mM Tris-Cl (pH 8.0)1 mM EDTA (pH 8.0)20 µg/ml RNA酶A（

50、7）LB培养基2. 设备（1）14 ml 聚丙烯管（2）预设至37ºC的摇床（3）微量离心管（4）微量离心机（5）真空设备（6）振荡器【方法】一、细菌的准备1将转化产生的单菌落接种到2 ml含相应抗生素的LB培养液中，37ºC剧烈振摇培养过夜。2将1.5 ml培养液倒入微量离心管中，在微量离心机中4ºC以最大速度离心30秒。将剩余的培养液贮存于4ºC。3离心结束后，吸去上清培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。二、细菌的裂解1将细菌沉淀重悬于100 µl冰冷的碱性裂解溶液I中，剧烈振荡。2将200 µl新鲜配制的碱性裂解溶液 II 加到各个细

51、菌悬液中，盖紧管口，快速轻柔地颠倒离心管5次以混合内容物。将离心管放置于冰上。！不要振荡。3加150 µl冰冷的碱性裂解溶液III。盖紧管口，翻转离心管几次使碱性裂解溶液III在粘稠的细菌裂解液中分散均匀，然后将管置于冰上35分钟。4于微量离心机4ºC以最大速度离心细菌裂解液5分钟，将上清转移到另一离心管中。三、质粒DNA的回收1加2倍体积的乙醇到上清中，室温下沉淀核酸。振荡混匀，室温下放置2分钟。2用微量离心机于4ºC以最大速度离心5分钟来收集沉淀的核酸。3小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流尽。用Kimwipe纸巾或一次性吸头将附于管壁的液

52、滴吸尽。4加1 ml 70乙醇到有沉淀的管中，翻转盖好的离心管几次，用离心机于4ºC以最大速度离心2分钟回收DNA。5再小心地吸去所有的乙醇。* 此步须留意，因沉淀有时贴壁不紧。6除尽管壁上的乙醇滴，室温放置开盖的离心管（510分钟）直到乙醇挥发、管内无可视的液体。7用50 m1无DNA酶含20 mg/ml RNA酶A（胰RNA酶）的TE (pH 8.0)溶解核酸，稍微振荡几秒，将DNA液贮存于20ºC。【注意事项】1确保细菌培养液有足够量的空气氧化度：（1）培养管容量至少是培养液量的4倍以上。（2）培养管盖应宽松留隙。（3）通过剧烈振荡培养细菌。2未移尽的残留培养液将导致

53、质粒DNA抵抗限制性内切酶消化反应，因为细菌菌株的细胞壁成分会散落在培养基中，而这些成分有抑制许多内切酶反应的作用。3保证细菌沉淀物完全分散悬浮于碱性裂解溶液I中。两个离心管底部互相接触的振荡方式可有效地使两管菌体沉淀完全、迅速地分散。4确保整个离心管内壁与碱性裂解液II充分接触。5最好养成以同样方式摆放离心管于离心机转头的习惯。比如：依顺序地将离心管的塑料铰链朝外摆放，沉淀将沉积在远离转头中心的管内壁上，这样就更易发现可见的沉淀以及有效地溶解“不可视”的沉淀。同时，标记离心管的管壁和管盖可帮助识别每个管。6在干燥器或真空仪中干燥DNA，可至DNA难于溶解和变性，所以通常有效的方法是在室温下让

54、乙醇挥发1015分钟来干燥DNA，不致使其过度失水。7制备好的DNA，可通过电泳或限制性内切酶消化来鉴定。经PEG处理得到的高纯度DNA，可用作测序的模板。用氯化钙制备和转化大肠杆菌感受态细胞【目的】下面简单而快速的变通技术常用于制备成批的感受态细菌，这些细菌可使每微克超螺旋质粒DNA产生5 × 106 - 2 × 107个转化菌落。该方法适用于大多数大肠杆菌菌株。【原理】用冰预冷的氯化钙溶液处理细菌然后作短暂加热后，可用质粒DNA转化细菌。该处理方法诱导受体细菌处于短暂的“感受态”，在此期间它们能够摄取各种不同来源的DNA。若将按一定形式组合的二价阳离子处理改进的大肠杆菌

55、菌株更长时间，并用DMSO、还原剂和氯化六氨合高钴处理细菌，转化效率可提高100-1000倍。这些试剂的作用机制尚不清楚，而质粒DNA进入大肠杆菌感受态细胞的机制同样扑朔迷离。至于转化率的提高，则是经验性的实验结果。【材料】1. 试剂和溶液（1）LB 培养基（2）SOC培养基大约每次转化反应需要1 ml培养基。（3）氯化镁·氯化钙溶液80 mM 氯化镁20 mM 氯化钙（4）1 M氯化钙·2水当准备感受态细胞时，解冻10 ml贮存液用90 ml水稀释至100 ml，通过Nalgene滤膜(0.45 m孔径)过滤除菌，然后骤冷到0ºC。（5）质粒DNA（重组质粒）（

56、6）含适当抗生素的琼脂LB培养基2. 设备（1）摇床（2）离心机和转头（3）用冰预冷的聚丙烯管(50 ml)（4）用冰预冷的聚丙烯管(17×100 mm； Falcon 2059)（5）水浴预设置至42ºC和37ºC（6）温育箱预设置至37ºC【方法】一、感受态细胞的准备1. 从37°C培养16-20小时的平板上挑取一个单菌落(直径2-3 mm)，转到一个含有100 ml LB培养基或SOB培养基的1 L烧瓶中。于37°C剧烈振荡培养约3小时，并监测培养物的生长情况。* 如一指南中指出：1 OD600 的大肠杆菌株DH1每毫升含有10

57、9 细菌。2在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的、一次性使用的、用冰预冷的50 ml 聚丙烯管中。在冰上放置10分钟，使培养液冷却至0ºC。3于4°C以2700 × g离心10分钟，回收细菌。4倒出培养基，将管倒置在纸巾上1分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。5加30 ml冰冷的氯化镁氯化钙溶液，通过振摇或轻微振荡而悬浮细菌沉淀。64°C以2700 × g离心10分钟，回收细菌。7倒出溶液，保留细菌，将管倒置在纸巾上1分钟以使最后残留的痕量溶液流尽。8每50 ml初始培养物用2 ml冰冷的0.1 M 氯化钙，通过振摇或轻振荡而悬浮细菌沉淀。9此时，细菌可直接用于下面步骤描述的转化或者将细菌分装成小份，贮存于-70ºC冻存。二、转化1氯化钙处理的细胞可直接作转化实验，用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中取200 l到无菌的预冷的17 × 100 mm聚丙烯管中。加DNA（DNA50 ng而体积10 l）至管中。轻轻振摇以混匀内容物，在冰上放置30分钟。2将试管放至42°C循环水浴中的试管架上，精确放置90秒