激光扫描共聚焦显微镜ZEISS780操作规程

1、激光扫描共聚焦显微镜ZEISS 780操作规程本设备属于精密设备，操作人员必须提前熟悉其适用范围、结构、性能及其具体操作方法，未经操作培训者不能进行上机操作。通过操作培训的人员必须严格按 照仪器管理老 师的培训要求及设备使用说明书指定的操作进行工作。1开机提前进行镜检，确保样本无误；查看空调温度、抽湿机湿度和不间断电源工作情况。1.1开三相稳压电源。注意：先开稳压电源后面的黑色扳手开矢，再按下稳压电源前面 的绿色按钮 ，如果出现报警声，请马上矢闭稳压电源，并报告管理人员。1 -2两分钟以后依次打开电源控制板上的三个开矢。先打开主开矢MAIN SWITCH，再依 次打开SYSTEMS/PC和CO

2、MPONENTS开矢。注意：各个开矢不要同时按下，开 机时仪器会进行自检，每按下一个开矢，请等待相应的部件自检完毕后再开下一个开矢。1.3打开电脑开矢，点击“LSM User图标，进入桌面；当看到桌面右下角显示“注意 安全”图标时，方可点击桌面中央的ZEN软件图标；然后点击“Start System ”按钮开启软 件。注意：当桌面右下角始终不显示“注意安全”图标时，不可启动软件。这时把电脑主机左边 那台仪器的盖子掀开，按一下“ Reset”按钮，等待电脑桌面右下角出现“注意安全”图 标。1.4打开氟离子激光器（若不使用458nm或488nm或514nm激光线则不需要打开）。先 打开氨离子激光器

3、正面的开矢ON，再顺时针旋转钥匙 至“一”的方向，等待绿色指 示灯亮起 方可开启光路（大约5-10min）。注意：Ar+激光器在启动后，需要1h左右的预热时间才能进入稳定状态。若闲置时间1h以 上可将激光器扳钮由“laser run”位置扳至“idle power ”处 ，保护激光器，延长使 用寿命2找目标21在明场下用Transmitted light找目标，点击、BF UIGFPCFPRhodDIC丄注意：如果实验只使用空气镜，放置样品后，建议先选择低倍物镜找细胞，再换用高倍物镜微 调即可。切记调焦和移动前后、左右的滑竿时，不要太快太猛，以免物 镜顶到样品或载物台，这 会严重磨损和划花镜头

4、，甚至碰碎镜头！ ！ 切记：显微镜左、右两边的粗准焦螺旋上方各有五个按钮，如果不知道它们各自的 功能不要碰 触，否则可能矢闭明场灯源，无法用眼睛找细胞。水、油镜使用注意：如需使用水镜或油镜，水、油不要滴太多，以免从镜头边缘流入物镜内部污染镜头。换细胞前后不要反复擦拭镜头，擦拭过多容易磨花镜头，降 低透过率，般 两三个样本后再追加一滴水或油即可。实验结束后先用擦镜纸将油擦尽，再用无水乙醇清 洁。2.2在荧光下用Reflected light找目标，先打开汞灯电源，然后点击上图片中的、一、除非实验转染的荧光蛋白效率稍低（镜检时发光的目标不多，但仍然可以进行 试验），否 则一般不要开汞灯，汞灯寿命有

5、限。二、经镜检确定需要使用汞灯的标本，样本放置好后再打开汞灯电源。集中观察，节省时间保 护光源；快速寻找目标观察，保护样品不被淬灭。切记：不可频繁开矢汞灯，汞灯点燃后至少15分钟汞蒸汽才完全蒸发，因此打开汞灯后至 少要30分钟后才可以矢闭汞灯电源，汞灯矢闭后不能马上再次打开使用，至少一小时以后 等灯泡完全冷却后再开。3. 激光扫描图像获取:用眼睛找完细胞以后，要切换到激光扫描模式来获取图像。依次点击上图片中的：、按钮。切记：从找细胞切换到图象扫描，一定要记得点击，否则容易损坏仪器。31光路选择设定：一、新设置光路：点击下图中的Smart Setup按钮，选择自己所用的荧光探针，设定所需的颜色然

6、后点击Best signal 点击Apply按钮。注意：如果使用Ar+激光器，点击Apply前，先确定激光器上的绿色指示灯亮起。en之前实验所得的一张图片，点击页面最下方o打开的那张图片的参数。同样注意：如果使的Resue按钮此时软件的一切参数均loots Window Help使用原来的光路:lb File 中用Ar+激光器，点击Apply前，先确定激IMM光器上的绿色指不灯売三、自己设置光路：需要知道所使用图Light Path中选择合适旳激麦光光蛋白或燃料的激发光谱和发射光谱。在下 色镜，荧光接收波段。4. 扫描参数设定:光路设定后，点击上图中的Live按钮，预览找目标。此时可以移动样品

7、，微调焦，调针 孔大小，调图像荧光亮度，调透射图T-PMT亮度，调噪音等。调好图像后，点击Live处的 红色Stop按钮停止预览，再点击Snap按钮拍照。切记：预览结束后一定要先Stop， 再点击Snap,否则很容易死机。激光器输出功率的调节要注意：激光器的输出功率越高，荧光图像和透射图图像就越亮，但会*oc50C60C700Use 6 cger DetectorRchectBcnl/aSrrn 1ChSl41-zrtF72nJK Peneaiorvisible造成荧光样品的光漂白，长时间扫描或对荧光性质不稳定的染料尤其明显，所以实验中尽量不 要把激光器的输出功率调的太高。调节激光器的输出功率

8、时要逐步调节，不要一下子将光标拖到需要的功率，否则容易损坏激光器或AOTF（声光调节滤光片）。Pinhole的调节要注意：Pinhole越小，图象的分辨率越高，但探测器收集到的荧光也越 少，图像亮度就越小，一般先选1AU，如果图像过暗可适当增加。使用多通道（多Track ） 时，应使每个Track里设置的pinhole大小一致（optical slice 致），以保证不同通道 探测的都是细胞同一层面的荧光； 增益Gain （Master）的调节要注意：Gain （Master）的设置不宜太高，原则上增益不 要超过800，同时Gain设置太高也会导致背景过高，降低图象的信噪比。如果信号太弱，可

9、以适当调高放大器的增益（Digital Gain ），其默认值为1，例如可以调高到1.5左右（不 要超过2 ）。背景Digital offset的设定原则：图象最亮点不超过饱和值256 （显示红色），图象背景处的 蓝色雪花点不宜太多（蓝色表示信号强度为零）。注意：准备样品的时候，请将探测通道先矢闭（即将Track前的符号“厂”去掉），这样 高压包上没有加电压，可以起到保护高压包延长寿命的作用。5. 尖机（与开机顺序相反）1矢汞灯：如果使用了汞灯，先把汞灯强度调到最小，再矢闭开矢OFF。2. 矢激光器：如果使用了氮离子激光器，在实验完成后，先将氨离子激光器正面的钥匙逆 时针旋转至“丨”的方向，等待排风扇停止工作（大约5-10min ），再矢闭开矢OFF。其它激光器直接在软件（Laser ）中矢闭。3. 退出系统软件。4. 矢闭电脑。