血红蛋白的提取

1、2021/3/171诊断方法诊断方法: :1 1、临床表现、临床表现2 2、遗传史、遗传史3 3、红细胞形态、红细胞形态4 4、血红蛋白电泳分析、血红蛋白电泳分析2021/3/1722021/3/173根据根据蛋白质各种特性蛋白质各种特性的差异的差异, ,如分如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等亲和力等等, ,可以用来分离不同种类的可以用来分离不同种类的蛋白质。蛋白质。 一、基础知识一、基础知识2021/3/174阅读P64回答: 1、凝胶色谱法利用的是蛋白质的哪个性质? 2、该方

2、法中哪种物质是关键?如何起到分离作用?2021/3/175 大多数大多数凝胶凝胶是由是由多糖类多糖类化合物（如化合物（如葡聚糖或琼脂糖葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体构成的多孔小球体, ,内部有许多贯穿的内部有许多贯穿的通道通道。2021/3/176_ _ 的蛋白质容易进入凝胶内部的通道的蛋白质容易进入凝胶内部的通道, ,路程较路程较_, ,移动速度较移动速度较_;_;_的蛋白质无法进入凝胶内部的通道的蛋白质无法进入凝胶内部的通道, ,只能在凝胶外部移动只能在凝胶外部移动, ,路程较路程较_, ,移动速度较移动速度较_。相对分子量较小相对分子量较小长长慢慢相对分子量较大相对分子量较大短短快快2

3、021/3/177磷酸缓冲液磷酸缓冲液如何如何证明证明凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白凝胶色谱法获得的蛋白质是目的蛋白?如如H H2 2COCO3 3/NaHCO/NaHCO3 3,NaH,NaH2 2POPO4 4/Na/Na2 2HPOHPO4 4等等2021/3/178带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。2021/3/179阅读P66回答1、电泳方法有哪些?本书采用的是哪种?2、SDS的作用?2021/3/1710琼脂糖琼脂糖凝胶电泳、凝胶电泳、聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶电泳。2021/3/1711电泳检测结果电泳检测结果2021/3/1712

4、2021/3/17131、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中,关于蛋白质关于蛋白质的叙述的叙述,正确的是正确的是A 相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质质量较大的蛋白质B 相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质质量较大的蛋白质C 相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质质量较大的蛋白质D 二者根本无法比较二者根本无法比较2021/3/17143、使用、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中聚丙烯酰胺电

5、泳过程中,不同蛋白不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于质的电泳迁移率完全取决于A 电荷的多少电荷的多少 B 分子的大小分子的大小C 肽链的多少肽链的多少 D 分子形状的差异分子形状的差异2021/3/1715样品处理样品处理粗分离粗分离纯化纯化纯度鉴定纯度鉴定蛋白质提取和分离步骤蛋白质提取和分离步骤（一）血红蛋白（一）血红蛋白2021/3/1716血血每个肽链环绕一个每个肽链环绕一个亚铁血红素亚铁血红素基团基团,此基团可携带此基团可携带一分子氧或一分子氧或一分子二氧化碳一分子二氧化碳,血红蛋白因含血红蛋白因含有有血红素血红素而呈而呈红色。红色。2021/3/17172021/3/1718 去除杂蛋

6、白去除杂蛋白, ,以利于后续血红蛋白的以利于后续血红蛋白的分离纯化分离纯化, ,洗涤次数不可过少。洗涤次数不可过少。1 1、采集血样。、采集血样。2 2、低速短时间离心（速度越高和时间越长、低速短时间离心（速度越高和时间越长, ,会使白会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀细胞和淋巴细胞等一同沉淀, ,达不到分离的效果）达不到分离的效果）3 3、吸取血浆、吸取血浆: :上层透明的黄色血浆。上层透明的黄色血浆。4 4、盐水洗涤、盐水洗涤: :用五倍体积的质量分数为用五倍体积的质量分数为0.90.9的氯化的氯化钠溶液洗涤。钠溶液洗涤。5 5、低速离心（低速短时间）、低速离心（低速短时间）6 6、重复、重复

7、4 4、5 5步骤三次步骤三次, ,直至上清液中已没有黄色直至上清液中已没有黄色, ,表表明洗涤干净。明洗涤干净。（二）操作过程（二）操作过程2021/3/1719(2)(2)血红蛋白的释放血红蛋白的释放: :加蒸馏水到原血液体积加蒸馏水到原血液体积, ,再加再加4040体积的甲苯体积的甲苯 , ,置于磁力搅拌器上充分搅拌置于磁力搅拌器上充分搅拌1010分钟分钟（加速细胞破裂）（加速细胞破裂）, ,细胞破裂释放出血红蛋白。细胞破裂释放出血红蛋白。将搅拌好混合液转移到离心管内将搅拌好混合液转移到离心管内, ,以以2000r/min2000r/min的速度离心的速度离心10 min10 min。第

8、第1 1层（最上层）层（最上层）: :甲苯层（无色透明）甲苯层（无色透明）; ;第第2 2层（中上层）层（中上层）: :脂溶性物质沉淀层（白色）脂溶性物质沉淀层（白色）; ;第第3 3层（中下层）层（中下层）: :血红蛋白的水溶液层（红色血红蛋白的水溶液层（红色) ); ;第第4 4层（最下层）层（最下层）: :杂质沉淀层（暗红色）。杂质沉淀层（暗红色）。用滤纸过滤用滤纸过滤, ,除去脂溶性沉淀层除去脂溶性沉淀层, ,于分液漏斗于分液漏斗中静置片刻后中静置片刻后, ,分出下层的红色透明液体。分出下层的红色透明液体。2021/3/1720 取取1ml1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中的血红蛋白溶液

9、装入透析袋中, ,将透将透析袋放入盛有析袋放入盛有300ml300ml的物质的量浓度为的物质的量浓度为20mmol/l20mmol/l的的磷磷酸缓冲液酸缓冲液中（中（pHpH为为7.07.0）, ,透析透析1212小时。小时。 除去样品中分子量较小的杂质。除去样品中分子量较小的杂质。2021/3/1721 取长取长4040厘米厘米, ,内径内径1.61.6厘米的玻璃管厘米的玻璃管, ,两端需用砂纸磨平。两端需用砂纸磨平。底塞的制作底塞的制作: :打孔打孔挖出凹穴挖出凹穴安装移液管头部安装移液管头部覆盖尼龙覆盖尼龙网网, ,再用再用100100目尼龙纱包好目尼龙纱包好, ,插到玻璃管的插到玻璃管

10、的一一端端。: :底底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面, ,否则难否则难以铺实尼龙网以铺实尼龙网, ,还会导致液体残留还会导致液体残留, ,蛋白质分离不彻底。蛋白质分离不彻底。顶顶塞的制作塞的制作: :打孔打孔安装玻璃管安装玻璃管。组装。组装: :将上述三者按相应位将上述三者按相应位置组装成一个整体置组装成一个整体。安装其他附属结构。安装其他附属结构。2021/3/1722A A、材料、材料: :交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（G-75G-75）。）。B B、代表意义、代表意义: :“G G”表示凝胶的交联程度表示凝胶的交联程度, ,

11、膨胀膨胀程度及分离范围程度及分离范围。7575表示凝胶的得水值表示凝胶的得水值, ,即每克即每克凝胶膨胀时吸水凝胶膨胀时吸水7.57.5克。克。配置凝胶悬浮液配置凝胶悬浮液: :计算并称取计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后胀后, ,配成凝胶悬浮液。配成凝胶悬浮液。2021/3/1723A、固定、固定:将色谱柱装置固定在支架上。将色谱柱装置固定在支架上。B、装填、装填:将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内内,装填时轻轻敲动色谱柱装填时轻轻敲动色谱柱,使凝胶填装均匀。使凝胶填装均匀。1、凝胶装填时尽量紧密、凝

12、胶装填时尽量紧密,以降低凝胶颗粒之间以降低凝胶颗粒之间的空隙。的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在、装填凝胶柱时不得有气泡存在:因为气泡会因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,降低分离降低分离效果。效果。2021/3/1724装填完毕后装填完毕后, ,立立即用缓冲液洗脱瓶即用缓冲液洗脱瓶, ,在在50cm50cm高高的操作压下的操作压下, ,用用300ml300ml的的20mmol/l20mmol/l的磷酸缓冲液（的磷酸缓冲液（pHpH为为7.07.0）充分洗涤平衡）充分洗涤平衡1212小时。小时。1 1、液面不要低于凝胶、液面不要低于凝胶表面表面, ,否则可

13、能有气泡混入否则可能有气泡混入, ,影响液体在柱内的流动与最影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效终生物大分子物质的分离效果。果。2 2、不能发生洗脱液流干、不能发生洗脱液流干, ,露出凝胶颗粒的现象露出凝胶颗粒的现象。2021/3/1725打开下端出口打开下端出口, ,使柱内缓使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐冲液缓慢下降到与凝胶面平齐, ,关闭出口。关闭出口。 吸管吸吸管吸1ml1ml样品加到色谱样品加到色谱柱的顶端柱的顶端, ,滴加样品时滴加样品时, ,吸管管口贴着管壁环绕吸管管口贴着管壁环绕移动加样移动加样, ,同时注意不要破坏凝胶面。同时注意不要破坏凝胶面。 2021/3/

14、1726正确的加样操作是正确的加样操作是: :1 1、不要触及并破坏凝胶面。、不要触及并破坏凝胶面。2 2、贴壁加样。、贴壁加样。3 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。、使吸管管口沿管壁环绕移动。2021/3/1727加样后打开下端出口加样后打开下端出口,使使样品渗入凝胶床内样品渗入凝胶床内,等样品完全进入凝胶层等样品完全进入凝胶层后后,关闭下端出口关闭下端出口小心加入小心加入pH=7.0 的的20mmol/l的磷酸的磷酸缓冲液到适当高度缓冲液到适当高度,连接缓冲液洗脱瓶连接缓冲液洗脱瓶,打开打开下端出口进行洗脱。下端出口进行洗脱。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时待红色的蛋白质接近色谱柱底端时,用试

15、管收集流出液用试管收集流出液,每每5ml收集一试管收集一试管,连续连续收集。（在分离过程中收集。（在分离过程中,如果红色区带均匀如果红色区带均匀一致的移动一致的移动,说明色谱柱制作成功）说明色谱柱制作成功）2021/3/1728让血红蛋白处在稳定的让血红蛋白处在稳定的pHpH范围内范围内, ,维持结构维持结构和功能正常。和功能正常。血红蛋白是有色蛋白血红蛋白是有色蛋白, ,因此在凝胶色谱分离时可因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观这使血红蛋白的分离过程非常直观, ,大大简化了大大简化了实验操

16、作。实验操作。 2021/3/1729鉴定血红蛋白纯度。鉴定血红蛋白纯度。2021/3/17301.1.样品的处理样品的处理通过洗涤红细胞、血红蛋白通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液2.2.样品的粗分离样品的粗分离经过透析去除分子量较小经过透析去除分子量较小的杂质的杂质3.3.样品的纯化样品的纯化将相对分子将相对分子质量较大的杂质蛋白除去质量较大的杂质蛋白除去4.4.经经进行进行纯度鉴定纯度鉴定。2021/3/1731观察你处理的血液样品离心后观察你处理的血液样品离心后是否分层是否分层（见教科书图（见教科书图5-185-18）, ,

17、如果分层不明显如果分层不明显, ,可能是可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外此外, ,离心速度过高和时间过长离心速度过高和时间过长, ,会使白细胞和淋巴细会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀胞一同沉淀, ,也得不到纯净的红细胞也得不到纯净的红细胞, ,影响后续影响后续血红蛋白的提取纯度。血红蛋白的提取纯度。1 1、你是否完成了对血液样品的处理、你是否完成了对血液样品的处理? ?你能描你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗述处理后的样品发生了哪些变化吗? ?2021/3/17322 2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生? ?你

18、的你的色谱柱装填得成功吗色谱柱装填得成功吗? ?你是如何判断的你是如何判断的? ? 由于凝胶是一种半透明的介质由于凝胶是一种半透明的介质, ,因此可以在因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯, ,检查凝检查凝胶是否装填得均匀。此外胶是否装填得均匀。此外, ,还可以加入大分子的还可以加入大分子的有色物质有色物质, ,例如蓝色葡聚糖例如蓝色葡聚糖20002000或红色葡聚糖或红色葡聚糖, ,观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整整, ,说明凝胶色谱柱的性能良好。说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出如果色谱柱出

19、现纹路或是气泡现纹路或是气泡, ,轻轻敲打柱体以消除气泡轻轻敲打柱体以消除气泡, ,消除消除不了时要重新装柱。不了时要重新装柱。 2021/3/1733 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话也正确的话, ,能清楚地看到血红蛋白的红色区能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整带均匀、狭窄、平整, ,随着洗脱液缓慢流出随着洗脱液缓慢流出; ;如如果红色区带歪曲、散乱、变宽果红色区带歪曲、散乱、变宽, ,说明分离的效说明分离的效果不好果不好, ,这与凝胶色谱柱的装填有关。这与凝胶色谱柱的装填有关。2021/3/1734作业作业 完成完成血红蛋白的提

20、取和分离血红蛋白的提取和分离学案巩学案巩固固1 1、巩固、巩固2 2、例、例1;1;随堂达标检测随堂达标检测1 1、3 3; ;活页活页1 1、3 3、5 5、7 75月月15日日2021/3/1735作业作业 完成完成血红蛋白的提取和分离血红蛋白的提取和分离学案全部学案全部5月月16日日2021/3/1736教学反馈教学反馈 1凝胶色谱法是根据（凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。）分离蛋白质的有效方法。 A分子的大小分子的大小 B相对分子质量的大小相对分子质量的大小 C带电荷的多少带电荷的多少 D溶解度溶解度2缓冲液的作用是缓冲液的作用是:在一定范围内在一定范围内,抵制外界的影响来维抵制外界的影响来维持（持（ ）基本不变。）基本不变。 A温度温度 B pH C渗透压渗透压 D氧气浓度氧气浓度3电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电