CHO细胞表达系统的研究进展

1、cho细胞表达系统研究进展advances in the studies of the cho cell expressing system学院：生命科学学院 专业：生物技术专业 班级： 06 级 4 班 姓名： 沈 容 学号：21620062203468cho细胞表达系统研究进展沈容摘要：中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary cell) 是目前重组糖基蛋白生产的首选体系。本文综述了cho表达系统的特点以及近几年来该系统在生产基因工程药物方面的研究进展、存在问题和发展方向。关键词：cho cell；表达系统；基因工程药物；疫苗诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药

2、物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20 %以上1。各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。 基因工程药物研究与开发的主要环节包括：基因的克隆和基因工程菌的构造；重组细胞的培养；目的产物的分离纯化等。针对这些主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。随着基因工程技术的不断发展，目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质(表1)。大肠杆菌(e.coli)是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于用e.col

3、i生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。此外，它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。表1 用于生产基因工程药物的表达系统tab.1 used in the production of genetic engineering drugs systems/ ( h h. ( w表达系统特点产量原7 k( i& 2 v( ; j, j核生) d4 b; _8 x) g+ k4 y物大肠杆菌(e.coli)具有原核细胞良好的可操作性，成本低产率高，但不能进行糖基化修饰，胞内分泌形成包涵体。: % l, w. b+ p8 t外源蛋白占细菌总蛋白量：胞内表达10%70%，胞外

4、表达 0.34o! ?) a5 x( b( 8 p* r9 w真核生物酵母(yeasts)7 h6 c v0 , r% v8 j( d$ o兼具原核细胞良好 的可操作性和真核系统的后加工能力，但 存在产量低及过度糖 基化等问题。外源蛋白占菌体总蛋白量：10%甲醇营养型酵母(methylotroph yeasts)第二代酵母表达系统，部分克服了利甩酵母表达的过度糖基化缺点，有较好的分泌牲，产量较高，但 产品结构与天然分子仍有一些差异. w% % w0 , n! a; dq外源蛋白占菌体总蛋白量：1030昆虫杆状病毒系统# k4 h y2 b+ g( * f4 b具有高等真核生物表达系统的优点，产

5、品的抗原性免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，但其糖基化程度较低，形式较为单一发酵液中目的产物含量：1500mgl哺乳动物细胞7 ?+ 0 b0 j# b# q6 u产品的抗原性、免疫原性和功能与天然 蛋白质最接近，糖基化等后加工最准确，表达水平较低发酵液中目的产物含量 ；0.2 200mgl1 cho表达体系及其特点cho细胞即中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary)，该细胞具有不死性，可以传代百代以上，是目前生物工程上广泛使用的细胞。全世界批准正式应用于人类疾病治疗或疾病预防的基因工程产品约有三十多种，其中只有一种(乙肝疫苗)是由酵母菌生产的，其余所有产品都

6、是由cho细胞和大肠杆菌生产的，大肠杆菌不能形成有活性的二聚体(如白介素2)，也不具有糖基化的功能(如epo)，而cho却具有如上的功能，因此cho成为表达复杂生物大分子的理想宿主。另外ch0细胞在基因工程使用中还有一个优点，该细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌cho内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利目前常用的cho细胞包括原始cho和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(dhfr-)突变株cho。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(sfm)，但sfm往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能

7、力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子igf基因和转铁蛋白基因转入cho细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级cho”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在sfm中生长良好。与其他表达系统相比，cho表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子6； (2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力； (3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定； (4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； (5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度

8、培养。且培养体积能达到1000l以上，可以大规模生产。! j/ r, x- p, g. b表2 某些利用cho细胞表达的外源基因tab.2 some exogenous genes expressed by cho cell药用蛋白产量0 w2 i3 q z* % b1 x+ rg-csf90g/1x106ce1124h( k( a% g& v* _: t55.6gml72h2 v: t- f6 s( 6 x8 hfsh14mgl24h w; 7 l3 / v5 dep0, e4 m8 4 l# 3 x% u$ 10085um0 s$ y( k! b. |, t8 d cpro -uk y7

9、% w( 5 r$ a# l% e/ c p, l& b5001000iu106ce1124h2 q5 v dc y& w8001500iu106ce1124hil -636.8g106ce1124hil -12105umlifn(7). o# h! j; j# i8 . d4 u$ p% u6 d4 9gmlat67.980g106ce1124h4 o( z; t$ 0 i5 kcmpath-1h- b! y* r a3 b7 p131.1mgl122hgp10.64mgmltimp2 b* e+ r% # g180gml l9 % y: b9 8 : 8 n j# d2 cho细胞血清培养

10、传统上cho细胞的培养都是在dmemf ：基础培养基中添加5 10 的小牛血清(用于重组蛋白)或胎牛血清(用于杂交瘤生产单抗来完成的，血清除了供给细胞的营养成分外，还能促进细胞开始合成dna，对细胞的增殖有很大的作用。实验证明血清在细胞的体外培养中提供了细胞增殖所必需的生长因子。但哺乳动物的血清价格昂贵，成本高不适于今天的大规模工业化生产。而且哺乳动物血清作为补加物，存在许多问题，首先血清的来源存在问题，血清来源于特定的地区，因而如果该地区发生灾荒或牛群中流行疾病，都可导致血清失去供应源。血清批量之间的差异大，重复性差，由于血清来源于动物，动物个体或群体的差异及时间上的差异都能导致每个批号的血

11、清不完全一样。从重组蛋白生产的角度来看，出于q 和qc的要求，每换一个批号的血清都包含大量的验证工作，这就给生产带来很大的麻烦。另外血清来源于动物因此经常被污染，污染的血清往往导致细胞生长缓慢，蛋白产量下降，甚至导致细胞死亡。目前购自各大公司的血清虽能消灭细菌和所有支原体，但很难保证除去所有的病毒污染。血清的成分十分复杂，经研究表明，血清除含有促进生长的活性成分外，还含有一定的细胞毒性物质和抑制物质，对细胞有去分化作用，影响细胞功能的表达 血清复杂的成分也给基因工程表达产物的下游工作带来很大的困难，因此成分明确，价格经济的无血清培养基成为cho细胞培养的一种必然需求。3 cho细胞的无血清培养

12、从血清培养所面临的问题，我们不难看出：人们急切地需要找到能够替代血清的物质，从而解决血清培养所面临的这一问题。五十年代起，科学家就开始研究无血清培养基。要发展无血清培养基，必须找到适当的具有血清功能的因子，由于血清的成分不清而且十分复杂，具有多种促进细胞生长和增殖的因子因此要找到血清替代物是相当困难的。人们已经发现一些物质单独或一起使用可以替代血清。这些物质分别是微量元素、生长因子、激素、脂蛋白、脂肪酸、酶抑制剂。微量元素是细胞代谢所必需的，是无血清培养基的主要添加物之一，铁、锌、硒等都是不可缺少的，有些资料证明还需要铜、锰、钼、钒等元素，这些元素在血清培养中由血清提供，在无血清培养中需要补加

13、。促生长因子是无血清培养基的主要补加物之一。现在研究者已经从血清、各种组织和生物成分中用生物工程的方法，制取了各种促细胞生长物，如表皮生长因子(egf)，成纤维细胞生长因子(fgf)，血小板生长因子(pdgf)、生长调节素(sm)等。现已证明很多激素具有促进细胞生长的作用，胰岛素能促进细胞利用葡萄糖和氨基酸，无血清培养基缺乏对细胞的保护，血清培养残余的胰蛋白酶对血清的损伤十分严重，因而无血清培养基必须添加酶抑制剂。脂类是细胞膜的主要成分，添加脂类可以促进细胞增殖，随着无血清培养基研究的进一步深入，无血清培养基将越来越完善。4 无血清培养基的发展目前的无血清培养基已进入第三代，第一代无血清培养基

14、虽然不含有血清，但含有大量的动物或植物蛋白，如bsa或激素等，虽然它所含的总体蛋白要低于血清，但蛋白的含量依然很高，八十年代末，九十年代初，研究人员开发出了第二代无血清培养基，它完全不用动物来源的蛋白，如 lti公司生产的 ch0ssfm i，它采用悬浮的cho表达蛋白，培养基蛋白含量很低(少于100g/m1)，使重组蛋白的纯化简单，目前市售的无血清培养基主要是这一类。第三代无血清培养基现在已经出现，它完全不含有蛋白或含量极低，如 lti公司最近推出的choipfm，培养基不含任何蛋白质，没有任何动物、人类蛋白或多肽，为表达产品的下游处理工作提供极大方便。目前无血清培养基的价格还很高，不亚于大

15、规模的工业化生产，因此降低无血清培养基的成本，开发出无血清、无蛋白、低成本的无血清培 养基日益受到人们的重视。随着生物工程产品的开发和推广，它的应用愈来愈广泛，相信在将来的生物制药行业它将具有广阔的市场前景和应用空间。5 cho细胞表达疫苗5.1乙肝疫苗/ x1 j: , u l; i cho细胞表达疫苗的种类不多，多数处于研究阶段。目前只有 cho表达乙肝疫苗 已投入生产，这是除酵母表达乙肝疫苗以外，唯一已用于人类使用的基因工程亚单位疫苗。使用酵母表达乙肝疫苗虽然获得了很大成功，但是酵母系统还存在着许多缺陷，最重要的一点，酵母不能模拟蛋白在人体肝细胞中的翻译后修饰、蛋白折叠、大分子组装以及糖

16、基化。这些特点正是抗原在动物细胞中引起免疫反应所必须的。而 cho细胞表达的蛋白更接近人体来源的乙肝表面抗原。1991年中国预防医学科学院病毒学研究所联合长春生物制品研究所等单位研制成功了由 cho细胞表达的基因工程乙肝疫苗，并于1992年批量上市。该疫苗是以s蛋白为靶抗原的乙肝疫苗，与酵母表达的乙肝表面抗原同属于第2代乙肝疫苗。* 3 j# c4 q) ?0 _0 许多实验证明，乙肝病毒(rmv)衣膜蛋白的pres部分在引发人体免疫反应中起着重要作用。因此由 cho细胞中表达的含s和pres2基因的乙肝表面抗原，被誉为第三代乙肝疫苗。以色列生产的新 型疫苗。包含了s、pres1、pres2等

17、3个基因，在cho中表达的蛋白形成22 m大小的颗粒，含有衣膜所有的抗原表位。! r4 r3 o/ n s3 yv$ u- 目前已投入市场的cho表达基因重组乙肝疫苗主要有：法国巴斯德研究所gen hevac b、以色列 bio-technology general公司的bio-hep-b、瑞士的hepreeombe等。在美国以酵母表达的乙肝疫苗为主的同时，cho表达的乙肝疫苗占据了欧洲市场。中国长春生物制品所的乙肝疫苗 已正式生产。在现有的安全性记载中，动物细胞表达的生物产品尤其cho表达的产物的安全性很好。在已批准进入临床或生产的动物细胞表达的乙肝疫苗的使用中，没有发现严重的副反应。在免疫

18、原性方面，我国 cho生产的乙肝疫苗的免疫原性与血源疫苗没有差异，明显优于酵母重组疫苗。还有调查显示，新生儿接种国产乙肝cho疫苗第1年的抗hbs阳性率为98.25，抗体gmt为77.64，而血源疫苗免疫后第1年抗hbs阳性率在73.393.5之间。与酵母重组疫苗比较，更低剂量的cho乙肝重组疫苗及鼠细胞表达的乙肝疫苗在t细胞水平产生更高的免疫原性，这些疫苗刺激t细胞产生帮助引起更高的血清转化率和更高的抗hbs滴度。 + n2 x7 1 e$ z & d p+ a( a: j5.2epstein-ban-病毒(ebv)疫苗 1 z d6 e7 x7 _ 象其他疱疹病毒一样，ebv外周包绕一层脂

19、质包膜。主要由gp340(有报道为gp350)和gp220两种糖 蛋白组成，分子量分别为340kda和220kda。gp340/220具有广泛的糖基化位点，其多糖部分占整个分子量的50以上，因此，哺乳动物细胞是其最适宜的表达宿主。将含gp340/220基因的重组载体，转染cho-a6细胞系和cho dhfr-细胞系，经筛选获得可表达gp340/220蛋白的细胞株，经纯化的gp340/220免疫小鼠。2周后小鼠血清中检测到明显的gp340/220特异性抗体，表明cho细胞表达的gp340/220具有同天然膜抗原相似的分子量、糖基化程度、免疫特异性和免疫原性，可望成为eb病毒基因工程亚单位疫苗。)

20、 i; , p u# f. a* b! p3 s 国外有研究也将gp340/220基因克隆构建重组载体，但经过定点突变使之只合成gp340蛋白。该种蛋白同样能被抗gp340220的单克隆抗体所识别，并具有同ebv受体、cd21结合的能力，说明重组蛋白同野生型ebvgp340/220结构相似。用重组蛋白免疫兔子，获得了高滴度的抗体，所产生的抗体可以中和野生型ebv。5.3艾滋病病毒(hiv)疫苗 # o) _5 x/ r3 n m6 u hiv基因组中的三大结构蛋白编码区分别编码核心蛋白gag、聚合酶pol和外膜蛋白env。env的前体单位为糖蛋白gpl60，加工后形成膜外蛋白gp120和跨膜蛋

21、白gp41。目前针对 hiv病毒研制的疫苗有多种：减毒活疫苗、灭活疫苗、载体活疫苗、dna疫苗、合成肽疫苗及重组亚单位疫苗。 . n1 |, m. ( k& t v8 m. 其中不同宿主细胞表达的以env、gag、pol等蛋白为靶抗原的多种亚单位疫苗在国外进入了临床实验。其中cho细胞表达的gpl20制成的疫苗为较早研制的一种。重组载体转入cho-l761h细胞系，获得可持续分泌gpl20蛋白的细胞株。5 x( d1 s, z* h 纯化后的蛋白同3种常用免疫佐剂免疫兔子，均诱导了高滴度的免疫反应；给猩猩接种也可以保护机体免受由低剂量的同类 hiv毒株攻击而导致的感染。但是在泰国给数千人免疫接

22、种后无明显的保护效果。不过。在恒河猴接种gp120疫苗的同时注射cho表达的重组白介素12(ill2)。所诱导的抗体水平是单一接种gp120疫苗的10倍；而新的i临床使用表明，受试者免疫重组痘病毒疫苗后。再使用gp120亚单位疫苗加强，80%以上的人产生了特异的体液和细胞免疫反应。 6 cho细胞表达系统存在的问题及前景展望6.1 存在的问题7 h1 q9 r+ b; e% k/ y$ n 在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用cho细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题：% d5 p(

23、& z+ a* v% 2 构建的重组cho细胞生产效率低，产物浓度亦低； 某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化；( y% 6 bm8 v9 l v重组cho细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高教表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少； v r4 s0 , o 6 : q u! e n重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。6.2 前景展望 5 m$ n2 u- ci! v! j. e$ r 在今后的若干年内，随着以cho细胞为主的动物细胞表达系统日趋完善，动物细胞将可能成为生产基因工程药物的主要宿主细胞。围绕cho细胞表达系统而进行的相关

24、研究将成为生物工程领域一个活跃的研究热点。科研人员将把以下问题作为今后的主攻方向：0 s. t g8 f6 t) % i6 p5 y8 j提高表达水平，如发展一些新的强启动子，寻找合适的增强子，装配适合于cdna高效表达的必要元件以及根据cho细胞翻译特点调整外源基因密码子等；4 e6 - w9 q$ r % i f. i在进一步提高表达水平的同时还将注重分离纯化的问题，如改变dna中的个别序列，使表达产物在不影响生物 活性的前提下，携带有利于分离纯化的基团；9 _7 y6 _4 d2 z+ i! v细胞培养的低成本、高密度、高产量和培养设备的大型化、自动化精巧化； 分离纯化的低成本和高活性回

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