分子生物学检验技术第3章

1、中南大学中南大学 罗建新罗建新第第三三章章 蛋白质组与蛋白质组学蛋白质组与蛋白质组学dnamrna蛋白质转录翻译基因蛋白质细胞特异性基因表达生理状态蛋白质相互作用温度应激状态培养条件药物作用数量有限结构相对稳定复杂性多变性直接反应生命现象复杂的调控第第三三章章 蛋白质组与蛋白质组学第一节第一节 蛋白质组与蛋白质组学的定义蛋白质组与蛋白质组学的定义第二节第二节 蛋白质组及其质点的分离与分析蛋白质组及其质点的分离与分析第三节第三节 蛋白质相互作用的研究蛋白质相互作用的研究第四节第四节 蛋白质数据库及其应用蛋白质数据库及其应用 第一节第一节 蛋白质组与蛋白质组学的定义蛋白质组与蛋白质组学的定义 蛋白

2、质组蛋白质组 proteprotein + genin + genomeome proteomeproteome 一种基因组所表达的全部蛋白质一种基因组所表达的全部蛋白质 一个细胞或一个机体的基因所表达的全部蛋白质一个细胞或一个机体的基因所表达的全部蛋白质蛋白质组学蛋白质组学 阐明生物体全部蛋白质的表达模式与功能模式阐明生物体全部蛋白质的表达模式与功能模式 从整体的角度分析、鉴定细胞内动态变化的蛋白质从整体的角度分析、鉴定细胞内动态变化的蛋白质的组成、结构、性质、表达水平与修饰状态的组成、结构、性质、表达水平与修饰状态 了解蛋白质之间、蛋白质与大分子之间的相互作用了解蛋白质之间、蛋白质与大分子

3、之间的相互作用与联系与联系, ,揭示蛋白质的功能与细胞生命活动的规律揭示蛋白质的功能与细胞生命活动的规律 一、蛋白质组与蛋白质组学的定义一、蛋白质组与蛋白质组学的定义 一、分离纯化一、分离纯化第二节第二节 蛋白质组及其质点的分离与分析蛋白质组及其质点的分离与分析二、分析鉴定二、分析鉴定一、一、 分分 离离 纯纯 化化 （二）破碎细胞（二）破碎细胞 （三）蛋白质混合物的分离方法（三）蛋白质混合物的分离方法 （四）蛋白质分离纯化的条件（四）蛋白质分离纯化的条件 （一）选择材料（一）选择材料 目的蛋白质的含量目的蛋白质的含量 提取蛋白质的材料提取蛋白质的材料一、分一、分 离离 纯纯 化化 （一）选择

4、材料（一）选择材料 一、分一、分 离离 纯纯 化化（二）破碎细胞（二）破碎细胞 机械法机械法 物理法物理法 化学法化学法 根据蛋白质溶解度、分子大小及形状、电离性根据蛋白质溶解度、分子大小及形状、电离性 质、生物学功能的差异进行：质、生物学功能的差异进行： 1.1.根据溶解度根据溶解度 2.2.根据分子量根据分子量 透析和超滤透析和超滤 平衡离心平衡离心 凝胶过滤层析凝胶过滤层析 （三）蛋白质混合物的分离方法（三）蛋白质混合物的分离方法一、分一、分 离离 纯纯 化化3.3.根据电荷根据电荷 毛细管电泳毛细管电泳 离子交换层析离子交换层析4.4.根据蛋白质的亲和能力根据蛋白质的亲和能力 亲和层析

5、亲和层析一、分一、分 离离 纯纯 化化（四）（四） 蛋白质分离纯化的条件蛋白质分离纯化的条件 缓冲液缓冲液 盐、金属离子和螯合剂盐、金属离子和螯合剂 还原剂还原剂 去垢剂去垢剂 蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂 表面效应表面效应 蛋白质的环境因素蛋白质的环境因素 温度温度 储存储存 一、一、 分分 离离 纯纯 化化二、分析鉴定二、分析鉴定 （三）图像分析技术（三）图像分析技术（四）放射性核素标记亲和标签法（四）放射性核素标记亲和标签法（五）蛋白质芯片技术（五）蛋白质芯片技术（六）质谱技术（六）质谱技术 （一）（一）westernwestern印迹技术印迹技术 （二）二维凝胶电泳（二）二维凝胶电泳（2-

6、de2-de）技术）技术（七）其它方法（七）其它方法二、分析鉴定二、分析鉴定（一）（一）westernwestern印迹技术印迹技术基本操作步骤：基本操作步骤： 蛋白样品的制备蛋白样品的制备 sdssds聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质的电转移蛋白质的电转移蛋白质与抗体的结合反应蛋白质与抗体的结合反应 目标蛋白质的显示目标蛋白质的显示western western 印迹基本步骤图示印迹基本步骤图示（二）二维凝胶电泳（二）二维凝胶电泳（2-de)2-de)技术技术 目前蛋白质组研究中最有效的分析鉴定技术之一目前蛋白质组研究中最有效的分析鉴定技术之一 由两相组成：由两相组成： 第一相：

7、等电聚焦凝胶电泳第一相：等电聚焦凝胶电泳 ( (根据蛋白质电荷差异根据蛋白质电荷差异) ) 第二相：第二相：sdssds聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( (根据蛋白质分子量差异根据蛋白质分子量差异) )二、分析鉴定二、分析鉴定二、分析鉴定二、分析鉴定2-de 技术原理技术原理2-de2-de分析的基本步骤分析的基本步骤蛋白质蛋白质溶解溶解变性变性还原还原去除蛋白去除蛋白质杂志质杂志利用不同利用不同pkpk固定化固定化电解质配电解质配置不同置不同phph范围的凝范围的凝胶胶利用软件利用软件设计配置设计配置 第一相电泳第一相电泳(ipg(ipgife)ife)平衡平衡第二相电泳第二相电泳(

8、sds(sdspage)page)考马斯亮考马斯亮蓝染色蓝染色银染色银染色铜染色铜染色样品制备样品制备ipgipg胶制备胶制备双相电泳双相电泳染色染色二、分析鉴定二、分析鉴定2-de2-de获得的蛋白质图谱获得的蛋白质图谱二、分析鉴定二、分析鉴定 通过通过2-de2-de得到的蛋白质分离图谱，需要经过得到的蛋白质分离图谱，需要经过摄像或扫描转换为以像素为基础的、具有不同灰摄像或扫描转换为以像素为基础的、具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点电脑信号。度强弱和一定边界方向的斑点电脑信号。 ( (三三) )图像分析技术图像分析技术二、分析鉴定二、分析鉴定 2-de2-de图像分析软件包操作过程：图像

9、分析软件包操作过程： 图像采集图像采集斑点检测斑点检测背景消减背景消减获得蛋白质相关信息获得蛋白质相关信息图像内及图像间的比较图像内及图像间的比较二、分析鉴定二、分析鉴定 （四）放射性核素标记亲和标签法（四）放射性核素标记亲和标签法正常细胞正常细胞 d0d0亲和标签亲和标签病理细胞病理细胞 d8d8亲和标签亲和标签混合并消化混合并消化生物素亲和纯化生物素亲和纯化液相色谱质谱联用分析液相色谱质谱联用分析测量两个不同样品中蛋白质的相对丰度测量两个不同样品中蛋白质的相对丰度二、分析鉴定二、分析鉴定（五）蛋白质芯片技术（五）蛋白质芯片技术二、分析鉴定二、分析鉴定 原理原理 样品分子离子化后，根据不同离

10、子间的质量样品分子离子化后，根据不同离子间的质量和电荷比值（和电荷比值（m/em/e）的差异确定分子量。）的差异确定分子量。 应用应用 蛋白质的序列分析蛋白质的序列分析 研究蛋白质的修饰研究蛋白质的修饰（六）质谱技术（六）质谱技术二、分析鉴定二、分析鉴定 （七）（七） 其它方法其它方法 edmanedman降解法测定蛋白质多肽的排列顺序降解法测定蛋白质多肽的排列顺序 核磁共振（核磁共振（nmrnmr）、荧光光谱法测定溶液中蛋白荧光光谱法测定溶液中蛋白质分子的结构质分子的结构 x x射线衍射分析法、小角中子衍射法测定晶体蛋射线衍射分析法、小角中子衍射法测定晶体蛋白质的分子结构等白质的分子结构等二

11、、分析鉴定二、分析鉴定第三节第三节蛋白质相互作用的研究蛋白质相互作用的研究二、蛋白质核酸二、蛋白质核酸一、蛋白质蛋白质一、蛋白质蛋白质一、蛋白质蛋白质一、蛋白质蛋白质（二）蛋白质之间的相互作用力（二）蛋白质之间的相互作用力（三）蛋白质相互作用的研究方法（三）蛋白质相互作用的研究方法（一）蛋白质（一）蛋白质- -蛋白质相互作用的形式蛋白质相互作用的形式（一）蛋白质（一）蛋白质- -蛋白质相互作用的形式蛋白质相互作用的形式 1.1.蛋白质亚基的聚合蛋白质亚基的聚合 2.2.交叉聚合交叉聚合 3.3.分子识别分子识别 4.4.分子的自我装配分子的自我装配 5.5.多酶复合体多酶复合体一、蛋白质蛋白质

12、一、蛋白质蛋白质（二）蛋白质之间的相互作用力（二）蛋白质之间的相互作用力 氢键氢键 范德华力范德华力 疏水键疏水键 离子键离子键一、蛋白质蛋白质一、蛋白质蛋白质一、蛋白质蛋白质一、蛋白质蛋白质（三）蛋白质相互作用的研究方法（三）蛋白质相互作用的研究方法 1.1.酵母双杂交系统酵母双杂交系统 2.2.噬菌体展示噬菌体展示 3.3.生物传感芯片质谱生物传感芯片质谱 4.4.定点诱变技术定点诱变技术 蛋白质亲和层析蛋白质亲和层析 亲和印迹亲和印迹 免疫沉淀免疫沉淀 交联交联 酵母双杂交酵母双杂交 噬菌体展示噬菌体展示 生物传感芯片质谱生物传感芯片质谱 蛋白质工程中的定点诱变技术蛋白质工程中的定点诱变

13、技术 一、蛋白质蛋白质一、蛋白质蛋白质研究方法研究方法传统技术传统技术新技术新技术 1. 1.酵母双杂交系统酵母双杂交系统 dna-bd dna-bd具有与报告具有与报告基因转录调控区特异结基因转录调控区特异结合的功能，合的功能，dna-addna-ad则具则具有活化转录的功能。有活化转录的功能。报告基因一、蛋白质蛋白质一、蛋白质蛋白质 dna-bddna-bd和和dna-addna-ad分开时不能激活转录，只有分开时不能激活转录，只有当两者在空间上接近时，才能呈现转录因子当两者在空间上接近时，才能呈现转录因子的活性。的活性。 只有当蛋白质只有当蛋白质x x与蛋白质与蛋白质y y间发生相互作用

14、时，间发生相互作用时，才能激活报告基因的转录，而当两者单独作才能激活报告基因的转录，而当两者单独作用时均无此功能用时均无此功能 。一、蛋白质蛋白质一、蛋白质蛋白质二、蛋白质二、蛋白质- -核酸核酸（二）滤膜结合（二）滤膜结合（三）甲基化干扰（三）甲基化干扰（四）（四）dnase足纹足纹（五）核酸（五）核酸-蛋白质杂交蛋白质杂交（一）凝胶滞后试验（一）凝胶滞后试验二、蛋白质二、蛋白质- -核酸核酸（一）凝胶滞后试验一）凝胶滞后试验 蛋白质可以与末端标记的核蛋白质可以与末端标记的核酸探针特异性结合，所形成酸探针特异性结合，所形成的复合物电泳时在凝胶中的的复合物电泳时在凝胶中的泳动速度比未与蛋白结合

15、的泳动速度比未与蛋白结合的游离探针慢，即表现为相对游离探针慢，即表现为相对滞后滞后 该实验可以评价蛋白与核酸该实验可以评价蛋白与核酸结合的特异性结合的特异性（二）滤膜结合法（二）滤膜结合法 利用硝酸纤维素滤膜不能结合双链利用硝酸纤维素滤膜不能结合双链dnadna，但，但可与蛋白质结合的特性，将与蛋白质结合的可与蛋白质结合的特性，将与蛋白质结合的dnadna片段与游离片段与游离dnadna片段分离开。片段分离开。二、蛋白质二、蛋白质- -核酸核酸（三）甲基化干扰（三）甲基化干扰 经甲基化修饰的经甲基化修饰的dnadna探针探针可以干扰蛋白质的结合。将可以干扰蛋白质的结合。将dna dna 甲基化

16、后与蛋白质进行甲基化后与蛋白质进行反应，只有在结合位点上未反应，只有在结合位点上未被修饰的被修饰的dna dna 片段才能与蛋片段才能与蛋白质结合。白质结合。dnadna探针的末端标记探针的末端标记及探针的甲基化及探针的甲基化蛋白质与甲基化探针的结合及蛋白质与甲基化探针的结合及 dnadna蛋白质结合探针的分离蛋白质结合探针的分离结合物及对照探针结合物及对照探针的化学切割的化学切割dnadna片段的序列测定片段的序列测定二、蛋白质二、蛋白质- -核酸核酸二、蛋白质二、蛋白质- -核酸核酸 用特殊方法将用特殊方法将dnadna从被修饰的碱基处进行切从被修饰的碱基处进行切割，并经电泳分离，由于未结

17、合蛋白质的割，并经电泳分离，由于未结合蛋白质的dnadna可可在随机修饰的位点被切割，而结合蛋白质的在随机修饰的位点被切割，而结合蛋白质的dnadna在结合位点上未被修饰而不能被切割，由此可在结合位点上未被修饰而不能被切割，由此可获得蛋白质与核酸定位结合的信息。获得蛋白质与核酸定位结合的信息。 （三）甲基化干扰（三）甲基化干扰（四）（四）dnasednase足纹足纹 目前广泛用于蛋白质精确结合位点的研究方法目前广泛用于蛋白质精确结合位点的研究方法 原理：原理： dnasednase可以随机水解核苷酸中的磷酸二可以随机水解核苷酸中的磷酸二酯键，将酯键，将dnadna切成单核苷酸，而结合有蛋白质切

18、成单核苷酸，而结合有蛋白质的的dnadna免于免于dnasednase的水解。的水解。 二、蛋白质二、蛋白质- -核酸核酸（五）核酸（五）核酸- -蛋白质杂交实验蛋白质杂交实验tbetbe缓冲液中缓冲液中dnadna蛋白质杂交蛋白质杂交放射自显影放射自显影 用于鉴定蛋白质与用于鉴定蛋白质与dnadna的特异性结合和确定结合蛋白的特异性结合和确定结合蛋白质的分子量。质的分子量。 基本步骤：基本步骤：蛋白质杂交蛋白质杂交sds-pagesds-page转移至转移至ncnc膜或膜或nylonnylon膜膜缓慢复性、封闭、预杂交缓慢复性、封闭、预杂交加入同位素标记的加入同位素标记的dnadna片段作探

19、针片段作探针多次洗膜多次洗膜二、蛋白质二、蛋白质- -核酸核酸二、蛋白质数据库的应用二、蛋白质数据库的应用一、蛋白质数据库一、蛋白质数据库(protein database)(protein database)一、蛋白质数据库一、蛋白质数据库（一）蛋白质序列数据库（一）蛋白质序列数据库（二）蛋白质结构数据库（二）蛋白质结构数据库（三）蛋白质直系同源簇数据库（三）蛋白质直系同源簇数据库（四）（四）dipdip数据库数据库一、蛋白质数据库一、蛋白质数据库（一）蛋白质序列数据库（一）蛋白质序列数据库 swiss-protswiss-prot数据库：数据库： http:/www.ebi.ac.uk/swissprothttp:/www.ebi.ac.uk/swissprot pir pir和和psdpsd数据库数据库 // ftp: