限制性酶切与连接

1、 一种能够结合外源dna 片段形成重组dna，并能进行自我复制的dna 分子称为vectors主要载体：质粒、噬菌体、病毒功能：克隆载体（构建基因组文库或cdna 文库）、测序载体、表达载体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒。 随着生物技术的发展和科学研究的深入，不断出现具有不同功能的新载体，如可以容纳几百万碱基的酵母人工染色体载体（vectors）如何构建所需要的载体？如何构建所需要的载体？酶切酶切 连接等技术连接等技术一、一、dnadna的限制性酶切实验原理的限制性酶切实验原理n核酸限制性内切酶是一类能识别双链中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，功能犹似高等功物免疫系

2、统， 用于抗击外来侵袭。n限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产生的片段端为，端为。n根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为、型三大类。n第一类（i型）限制性内切酶能识别专一核苷酸顺序，在识别位点很远的地方任意切割dna链，切割核苷酸顺序没有专一性，随机。这类限制性内切酶在dna重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析dna结构或克隆基因。这类酶如ecob、ecok等。n第三类（iii型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度dna片段，具

3、有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。1. 限制性内切酶的类型限制性内切酶的类型n第二类（型）限制性内切酶就是通常指的限制性内切酶.n 它们能识别双链的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的片段； n型酶分子量较小，仅需mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为个碱基对的反转重复顺序； n型内切酶切割双链产生种不同的切口端突出、端突出和平末端。n限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。1. 限制性内切酶的类型限制性内切酶的类型粘性末端粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的

4、，可形成氢键，所以称为粘性末端。如ecori的识别顺序为： 5 g| |aattc 3 3 cttaa| |g 5在双链上交错切割的位置切割后生成 5g aattc3 3cttaa g5各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过dna连接酶的作用而“粘合”。ii型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如ecorv 的识别位置是： 5 gat| |atc 33 cta| |tag 5 切割后形成5 gat atc 33 cta tag 5 这种末端同样可以通过dna连接酶连接起来。平头末端：平头末端：限制性内限制性内切酶切酶酶分子酶分子识别位点识别位

5、点切割位点切割位点 限制作用限制作用是否需用是否需用 atp类类 三亚基双三亚基双功能酶功能酶 二 分 非 对二 分 非 对称称至 少 在 识至 少 在 识别 位 点 外别 位 点 外 1000bpyes类类内 切 酶 与内 切 酶 与甲 基 化 酶甲 基 化 酶分 子 不 在分 子 不 在一起一起4-6bp, 大大多 数 为 回多 数 为 回文 对 称 结文 对 称 结构构 在 识 别 位在 识 别 位点 中 或 靠点 中 或 靠近 识 别 位近 识 别 位点 无 特 异点 无 特 异性性no类类二 亚 基 双二 亚 基 双功能酶功能酶 5-7 bp 非非对称对称在 识 别 位在 识 别 位

6、点下游点下游 24-26bpyesv 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如主菌的物种名称，如e. colie. coli 用用ecoeco表示，所以用斜表示，所以用斜体字。体字。v 用 一 个 字 母 代 表 菌 株 或 型 ， 如 流 感 嗜 血 菌用 一 个 字 母 代 表 菌 株 或 型 ， 如 流 感 嗜 血 菌(heamophilus influenzae)rd(heamophilus influenzae)rd菌株用菌株用d d，即，即hinhind d。v 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制如果一种特殊的寄

7、主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如与修饰酶，则以罗马数字表示，如hinhind, d, hinhindd，hinhindd等。等。2. 2. 限制性核酸内切酶的命名法限制性核酸内切酶的命名法由由 puc18puc18改造而来，大小为改造而来，大小为 3162bp 3162bp 。相当于在。相当于在 puc18puc18中增加了带有中增加了带有 m13 m13 噬菌体噬菌体 dna dna 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。内切酶：内切酶：n不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；不应混

8、有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染；n 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；n内切酶的用量：根据内切酶单位和用量而定，通常内切酶的用量：根据内切酶单位和用量而定，通常 1u1u指在适当条件下，指在适当条件下，1 1小时内完全酶解小时内完全酶解ugug特定底物特定底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以所需要的限制性内切酶量，使用中一般以ug dnaug dna对对u u酶短时间为宜。酶短时间为宜。n同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含同时内切酶体积不能超过反应体系，因内切酶中含甘油，体系中甘油超过会抑制内切酶活力；甘油，体系中甘油超过会抑

9、制内切酶活力；n 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。对内切酶的污染。n作为内切酶底物，应该具备一定的纯度，其溶液中不作为内切酶底物，应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、能含酚、氯仿、乙醚、sdssds、edtaedta、高盐浓度、酒精等，这、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。n这种抑制可通过：这种抑制可通过： 增加酶作用单位数（增加酶作用单位数（1020u/ug dna1020u/ug dna）、）、 增大反应体积以稀释可

10、能的抑制剂增大反应体积以稀释可能的抑制剂 或延长反应时间加以克服。或延长反应时间加以克服。：n反应缓冲液主要由反应缓冲液主要由trishcltrishcl、naclnacl、mg2mg2+ +组成，其中组成，其中mg2mg2+ +为内切酶辅基；为内切酶辅基；ntrishcltrishcl维持反应体系维持反应体系phph值在值在7.2-7.67.2-7.6之间；之间；nnaclnacl浓度不同形成种级别的离子强度：浓度不同形成种级别的离子强度： 低盐（低盐（10mm nacl)10mm nacl) 中盐（中盐（50mm nacl50mm nacl） 高盐（高盐（100mm nacl100mm n

11、acl）n 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。反应缓冲液：反应缓冲液：ligaseligase又称合成酶，能催化两个分子连接成一个分子或把一个分子的首尾相连接的酶。此反应与atp的分解反应相偶联。在把两分子相连接的同时发生三磷酸腺苷（atp)的高能磷酸键的断裂如dna连接酶等 连接酶的催化反应过程需要mg离子 t4 dna 连接酶催化双链dna相邻核苷酸的5-磷酸和3-羟基之间的连接，平端和粘端都可被连接。本酶也能催化rna 连接到 dna 或者双链rna 上，但不催化单链核酸的连接。 把一个片段克隆到质粒载体时，采用1:1, 1:3或 3:1 的载体:插入片

12、段摩尔比 反应体系：反应体系：载体载体 dna 100ng插入片段插入片段dna 17ng连接酶连接酶 10x 缓冲液缓冲液 1lt4 dna 连接酶连接酶 (weiss 单位单位) 0.11u无核酸酶水加至无核酸酶水加至 10ul2. 孵育反应于：室温下孵育反应于：室温下3 小时，或小时，或4c 过夜，或过夜，或15c，418 小时。小时。质粒质粒puc18 dnapuc18 dnapcrpcr产物产物hindhind内切酶内切酶hind hind 10 x bufferddh2o反应体系反应体系质粒质粒puc18 dna 2 lpuc18 dna 2 lpcrpcr产物产物 2 l2 lh

13、indhind内切酶内切酶 2 l2 lhind hind 10 x buffer 2 l2 lddh2o 12 l12 l总体系为总体系为20 l20 l，混匀，混匀反应步骤反应步骤3737c c 酶切酶切2h2h（各位老师上课只要求（各位老师上课只要求1h1h，自，自己改一下）己改一下）6565c c 灭活灭活10min10min琼脂糖电泳检测琼脂糖电泳检测内切酶失活内切酶失活dnadna不纯，含有不纯，含有sdssds，酚，酚，edtaedta等内切酶抑制因子等内切酶抑制因子条件不适（试剂、温度）条件不适（试剂、温度）dnadna酶切位点上的碱基被酶切位点上的碱基被甲基化甲基化dnadn

14、a酶切位点上没有甲基酶切位点上没有甲基化（如化（如dpn idpn i）dnadna位点上存在其它修饰位点上存在其它修饰dnadna不存在该酶识别顺序不存在该酶识别顺序标准底物检测酶活性标准底物检测酶活性将将dnadna过柱纯化，乙醇沉淀过柱纯化，乙醇沉淀dnadna检查反应系统是否最佳检查反应系统是否最佳换用对换用对dnadna甲基化不敏感的同裂甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒酶酶解，重新将质粒dnadna转化至转化至dcm-dcm-，dam-dam-基因型的细菌菌株基因型的细菌菌株换用不同切割非甲基化位点的同裂换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化酶消化dnadna（如（如san3a i

15、san3a i代替代替dpn dpn i) i)，重新将质粒转至，重新将质粒转至dcm+ dam+dcm+ dam+菌菌株中扩增株中扩增将将dnadna底物与底物与dandan混匀进行切混匀进行切割验证割验证换用其它的酶切割换用其它的酶切割dnadna或过量酶或过量酶消化进行验证消化进行验证q问题一：问题一：dnadna完全没有被内切酶切割完全没有被内切酶切割 原原因因对对策策内切酶活性下降内切酶活性下降内切酶稀释不正确内切酶稀释不正确dnadna不纯，反应条件不佳不纯，反应条件不佳内切酶识别的内切酶识别的dnadna位点上的碱位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰基被甲基化或存在其它修饰部分部分

16、dnadna溶液粘在管壁上溶液粘在管壁上内切酶溶液粘度大，取样不准内切酶溶液粘度大，取样不准酶切后酶切后dnadna粘末端退火粘末端退火由于反应溶液、温度、强烈振由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性荡使内切酶变性过度稀释使酶活性降低过度稀释使酶活性降低反应条件不适反应条件不适识别位点两侧插入了可影响酶识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序切效率的核酸顺序用用5-105-10倍量过量消化倍量过量消化用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶同上同上同上同上反应前离心数秒反应前离心数秒将内切酶稀释，增大取样体积将内切酶稀释，增大取样体积电泳前将样品置电泳前将样品置6565保温

17、保温5-105-10分分钟，取出后置冰浴骤冷钟，取出后置冰浴骤冷使用标准反应缓冲液及温度，避使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡免强烈振荡适当稀释酶液，反应液稀释的酶适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏不能贮藏使用最佳反应体系使用最佳反应体系加大酶量加大酶量5-105-10倍倍q问题二：问题二：dnadna切割不完全切割不完全 原原因因对对策策内切酶星状活性内切酶星状活性其它内切酶污染其它内切酶污染底物中含其它底物中含其它dnadna杂质杂质检查反应条件：甘油浓度大于检查反应条件：甘油浓度大于12%12%，盐度过低，盐度过低，mn2+mn2+的存在及酶：的存在及酶：dnadna值过大均均可导

18、致星状活性值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量，降低酶的用量用用dnadna作底物检查酶切结果作底物检查酶切结果电泳检查电泳检查dnadna，换用其它酶切，换用其它酶切，纯化纯化dnadna片段片段q问题三：问题三：dnadna片段数目多于理论值片段数目多于理论值 原原因因对对策策dnadna定量错误（如定量错误（如rnarna含量较高）含量较高）在酶切反应液中形成非在酶切反应液中形成非特异的沉淀特异的沉淀用用rnarna酶酶a a（无（无dnadna酶）酶）100ug/ml100ug/ml消化消化dnadna样，酚抽提样，酚抽提后沉淀溶解，定量后沉淀溶解，定量在反应前透析在反应前透析dna

19、dna样品或用酒精样品或用酒精沉淀二次沉淀二次q问题四：酶切后没有观察到问题四：酶切后没有观察到dnadna片段的存在片段的存在 原原因因对对策策保存温度不合适保存温度不合适以稀释形式保存以稀释形式保存贮藏缓冲液不适当贮藏缓冲液不适当低蛋白浓度低蛋白浓度内切酶贮藏在含内切酶贮藏在含50%50%甘油的甘油的贮藏液中，应在贮藏液中，应在-20-20低温保低温保存存稀释酶液不宜长期存放，应一稀释酶液不宜长期存放，应一次使用次使用使用厂家推荐的贮藏缓冲液使用厂家推荐的贮藏缓冲液内切酶与内切酶与500ug/ml500ug/ml的的bsabsa一起一起保存保存q问题五：内切酶保存期内快速失活问题五：内切酶

20、保存期内快速失活 原原因因对对策策dnadna上结合有蛋白质上结合有蛋白质内切酶中含有内切酶中含有dnadna外外切酶切酶减少酶用量或消化时间，换减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶用新包装的酶减少酶用量或消化时间，换减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶用新包装的酶q问题六：电泳后问题六：电泳后dnadna片段的带型弥散，不均一片段的带型弥散，不均一 原原因因对对策策dnadna电泳常见问题分析电泳常见问题分析含磷酸盐的浓度高含磷酸盐的浓度高内切酶失活不全或含有内切酶失活不全或含有atpatp酶酶平末端连接平末端连接外切酶污染外切酶污染连接缓冲液不合适连接缓冲液不合适透析，乙醇沉淀去除磷酸盐透

21、析，乙醇沉淀去除磷酸盐延长灭活时间或用酚抽提，乙延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收醇沉淀回收dnadna加大加大t4 dna ligaset4 dna ligase用量用量减少酶用量，缩短保温时间，减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收酚抽提回收dnadna重新配制连接缓冲液重新配制连接缓冲液q问题七：酶切后的问题七：酶切后的dnadna片段连接效率低片段连接效率低 原原因因对对策策dnadna降解降解电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液陈旧所用电泳条件不合适所用电泳条件不合适dnadna上样量过多上样量过多dnadna样含盐过高样含盐过高有蛋白污染有蛋白污染dnadna变性变性避免核酸酶污染避免核酸酶污

22、染电泳缓冲液多次使用后，离子强度电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，降低，phph值上升，缓冲能力减弱值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液换电泳缓冲液电泳时电压不应超过电泳时电压不应超过20v/cm20v/cm，温，温度度3030；巨大；巨大dnadna链电泳，温链电泳，温度应度应1515；核查所用电泳缓冲液；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力是否有足够的缓冲能力减少凝胶中减少凝胶中dnadna上样量上样量电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐电泳前酚抽提去除蛋白电泳前酚抽提去除蛋白电泳前勿加热，用电泳前勿加热，用20mm nacl20mm nacl缓缓冲液稀释冲液稀释dnadnaq问题一：问题一：dnadna带模糊带模糊 原原因因对对策策对于对于/hinhind iiid iii片段片段coscos位位点复性点复性电泳条件不合适电泳条件不合适dnadna变性变性电泳前于电泳前于6565加热加热d