实验五过氧化物同工酶PAGE分析

1、实实 验验 五五 过氧化物同工酶聚丙烯酰胺凝过氧化物同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳（胶电泳（pagepage）分析）分析（p p9898）一、目的一、目的l掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳（掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳（pagepage）技术）技术的原理和操作方法的原理和操作方法l掌握掌握pagepage法分离过氧化物同工酶的原理法分离过氧化物同工酶的原理和方法和方法二、原理二、原理l聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（pagepage）l过氧化物同工酶及活性染色过氧化物同工酶及活性染色（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（pagepage）p p2020 + +- -+ +- -（一）聚丙烯酰胺凝

2、胶电泳（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（pagepage）2.2.电泳分类电泳分类l显微电泳显微电泳l自由界面电泳自由界面电泳l区带电泳区带电泳纸电泳纸电泳醋酸薄膜电泳醋酸薄膜电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（pagepage）（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（pagepage）3.3.电泳法原理电泳法原理 在一定条件下，任何带点颗粒都有自己特定的在一定条件下，任何带点颗粒都有自己特定的电泳迁移率。影响电泳迁移率的因素：电泳迁移率。影响电泳迁移率的因素：l颗粒性质：颗粒性质：净电荷数目净电荷数目颗粒大小颗粒大小颗粒形状颗粒形状l电场强度：电场强度：

3、v/cmv/cml溶液性质：溶液性质：缓冲液的缓冲液的phph离子强度离子强度溶液黏度溶液黏度电渗：液体对固体支持物的相对移动电渗：液体对固体支持物的相对移动l聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（单体丙烯酰胺（acracr）和和交联交联剂剂n,n-n,n-甲叉双丙烯酰胺（甲叉双丙烯酰胺（bisbis）在在加速剂加速剂 n,n,n,n-n,n,n,n-四甲基乙二胺（四甲基乙二胺（temedtemed）和和催化剂过硫酸铵（催化剂过硫酸铵（apap）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳胶为支持物的

4、电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis(polyacrylamide gel electrophoresis，简称，简称page)page)（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（一）聚丙烯酰胺凝胶电泳（pagepage）4.4.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳反应过程反应过程ltemedtemed催化催化apap生成硫酸自由基生成硫酸自由基 s s2 2o o8 82 2 2so2so4 4 l硫酸自由基的氧原子激活硫酸自由基的氧原子激活acracr单体并形成单体单体并形成单体长链：长链：lbisbis将单体长链间连成网状结构：将单体长链间连成

5、网状结构：pagepage法分离蛋白质的三种效应法分离蛋白质的三种效应l电荷效应电荷效应：各种蛋白质分子所带电荷不同，在：各种蛋白质分子所带电荷不同，在同一电场中泳动率不同；同一电场中泳动率不同；l分子筛效应分子筛效应；蛋白质分子大小和形状各不相同，；蛋白质分子大小和形状各不相同，在通过一定浓度（一定孔径）凝胶时受阻力各在通过一定浓度（一定孔径）凝胶时受阻力各不相同，泳动率也不相同；不相同，泳动率也不相同；l浓缩效应浓缩效应：凝胶为不连续系统（凝胶层、：凝胶为不连续系统（凝胶层、phph、电位梯度均不连续），从而使样品浓缩在一个电位梯度均不连续），从而使样品浓缩在一个极窄的起始区带，即所谓浓缩

6、效应，提高了条极窄的起始区带，即所谓浓缩效应，提高了条带分辩率。（带分辩率。（只有不连续凝胶具有此效应只有不连续凝胶具有此效应） （二）过氧化物同工酶及其活性染色（二）过氧化物同工酶及其活性染色（p p9898）l同工酶同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构及其理化性质不同的一组酶。分子结构及其理化性质不同的一组酶。l同功酶是机体调节酶活性的一种方式，在各种生物体中同功酶是机体调节酶活性的一种方式，在各种生物体中广泛存在。广泛存在。l过氧化物酶过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。它

7、与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。一时期植物体内代谢的变化。l本实验采用本实验采用pagepage技术，分离小麦幼苗过氧化物酶技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方法同工酶，根据酶的生物化学反应，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物

8、酶同工酶。酶同工酶。过氧化物过氧化物+ +过氧化物酶过氧化物酶 复合物复合物复合物复合物+dh+dh2 2 过氧化物酶过氧化物酶+h+h2 2o+do+dh h2 2o o2 2联苯胺联苯胺棕色物质棕色物质（二）过氧化物同工酶及其活性染色（二）过氧化物同工酶及其活性染色（p p9898）三、材料、仪器和试剂三、材料、仪器和试剂l材料：小麦幼苗材料：小麦幼苗l仪器：电泳仪、仪器：电泳仪、电泳槽、高速离电泳槽、高速离心机、量筒、烧心机、量筒、烧杯、微量注射器、杯、微量注射器、研钵、染色盒研钵、染色盒三、材料、仪器和试剂三、材料、仪器和试剂试剂：试剂：la a液：液：30%acr-0.8%bis30

9、%acr-0.8%bislb b液：液：tris+edtatris+edtalc c液：液：temedtemedld d液：液：10%ap10%apl电极缓冲液：硼酸钠电极缓冲液：硼酸钠- -硼酸（硼酸（ph8.3ph8.3）l0.5%0.5%溴酚蓝溴酚蓝l染色液：染色液：0.1%0.1%联苯胺联苯胺l样品提取液：样品提取液：ph8.0tris-hclph8.0tris-hcl缓冲液缓冲液l40%40%蔗糖溶液蔗糖溶液四、操作步骤四、操作步骤l凝胶制备凝胶制备 聚丙烯酰胺凝胶配方聚丙烯酰胺凝胶配方 成分成分 含量含量 作用作用 a a液（液（30%acr-0.8%bis30%acr-0.8%b

10、is） 2.65ml 2.65ml 交联剂交联剂 b b液（液（tris+edtatris+edta） 4.75ml 4.75ml 缓冲液缓冲液 c c液（液（temedtemed） 10l 10l 加速剂加速剂 d d液（液（10% ap10% ap） 50l 50l 催化剂催化剂四、操作步骤四、操作步骤l样品制备样品制备 称取小麦幼苗叶片称取小麦幼苗叶片0.5 0.5 克，放入研钵克，放入研钵内，加内，加 ph8.0 ph8.0 样品提取液样品提取液1ml1ml，于冰浴中，于冰浴中研成匀浆，转入离心管，在高速离心机上研成匀浆，转入离心管，在高速离心机上以以 8000rpm 8000rpm

11、离心离心 10 10 分钟，倒出上清液，分钟，倒出上清液，以等量以等量 40%40%蔗糖混合，并加蔗糖混合，并加2 2滴溴酚蓝，滴溴酚蓝，即为样品液。即为样品液。四、操作步骤四、操作步骤l装槽、上样装槽、上样 30-50l30-50l四、操作步骤四、操作步骤l电泳电泳 接好电源线接好电源线( (上槽接负极，下槽接正上槽接负极，下槽接正极极) )。打开电源开关，调节电压，以。打开电源开关，调节电压，以10v/cm10v/cm稳定电压电泳，待前沿指示染料溴稳定电压电泳，待前沿指示染料溴酚蓝下行至距胶板末端酚蓝下行至距胶板末端1-2 1-2 厘米处，即可厘米处，即可停止电泳。停止电泳。四、操作步骤四、操作步骤l剥胶、染色剥胶、染色 电泳结束之后，将垂直板从电泳槽上电泳结束之后，将垂直板从电泳槽上取下，小心地将两块玻璃板分开，并小心取下，小心地将两块玻璃板分开，并小心地