革兰氏染色与荚膜染色

1、 革兰氏染色与荚膜染色革兰氏染色与荚膜染色n1、掌握革兰氏染色法和细菌荚膜染色法。、掌握革兰氏染色法和细菌荚膜染色法。n2、观察菌体的一些简单结构。、观察菌体的一些简单结构。二、实验原理二、实验原理一、目的与要求：一、目的与要求：（一）革兰氏染色法原理（一）革兰氏染色法原理n 革兰氏染色法是革兰氏染色法是18841884年由丹麦病理学家年由丹麦病理学家c.gramc.gram创立的。作创立的。作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法，革兰氏染色法可将为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（g+g+）和革兰氏阴性菌（）和革兰氏阴

2、性菌（g g）两大类。两大类。n g g菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。易于渗出，结果细菌就被脱色，再经番红复染后就成红色。 n g+g+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透

3、性降低，因脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。此细菌仍保留初染时的颜色。（二）荚膜染色法原理（二）荚膜染色法原理n荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状荚膜是包围在细菌细胞外的一层粘液状或胶质状物质。物质。n由于荚膜与染料的亲和力弱，不容易着色；而且由于荚膜与染料的亲和力弱，不容易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。可溶于水，易在用水冲洗时被除去。n所以通常用衬托染色法所以通常用衬托染色法(负染色法负染色法)染色，使菌体染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，从而在菌体周围形和背景着色，而荚膜不着色，从而在菌体周围形成一透明圈。成一透明圈。n由

4、于荚膜富含水分，制片时应自然干燥，不可以由于荚膜富含水分，制片时应自然干燥，不可以加热固定，避免加热蒸发，影响观察。加热固定，避免加热蒸发，影响观察。三、实验器材三、实验器材n1 1、菌种：枯草杆菌（、菌种：枯草杆菌（bacillus subtilisbacillus subtilis），）， n 大肠杆菌（大肠杆菌（escherichia coliescherichia coli），），n 未知菌（环境中分离）（斜面培养物）未知菌（环境中分离）（斜面培养物）n褐球固氮菌（褐球固氮菌（azotobacter chroococcusazotobacter chroococcus）装片。）装片。n

5、2 2、染色液和试剂：草酸铵结晶紫、染色液和试剂：草酸铵结晶紫、卢戈氏卢戈氏碘液、碘液、95%95%乙醇、番红、二甲苯、香柏油乙醇、番红、二甲苯、香柏油n3 3、器材：显微镜、洗瓶、载玻片、接种环、酒精灯、器材：显微镜、洗瓶、载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、废液缸擦镜纸、废液缸 四、革兰氏染色法实验步骤四、革兰氏染色法实验步骤n流程路线：流程路线：n涂片涂片 干燥干燥 固定固定 草酸铵结晶草酸铵结晶紫染色紫染色1min水洗干燥水洗干燥 碘液媒染碘液媒染 1min 水洗干燥水洗干燥 95%乙醇脱色乙醇脱色 1520秒秒 水洗干燥水洗干燥 番红复染番红复染1min 水洗干燥水洗干燥 镜检镜检 (1

6、) (1)涂片涂片 干燥干燥 固定固定: :21（2）草酸铵结晶紫染色）草酸铵结晶紫染色1min 水洗干燥水洗干燥 （3）碘液媒染1min 水洗 干燥（4 4）95%95%乙醇脱色乙醇脱色15201520秒秒 水洗水洗 干燥干燥（5 5）番红复染）番红复染1min 1min 水洗水洗 干燥干燥 镜检镜检 五、注意事项：五、注意事项：n（1 1）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不）在涂片时不可过厚，否则在染色脱色时，都不易均匀，固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。易均匀，固定时，不可过热，以载玻片不烫手为宜。n（2 2）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。）严格掌握脱色程度，是革兰

7、氏染色的关键步骤。如脱色时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间如脱色时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足，革兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。不足，革兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。n（3 3）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。为准。n（4 4）染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，）染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。染色效果。n（5 5）选用幼龄的细菌。若菌龄太老，由于菌体）选用幼龄的细菌。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转

8、呈阴性反应。死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。荚膜示意图：荚膜染色步骤：荚膜染色步骤：n1、总路线：涂片 用1%结晶紫染色3分钟 用20%cuso4冲洗 镜检 2、涂片： 3、结晶紫染色： 4、cuso4冲洗：注意事项：注意事项：n（1 1）不能加热固定，否则荚膜受热失水收缩，失）不能加热固定，否则荚膜受热失水收缩，失去原形。去原形。n（2 2）涂片不要用力过猛，不要滴加水，以防破坏）涂片不要用力过猛，不要滴加水，以防破坏其荚膜原形其荚膜原形. .n(3)(3)要用要用cusocuso4 4冲洗，不要用水。冲洗，不要用水。n n第第4 4组值日组值日荚膜示意图：革兰氏染色步骤革兰氏染色步

9、骤涂片涂片 干燥干燥 固定固定 草酸铵结晶紫染色草酸铵结晶紫染色1min水洗干燥水洗干燥 碘液媒染碘液媒染 1min 水洗干燥水洗干燥 95%乙醇脱色乙醇脱色 1520秒秒 水洗干燥水洗干燥 番红复染番红复染1min 水洗干燥水洗干燥 镜检镜检荚膜染色步骤：涂片荚膜染色步骤：涂片 用用1%结晶紫染色结晶紫染色3分钟分钟 用用20%cuso4冲洗冲洗 镜检镜检1 1、细胞壁细胞壁实验报告实验报告n给出给出枯草杆菌，大肠杆菌，未知菌枯草杆菌，大肠杆菌，未知菌形态图，并形态图，并注明其革兰氏染色反应。注明其革兰氏染色反应。n绘图示褐球固氮菌的形态特征绘图示褐球固氮菌的形态特征思考题思考题1.1.哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？关键的环节是什么？ 2.2.进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题用老龄细菌染色会出现什么问题? ? 3.3.革兰氏染色时，