医学细胞生物学研究方法简述

1、第一篇第一篇 细胞生物学细胞生物学 细胞生物学概论细胞生物学概论 生命的基本单位细胞生命的基本单位细胞 细胞膜细胞膜 细胞质细胞质 细胞核细胞核第一章第一章 医学细胞生物学概论医学细胞生物学概论 研究内容研究内容研究方法研究方法第一节第一节 医学细胞生物学研究内容医学细胞生物学研究内容 细胞生物学细胞生物学是从细胞、亚是从细胞、亚细胞和分子三个水平研究细胞和分子三个水平研究生命现象和本质的科学生命现象和本质的科学 医学细胞生物学医学细胞生物学是一门专是一门专门研究与人体医学有关的门研究与人体医学有关的细胞生物学细胞生物学 形态：形态：观察和分析细观察和分析细胞内各部分的超微结胞内各部分的超微结

2、构和分子结构构和分子结构功能：功能：探索和揭示生探索和揭示生命活动的具体反应过命活动的具体反应过程，真正了解人体的程，真正了解人体的生、老、病、死等各生、老、病、死等各种生命现象。种生命现象。第二节第二节医学细胞生物学的研究方法医学细胞生物学的研究方法u显微技术显微技术 u生物化学与分子生物学技术生物化学与分子生物学技术 u细胞分离技术细胞分离技术 u细胞培养与细胞杂交细胞培养与细胞杂交一、显微技术一、显微技术 显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。两大类。 普通光学显微镜普通光学显微

3、镜 荧光显微镜荧光显微镜 细胞中有些物质，如叶绿细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可色后，经紫外线照射亦可发荧光发荧光 荧光显微镜照片荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） 激光共聚焦扫描显微镜激光共聚焦扫描显微镜 蓝色为细胞核蓝色为细胞核绿色为微管绿色为微管 激光共聚焦扫描显微镜用激光作扫描光源，由于激光束的波长较激光共聚焦扫描显微镜用激光作扫描光源，由于激光束的波长较短

4、，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的通光学显微镜的3倍。倍。 调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。品的立体结构。 暗视野显微镜暗视野显微镜照明光线不直接进人物镜，只允许被标本照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物

5、体的边缘是亮的。的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至利用这种显微镜能见到小至 4200nm的微的微粒子，分辨率可比普通显微镜高粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。倍。 相差显微镜相差显微镜把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。种结构变得清晰可见。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。色的标本和活细胞。一种介壳虫的一种介壳虫的染色体染色体 微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜 优点是能显示结构的三维立优点

6、是能显示结构的三维立体投影影像，使细胞的结构体投影影像，使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。种显微镜下进行。 倒置显微镜倒置显微镜 用于观察培养的用于观察培养的活细胞活细胞 透射电子显微镜透射电子显微镜 1932年年Ruska发明了以发明了以电子束为光源，电子束为光源，用电磁用电磁场作透镜场作透镜的电子显微镜的电子显微镜 。电子显微镜的放大倍数电子显微镜的放大倍数最

7、高可达近百万倍最高可达近百万倍 p透射电子显微镜透射电子显微镜 p扫描电子显微镜扫描电子显微镜 RER的形态的形态 显微操作显微操作/注射仪注射仪 二、生物化学与分子生物学技术二、生物化学与分子生物学技术 u细胞化学技术细胞化学技术组织化学或细胞化学染色：是利用染色剂组织化学或细胞化学染色：是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，对某种成分进行定性或定位研究原理，对某种成分进行定性或定位研究的技术。的技术。利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、

8、脂类、核酸、酶等。类、脂类、核酸、酶等。 u免疫细胞化学免疫细胞化学根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。一结合，对抗原进行定位测定的技术。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。出该抗原存在于组织中的部位。常用的标记物有荧光素和酶。常用的标记物有荧光素和酶。荧光素标记的称为荧光素标记的称为免疫荧光法免疫荧光法酶标记的称为酶标记的称为酶标免疫法酶标免疫法u显微光谱分析技术显微光谱分析技术细胞中有一

9、些成分具有特定的吸收光谱，细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。例如，核酸的吸自己特征性的吸收曲线。例如，核酸的吸收波长为收波长为260nm，而蛋白质的则为，而蛋白质的则为280nm。根据细胞成分所具有的这种特性，可利用根据细胞成分所具有的这种特性，可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定显微分光光度计对某些成分进行定位、定性，甚至定量测定性，甚至定量测定 u放射自显影术放射自显影术用于研究标记化合物在机体、组织和细胞用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、中的分布、定

10、位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。作用机理、作用部位等等。原理是将放射性同位素（如原理是将放射性同位素（如14C和和3H）标记）标记的化合物导入生物体内，将标本制成切片的化合物导入生物体内，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，组织中的放射或涂片，涂上卤化银乳胶，组织中的放射性即可使乳胶感光。显示还原的黑色银颗性即可使乳胶感光。显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量。数量。 u分子杂交技术分子杂交技术具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，子片段，在适当条件

11、下，通过氢键结合，形成形成DNA-DNA，DNA-RNA或或RNA-RNA杂交的双链分子。杂交的双链分子。这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。间是否具有互补关系。 人类染色体人类染色体端粒端粒DNA的的荧光原位杂交荧光原位杂交 最初是使用带放射性的最初是使用带放射性的DNA探针，通过放射自显影探针，通过放射自显影来显示位置。后来又发明了免疫探针法，将探针核来显示位置。后来又发明了免疫探针法，将探针核苷酸的侧链加以改造，探针杂交后，其侧链可被带苷酸的侧链加以改造，探针杂交后，其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别，从而显示出位置。有荧光标记的抗

12、体所识别，从而显示出位置。 uPCRPCR技术技术聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）用于在体外将微量的目）用于在体外将微量的目标标DNA大量扩增，以便进行分析。大量扩增，以便进行分析。 三、细胞分离技术三、细胞分离技术 u离心技术离心技术u流式细胞术流式细胞术 u细胞电泳细胞电泳 离心技术离心技术差速离心差速离心 速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀 用差速离心法分离已破碎的细胞各组份用差速离心法分离已破碎的细胞各组份 A等速度沉降，等速度沉降，B等密度沉降等密度沉降 离心技术离心技术密度梯度离心密度梯度离心

13、u流式细胞术流式细胞术流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分流式细胞术是对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。选的一门技术。在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高在分析或分选过程中，包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达纯度的细胞亚群，分

14、离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计。胞计。 u细胞电泳细胞电泳在一定在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动的现象称为外加电场的作用下发生泳动的现象称为细胞电泳细胞电泳。引起细胞电泳的电位值称为引起细胞电泳的电位值称为电位电位。各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞电荷量有各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞电荷量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同，因此所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同，因此可用来分离不同种类的细胞。可用来分离不同种类的细胞。在恒定

15、的电场条件下，同种细胞的电泳速度相当稳在恒定的电场条件下，同种细胞的电泳速度相当稳定，因而可通过测定电泳速度来推算出细胞的定，因而可通过测定电泳速度来推算出细胞的电位电位。电位常因细胞生理状态和病理状态而异，因此在电位常因细胞生理状态和病理状态而异，因此在诊断疾病上有一定价值。诊断疾病上有一定价值。四、细胞培养与细胞杂交四、细胞培养与细胞杂交 u细胞培养细胞培养 选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术究的技术 。u细胞融合细胞融合通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成通过培养和诱导，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合或细胞杂交合或细胞杂交 。动物细胞培养动物细胞培养 群体培养（左）和克隆培养（右群体培养（左）和克隆培养（右） 植物细胞培养 1 1、组织培养：诱发产生愈伤组织，如果条件适宜，可培养出再生植株。、组织培养：诱发产生愈伤组织，如果条件适宜，可培养出再生植株。2 2、悬浮细胞培养：适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。、悬浮细胞培养：适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。3 3、原生质体培养：脱壁后的植物细胞称为原生质体。、原生质体培养：脱壁后的植物细胞称为原生质体。4 4、单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株，经人为加倍后可得、单倍体