基因毒性杂质培训及讨论20151025

1、基因毒性杂质培训及讨论2015.10.20 一、基因毒性杂质基本信息 基因毒性杂质介绍 基因毒性杂质文件 二、ICH M7介绍及实例讨论 M7适用范围介绍 基因毒性杂质评估及分类 基因毒性杂质控制策略 三、问题讨论目录基因毒性杂质基本信息杂质的分类：杂质的分类：Q3A/B/C/D：有机杂质：起始物料、副产物、中间体、降解产物等无机杂质：重金属或其他残留金属、无机盐；其他（如滤纸、活性炭）残留溶剂M7&M7 Addendum： 基因毒性杂质 ICH外的杂质：外源性污染物：微生物，内毒素等。多晶型：晶型杂质。什么是基因毒性杂质是指能直接或间接损伤细胞DNA，产生致突变和致癌作用的物质。基因毒性包括

2、致癌性和致突变性： 致癌性主要指诱变性致癌： 第一级(Group 1)致癌物：对人类为确定致癌物。 第二级，对动物致癌性明确，对人类致癌性不确定致突变 致突变性和致癌性紧密相关。现在发现的毒物，致癌性强的，70% 都有比较强的致突变性致癌物分成两大类：1、遗传毒性致癌物，通过化学键合直接破坏遗传物质产生致癌性； 2、非遗传毒性致癌物， 通过遗传物质外的间接机制引起致癌作用（ 如促进细胞过度增殖等）。什么是基因毒性杂质1970 年代，James 和Elizabeth Miller 夫妇在研究“烷化剂”和“酰化剂”的致癌性的基础上，提出了“亲电性致癌论”。成为多个商业化和非商业化的毒性预测软件的理

3、论基础。常见的基因毒性物质苯并芘、黄曲霉素、亚硝胺化疗药物，不良反应是化疗药物对正常细胞的基因毒性所致，如顺铂、卡铂、氟尿嘧啶等。氨基糖甙类抗生素为什么研究基因毒性杂质呀？。甲磺酸奈非那非（维拉赛特锭）事件一种用于HIV治疗的抗病毒药物，1997年FDA批准，罗氏1998年欧洲上市罗氏2007年6月接到6名患者投述DNA序列异常罗氏2007年6月召回产品，EMEA暂停上市发现储存罐中乙醇残留，放置3个月导致甲磺酸乙酯达到2300ppm去掉存储罐，增加对甲磺酸乙酯的控制要求低于0.5ppmEMA对新工艺重新进行了评估、对工厂进行现场检查2007年10月，Roche重新获得上市许可甲磺酸奈非那非（

4、维拉赛特锭）事件后续2008.01.24 EMEA关于要求进行基因毒性杂质评估的函件函件内容针对所有药品中含以甲磺酸盐，羟乙基磺酸盐，对甲苯磺酸盐或苯磺酸盐形式存在之药物活性成分之上市许可持有人以TTC法对该类杂质进行限度控制哪些化合物是基因毒性杂质欧盟发布的警示结构Development of structure alerts for the in vivo micronucleus assay in rodents。或进入The Carcinogenic Potency Database (CPDB)， 里面有1547 种致癌物质的列表，结构式，CAS 号，作用部位， TTC 值等一系列信

5、息。Ashby 等人总结出来18 种警示结构的模型，并将这些结构特征整合到一个“超级致癌物”虚拟分子结构中Group1:Aromatic Groups(芳香族化合物）:NAOHN-Hydroxyaryls N-羟基苯胺NAAON-Acylated aminorryls N-酰化氨基苯NO+_Aza-aryl N-oxides氮杂芳基N-氧化物NAAAminoaryls and alkylated aminoaryls芳香胺和烷基取代的芳酰胺Group 2:Alkyl and Aryl Groups(烷烃和环烷烃类化合物）AHOAldehydes 醛NAAOHN-MethylolsN-亚甲基醇N

6、AANON-Nitrosamines N-亚硝基胺ANO2Nitro compounds 硝基化合物OANH2OCarbamates氨基甲酸类OAAEpoxides环氧丙烷HNAAAziridines氮丙啶类OCO(S)Propiolactones 环丙酯NHalogen(S)N or S Mustards 卤代乙胺NNRAAAHydrazines and azo Compounds肼和偶氮化合物Group 3:Heteroatomic Groups(含杂原子化合物）EWGMichale-reactiveAcceptors迈克尔加成反应受体POORSOORAlkyl Esetrs of Pho

7、sphonates or Sulfonates 膦酸酯或者磺酸酯HalogenHalo-alkenes卤代烯烃AHalogenPrimary Halides烷烃和环烷烃卤代物哪些化合物是基因毒性杂质警示结构基因毒性杂质基本信息基因毒性杂质控制相关文件及指南介绍遗传毒性杂质指南：控制，检验和风险评估 指南类别指南类别 指南名称指南名称遗传毒性杂质控制控制指南PhRMA 意见书：测定、检验和控制药物中特定潜在遗传毒性杂质的基本原理 (2006)。EMA：遗传毒性杂质限度指南。EMA安全工作组 (SWP)：关于遗传毒性杂质限量指南的问答FDA 行业指南（草案）：原料药和成品药中遗传毒性和致癌性杂质：

8、推荐方法 (2008)。ICH M7：诱变性杂质评估和控制遗传毒性试验试验指南ICH S2：人用药物的遗传毒性试验和数据解释。EMA：草药物质/制剂遗传毒性评估指南 (2008)。遗传毒性和致癌性物质的风险评估风险评估欧盟委员会健康与消费者保护局：遗传毒性和致癌性物质一般风险评估的方法学和途径 (2009)。有关基因毒性杂质的指南EMEAEMEA （欧洲药品局） 2006年首先颁布了基因毒性杂质限度指南，并自2007年1月1日起正式实施。 该指南为限制新活性物质中的基因毒性杂质提供了解决问题的框架和具体做法。弥补了ICH Q3不足 引入了毒理学关注阈值 (TTC) 的概念及其取值 提出了遗传毒

9、性杂质可接受性评估的决策树FDAFDA 2008年12月正式签发：原料药和成品药中遗传毒性和致癌性杂质，推荐方法 (2008) 。 继EMEA指南发表的适用于美国的文件，内容和EMEA指南基本一致 主要内容包括： 原料药和制剂中的基因毒性杂质生成的预防办法 基因毒性杂质的分析方法、处理方法和减少方法 上市申请和临床研究申请的可接受限度 草药原料药和制剂中基因毒性杂质评估指南有关基因毒性杂质的指南有关基因毒性杂质的指南ICH M7：二、ICH M7介绍及实例讨论M7适用范围介绍基因毒性杂质评估及分类基因毒性杂质控制策略 情景情景原料药原料药制剂制剂备注备注新原料药和制剂是是M7基本意图新化合物及

10、制剂的临床申请是是M7基本意图M7适用范围介绍上市后变更-原料药研发、生产和控制 起始物料后的合成路线、试剂、溶剂或工艺条件变更时特别是，变更评估要确定其是否会导致任何新的诱变性杂质或已知诱变性对原料药、中间体或起始物料的生产场所的变更，或变更原料供应商则不需要对诱变性杂质风险重新进行评估。 原料药用于新剂型，不需要重新评估上市后变更-制剂研发、生产和控制 上市后申报涉及制剂（例如、成分、生产工艺、剂型），则应对所有新的诱变性降解产物或已有诱变性降解产物更高的可接受标准进行评估。制剂生产场所变更不需要重新评估。复方制剂使用已上市成分和新成分，已上市不需要重新评估，新成分需要评估上市后变更-临床

11、使用 临床使用剂量的显著增加、用药时长的增加，需重新评估在病情较严重或危及生命的病患状态下采用较高可接受摄入量的情况，变成不那么严重的病患，原有的杂质可接受摄入量可能不再适当。已上市药品的临床应用变更包涵：使用新的给药途径，或扩大使用患者群，（孕妇和/或小儿），需重新评估以下类型的原料药和制剂：生物/生物技术制品、肽类、寡核苷酸、放射药物、发酵产品、草药制品和动物或植物来源的粗品本指南不适用于ICH S9中所定义的晚期癌症指征用原料药和制剂。不适用于已上市药物中使用的辅料、调味剂、着色剂和香料。不适用于药物包材中的可浸出杂质。如果辅料首次使用，且是化学合成的，则本指南适用。M7不适用范围介绍二

12、、ICH M7介绍及实例讨论M7适用范围介绍基因毒性杂质评估及分类基因毒性杂质评估及分类基因毒性杂质控制策略第1类：已知的、具有基因毒性（突变性）和致癌性的杂质第2类：已知的、具有基因毒性（突变性），但致癌性未知的杂质第3类：具有警示结构、与API无关、基因毒性（突变性）未知的杂质第4类：具有警示结构、与API有关、基因毒性（突变性）未知的杂质第5类：没有警示结构，没有基因毒性（突变性）的杂质基因毒性杂质分类基因毒性杂质分类及控制BNAmes等经十余年努力，于1975年建立并完善的沙门氏菌回复突变试验（亦称Ames试验）。原理：鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）的组

13、氨酸营养缺陷型（his）菌株，在含微量组氨酸的培养基中，一般只能分裂几次，形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后，大量细胞发生回复突变，自行合成组氨酸，发育成肉眼可见的菌落。Ames试验（埃姆斯实验）-污染物致突变性检测Ames试验（埃姆斯实验）-污染物致突变性检测决策路线图-杂质的分类、验证和风险评估第一类No第二类TTC法No or unknowYesPDE法YesNot tested第三类第四类普通杂质控制第五类NoNo清除杂质？风险评估用阈值控制该杂质是否有基因毒性？该原料是否有基因毒性？基因毒性杂质的限度计算：具有阳性致癌数据的诱变杂质（第1类）-计算可接受摄入量（ AI）

14、M7 Addendum中列出的15种化合物中有10个为该计算方法计算 Carcinogenicity Potency Database (CPDB）中列明了1574种致癌物质的TD50值毒理学关注门槛-TTC法(第2/3类) ICHM7主要讨论的方法，主要针对第2/3类基因毒性杂质，比如低级磺酸酯类等。 有些化合物可能显示出非常高的诱变性（关注的队列），例如，黄曲霉毒素类、 N-亚硝基化合物、以及烷基-氧化偶氮结构。则要显著低于TTC法可接受摄入量。 有实际阈值证据的诱变性杂质-使用不确定性因子（ICH Q3C计算允许日暴露量（PDE） 即非线性响应的， M7 Addendum中列出的15种化

15、合物中有3个为该计算方法计算 ICHQ3C残留溶剂计算采用该法。 比如双氧水（M7 Addendum ）1、具有阳性致癌数据的诱变杂质（第1类）-计算可接受摄入量（ AI）Threshold of Toxicological Concern (TTC，毒理学关注阈值) ：从给定的50% 肿瘤发生率（TD50）简单线性外推线性外推到十万分之一发生率（终生暴露情况下），采用的数据是来自于最敏感物种和最敏感肿瘤部位的TD50 数据。值为1.5ug/day。基于TTC 的方法一般被认为是非常保守的。该法最早用于食品及食品包材控制，EMEA指南中引入该法。相关概念介绍-TTC相关概念介绍- M7 Add

16、endum中AI介绍acceptable intakes(AI，可接受摄入量) ：通过从给定的50% 肿瘤发生率（TD50）简单线线性外推性外推到十万分之一发生率（终生暴露情况下），每日可以接受的摄入量。该法主要针对TD50确定的化合物，计算原理和TTC法一样。 Carcinogenicity Potency Database (CPDB）中列明了1574种致癌物质的TD50值。AI的TD50选择，基于保守的目的，采用最敏感部位的TD50值，以及权威机构的报道值（CPDB、NTP等）另外，有的物质在特定部位有很强的敏感性，也是人体主要接触方式（吸入），故通常会针对吸入有一个可接受摄入量，值一般

17、很低。AI的计算方法M7 Addendum中使用AI计算的10种化合物黄曲霉毒素（1402-68-2）：基本结构为二呋喃环和香豆素,该类目前已经鉴定出12种。其他致癌性已知杂质的毒性计算-黄曲霉素CPDB查询显示：采用最敏感部位的TD50，即大鼠(rat)肝（liv）:TD50=0.00299mg/kg/天=0.00299ug/天假如每天服用的药物为100mg，则该药物中控制黄曲霉素的浓度限度为：C=AI/100mg=0.00000299%=0.0299ppm其他致癌性已知杂质的毒性计算-亚硝胺、苯并芘 BenzoapyreneCAS No. 50-32-8Also known as BaP毒

18、理学关注门槛TTC法(第2/3类)-ICHM7中主要介绍方法根据TTC计算可接受摄入量时，一个具有诱变性的杂质每天每人摄入1.5g时其风险被认为是可以忽略的，可以通用于大部分药物，作为默认的可接受限度控制标准。该方法一般用于长期治疗用药物中的诱变性杂质（10年），且没有致癌数据时（第2类和3类）。在不同的服药时间周期，TTC值可以不同在不同的试验阶段（临床试验），TTC值不同。多个基因毒性杂质，需要合并考虑限度结算如下： =1.5ug/day/剂量（g/day）低于生命周期（LTL）暴露对已知致癌物（第1类）的标准风险评估，长期低剂量暴露于短期高剂量暴露有同样风险-可以依据暴露时长进行调整。T

19、TC计算的可接受日摄入量1.5g/天被认为是在终生每日暴露情况下可以受到保护的量。 累积终生剂量为;1.5g/天X25,550天=38.3mg 日摄入量可以高于平均终生日暴露量，而其风险水平仍与每日或非每日治疗方案相持平单个杂质可以接受的摄入量时间剂量关系表2是从上述概念得到的数据，其中写出了临床研发阶段和上市阶段终生暴露LTL下可接受摄入量数值。如果给药是间歇性的，则可接受日摄入量应根据给药总天数计算。例如，2年期间每周服用一次的药物（即104个服药天数），其可接受摄入剂量为每剂20 g。该拟定的摄入水平一般大大低于计算值，在很短期治疗时，安全性更大，详见下图：短于生命周期的可接受摄入量不同

20、治疗时长举例LTL应用于临床阶段和已上市药物的情况-临床阶段采用LTL概念，诱变性杂质的可接受摄入量在临床研究中的治疗期限最高为1个月、1-12个月及长于1年直到完成3期临床试验（表2）。保持早期临床风险水平为百万分之一，后期临床为十万分之一。 进一步地，经过调整的可接受摄入量可以应用于14天的一期临床试验阶段。只有1类和2类，以及3类中关注序列杂质予以诱变性考虑。仅仅只是含有警示结构（3类）不需要在一期临床试验期间进行评估如果治疗时长不超过6个月，被接受的日摄入量符合100万分之一患癌风险水平。LTL应用于临床阶段和已上市药物的情况-已上市药物已上市药品的治疗时长分类与可接受摄入量在上表中列

21、出。它可以用来预计绝大部分患者的暴露时长。有些情况下，患者中一部分人群可能会延长治疗时长，延长治疗时长导致的风险增加（如上例，增加比例为1.5/100000）可以忽略。 在短期服用时，第1类，以及有特定阈值的也可以按上述的比例进行调整（临床阶段和已上市），或限制不超过0.1%(ICH 3A)，取低者例如，如果一个特定化合物的可接受服用量为终生暴露期15g/天，在短于终生时长暴露时的限度（表2）可以增加至100g（1-10年治疗进长），200g（1-12月）或1200g（1个月）。但是，对于具有最大日服用剂量的药物，例如，100mg，则0.1%的，取限度0.1%基因毒性杂质的控制策略第三种方法在

22、原料、起始物料或中间体的质量标准中包括对杂质的检测， 或作为中控检测，同时制订一个高于原料药中可接受限度的质量标准，采用适当的分析方法，配合经过证明毒性认识， 在后续工艺中被清除的知识，并对后续工艺进行控制，保证原料药中的该杂质残留水平低于可接受限度，不需要在后续工艺中再行检测。当实验室级试验（鼓励采用加样试验）数据，必要时可以采用中试生产或商业批次数据加以支持，显示原料药中杂质水平低于可接受限度的30% 时，可以采用该方法。第三种方法实例ICHM7案例1：第3种控制策略举例差2步到原料药时，生成了中间体X，杂质A在中间体X中常规检出。杂质A是一个稳定的化合物，会被带入原料药。在实验室中，将杂

23、质A以不同浓度加入中间体X，发现即使在1%水平时，也能降到根据TTC制订的限度的30%以下。由于中间体X的形成离原料药只有2步，杂质A在中间体X中的水平相对较高，因此另外又通过检测不同中试规模批次中，原料药里的杂质A水平确认了工艺清除水平，获得的结果为根据TTC制订的限度的30%以下。因此，对中间体X中杂质A控制在1.0%水平是可以接受的，不需要在原料药标准中对该杂质进行检测。ICHM7案例2：第3种控制策略举例 根据加样研究采用标准分析方法所获得的预期清除数据一个5步合成工艺中，起始物料Y在第3步引入，采用标准分析方法在起始物料Y中检出杂质B通常低于0.1%。为了确定0.1%的标准是否可接受

24、，在实验室里进行了清除研究。将杂质B以不同浓度（最高10%）加入起始物料Y中，通过最后3步工艺步骤，得到清除系数500倍。该清除系数应用于起始物料Y含杂质B为0.1%时，杂质B在原料药中的期望水平低于2 ppm。由于该值低于根据TTC限度计算的原料药中该杂质允许水平50 ppm，因此认为起始物料Y中杂质B为0.1%的质量标准是可接受的，不需要再提交中试生产数据或商业放大批数据。第三种方法实例第四种方法对工艺参数和残留杂质水平（包括致命性和清除知识）影响有了解，确信原料药中的杂质一定会低于可接受限度；建议该杂质不需要进行分析测试（例如，不需要将杂质列在任何质量标准中）。在很多情况下，只需要根据科

25、学原理对该控制方法进行论述就可以了。科学风险评估要素可以用来论证第4 种方法。第4种方法特别适用于不稳定的杂质（例如 ，二氯亚砜），以及那些在合成路线早期引入，但已被有效清除的杂质。基因毒性杂质的控制策略第四种方法实例ICHM7案例3：第2种和第4种控制策略举例 结构相似的诱变性杂质一个5步合成工艺中第1步中间体是一个硝基芳烃化合物，可能含有较高水平的杂质C（位置异构物）。第1步中间体中杂质C的量采用常规分析方法未能检出，但可能以较低水平出现。第1步中间体细菌诱变含量呈阳性。第2步加氢反应中第1步中间体转化率为99%，得到对应的芳烃胺。该转化率通过中控检测确认。对中间体残留的清除情况进行了评估，第3步和第4