DNA提取及PCR扩增试验报告

1、PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳刘琳1131428环境科学一、实验目的1 学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。2 对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。二、实验原理1. PCR扩增多聚酶链反应（PCR ）技术的原理类似于 DNA的天然复制过程。 在微量离心管中加入 适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP ）、耐热Taq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下（94 C）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。降低溶液温度，使合成引物在低温（55 C）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温（72 C）,在Ta

2、p酶作用下，用四种 dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板 DNA而参与DNA的合成，使产物 DNA的量按指数方式扩增。经过3040个循环，DNA扩增即可完成。2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度 下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比

3、。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。 该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。三、实验材料仪器：PCR扩增仪、0.2ul薄壁管、1.5ml离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、 水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。试剂：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全长DNA样本、无菌ddH?。、 模板DNA、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。四、实验步骤1. PCR扩增本次试验选择细菌 16S rDNA V3区片段进行扩增。1.1 根据计算，首先取 1.5ml 离心管按照 2.5ul 10 x Buffer、1 ul dNT

4、P、0.5 ul 341GC、 0.5 ul 534、0.125 ul Taq、19.375u ddH 2O的比例配置足量的 PCR反应体系。1.2分别向9个薄壁管中分别加入 24 ul的反应体系，并分别添加8种不同的模版，并于第9个薄壁管中加入无菌 ddH 20作为阴性对照。1.3将薄壁管放入 PCR扩增仪中，按照预定程序进行PCR扩增。其中循环过程需要达到3040次。程序如下：预变性：94 C3min循环：94 C变性30s55 C退火30s72 C延伸30s末次延伸：72 C5min1.4 PCR扩增完成后，将样品取出并保存于 15 C环境中。2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验2.1称取0.

5、2g琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入适量的0.5 XTBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化，溶液透明。摇匀，待冷却至60 C左右，在胶液内加入适量的 EB。2.2取有机玻璃制胶板槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60 C左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。2.3待胶凝固后，小心拔起梳子，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。2.4在槽内加入0.5 XTBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。取1卩1缓冲液和5卩1待测DNA样品混合后，用移液枪滴加至凝胶的加样孔中。2.5接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过5V/cm，开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。

6、2.6观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。当其移动至距胶板前沿约1cm处，可停止电泳。2.7在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把凝胶放在上面。 关上样品室外门，打开紫外灯，通过观察孔进行观察。五、实验结果与讨论如图所示：从左至右，分别是模版1-8号，第9列为阴性对照。前8列均有明显的条带出现，而阴性对照无显示，说明扩增整体效果很 好。图中有上下两条线，上面一条线所 覆盖的条带基本可以代表扩增的产生 的片段位置，参照图可以看出扩增片段 在200bp左右。在第9个阴性对照的第 二条线处可以看到较为模糊的条带，并 非是出现假阴性，而是由于二聚物而产 生的条带。通过该条带与最右侧的

7、 marker对比可知该片段出现在 100bp左 右，并非由于实验操作等问题而产生的 污染。实验的照片显示实验结果有拖尾 现象，但是并不影响后续实验。在实验 过程中由于有些试剂加到了管壁上面， 并没有完全加入，可能会出现一些误 差。另外在第1列条带中出现了其他的亮带，可能是由于在前期的扩增实验中滴加试剂时由于量过少而进行的摇匀和融合等操作产生了非特异性扩增，也有可能是因为胶板制作过程中梳子的位置不合适或者胶板制作时边缘处不够均匀导致产生污染。但总体而言，实验结果 较为满意。六、实验注意事项1. 由于PCR技术非常敏感，可使一个 DNA分子得以扩增，装有 PCR试剂的离心管打开之前，应先在微量离

8、心机上作瞬间离心使液体沉积于管底。PCR扩增反应的条件，要控制好温度、时间和循环次数。2. 最好在加完所有其它反应成分后才加模板DNA。3. 配琼脂糖时应使其完全溶化后方可制胶。4. EB具有致癌作用，配制及使用时应带一次性手套。并在专门的实验室内使用。七、实验收获1. 通过本次实验学习并掌握了PCR反应的基本原理、实验过程及技术。2. 通过本次实验掌握了电泳实验分离DNA的原理和方法。八、思考题1、如果你的研究中要扩增大肠杆菌某个酶的基因，你如何进行相关实验？通过PCR扩增出想要的片段，然后通过凝胶电泳实验进行回收，并与合适的载体连接，转化进感受态细胞。经过培养提取质粒，进行酶切或PCR验证

9、，测序最终验证，保存菌种2对引物序列为 5 -GACTCCAGTCGAATCTACCA- 3和5 -AACCGTGGCGACACCGCTAA 请计算它们的Tm值及选择合适的退火温度，如果按你 算的退火温度做PCR时没有得到相应的产物，你怎么解决？5 -GACTCCAGTCGAATCTACCA- 3Tm 值=4 (G+C ) +2(A+T)-(5 10 C ) =4 ( 3+7 ) +2 (6+4 ) -(5 10 C ) =60 C -(5 10 C ) =5055 C5-AACCGTGGCGACACCGCTAATm 值=4 (G+C ) +2(A+T) -(5 10 C )=4(5+7)+2(6+2) -(510 C )=64 C -(5 10 C )=5459 C因此退火温度可以选择在 55 C可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5 C,以2C为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形 成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异