生物化学基因工程课件

1、生物化学基因工程第第 十十 四四 章章目目 录录目目 录录生物化学基因工程目目 录录生物化学基因工程基因重组：基因重组： 基因重组是细胞内经常发生的过程，是指整段基因重组是细胞内经常发生的过程，是指整段DNA在细胞内或细胞间甚至不同物种之间进行转移在细胞内或细胞间甚至不同物种之间进行转移或交换，并在新的位置上进行复制、转录及翻译的或交换，并在新的位置上进行复制、转录及翻译的现象。基因重组又叫现象。基因重组又叫DNA重组重组，是自然界的常见现，是自然界的常见现象。它在物种变异、进化、两性繁殖、基因表达和象。它在物种变异、进化、两性繁殖、基因表达和调控以及基因激活等方面都具有重要作用。调控以及基因

2、激活等方面都具有重要作用。基因工程：基因工程： 基因工程是指在试管内应用人工方法进行基因基因工程是指在试管内应用人工方法进行基因重组，把重组的基因导入细胞或细菌内，进行复制、重组，把重组的基因导入细胞或细菌内，进行复制、转录和翻译。利用这一技术可以扩增转录和翻译。利用这一技术可以扩增DNA，生产蛋，生产蛋白质，或者创造生物新品种。该技术又称为白质，或者创造生物新品种。该技术又称为重组重组DNA， DNA克隆或分子克隆。克隆或分子克隆。目目 录录生物化学基因工程第第 一一 节节DNA的重组的重组 DNA Recombination目目 录录生物化学基因工程目目 录录生物化学基因工程目目 录录生物

3、化学基因工程（三）机制：（三）机制：Holliday模型；同源重组有模型；同源重组有4个关键步骤个关键步骤 两个同源染色体两个同源染色体DNA排列整齐。排列整齐。一个一个DNA的一条链断裂、并与另一个的一条链断裂、并与另一个DNA对应对应链连接，形成链连接，形成Holliday中间体。中间体。通过分支移动产生异源双链通过分支移动产生异源双链DNA。Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组中间体切开并修复，形成两个双链重组体体DNA。片段重组体片段重组体(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant) 由于切开的方式不同，得到两种不同的

4、产物：由于切开的方式不同，得到两种不同的产物：目目 录录生物化学基因工程片段重组体：片段重组体： （见模型图右边产物）：（见模型图右边产物）： 切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体：拼接重组体：（见模型图左边产物）：（见模型图左边产物）： 切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本链区的两侧来自不同亲本DNA。 生物化学基因工程 内切酶内切酶 (recBCD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (r

5、ecA) 内切酶内切酶(recBCD) DNA 连接酶连接酶5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 3 3 5 3 5 3 3 5 5 3 5 3 5 3 Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 目目 录录生物化学基因工程Holiday中间体中间体5 3 5 3 5 3 5 3 5 3 5 5 5 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 5 5 5 5 3 3 3 3 内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC) DNA连接酶连接酶

6、DNA连接酶连接酶拼接重组体拼接重组体片段重组体片段重组体目目 录录生物化学基因工程E.coli同源重组分子机制：同源重组分子机制： 需数十种酶参与，其中最关键的是：需数十种酶参与，其中最关键的是：RecA蛋白、蛋白、RecBCD复合物及复合物及RuvC蛋白。蛋白。 RecA RecA蛋白蛋白是由是由recrec基因编码的，可结合单链基因编码的，可结合单链DNADNA，形成形成RecAssDNARecAssDNA复合物。复合物。 RecARecA蛋白具有多个蛋白具有多个DNADNA结合位点，因此线性结合位点，因此线性RecAssDNARecAssDNA复合物可以通过插复合物可以通过插入同源的入

7、同源的DNADNA双螺旋的大沟，形成三链双螺旋的大沟，形成三链DNADNA中间物，中间物，并通过旋转逐渐取代双螺旋并通过旋转逐渐取代双螺旋DNADNA中的一条链，与互补中的一条链，与互补链配对，将同源链置换出来，产生新的双链链配对，将同源链置换出来，产生新的双链DNADNA分子，分子，从而完成从而完成DNADNA重组。重组。目目 录录生物化学基因工程 具有三种酶活性：具有三种酶活性：依赖依赖ATPATP的核酸外切酶；的核酸外切酶；ATPATP增强的核酸内切酶；增强的核酸内切酶；需要需要ATPATP的的解旋酶活性解旋酶活性。利用利用ATPATP水解提供能量，沿着水解提供能量，沿着DNADNA链运

8、动，并以较快链运动，并以较快的速度将前方的速度将前方DNADNA解旋，当遇到解旋，当遇到CHICHI（因交换位点的（因交换位点的DNA DNA 结构类似于希腊字母结构类似于希腊字母 而得名）位点而得名）位点（5GCTGGTGG35GCTGGTGG3）时，可在其下游切出）时，可在其下游切出33末端末端的游离单链。从而使的游离单链。从而使DNA DNA 重组成为可能。重组成为可能。RecBCD蛋白蛋白 有内切酶活性，可切开同源重组的中间体有内切酶活性，可切开同源重组的中间体RuvC蛋白蛋白目目 录录生物化学基因工程 首先由首先由RecBRecB、RecCRecC、RecDRecD的复合物使的复合物

9、使DNADNA产产生单链切口；生单链切口；RecARecA蛋白催化单链蛋白催化单链DNADNA对另一双链对另一双链DNADNA的侵入，并与其中的一条链交叉，交叉分支移的侵入，并与其中的一条链交叉，交叉分支移动，待相交的另一链在动，待相交的另一链在RecBCDRecBCD内切酶催化下断裂内切酶催化下断裂后，由后，由DNADNA连接酶连接缺失的远末端，形成连接酶连接缺失的远末端，形成HollidayHolliday中间体；此中间体再经内切酶中间体；此中间体再经内切酶RuvCRuvC切割、切割、DNADNA连接酶连接完成重组。连接酶连接完成重组。E.Coli的同源重组过程的同源重组过程:目目 录录生

10、物化学基因工程( (四四).).功能功能1.1.在减数分裂过程中，同源染色体之间进行在减数分裂过程中，同源染色体之间进行交换，形成生物个（群）体的多样性。交换，形成生物个（群）体的多样性。2.2.是是DNADNA损伤修复的重要机制之一。损伤修复的重要机制之一。目目 录录生物化学基因工程二、细菌的基因转移与重组二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用（一）接合作用当细胞与细胞、或细胞与细菌通过菌毛相互接当细胞与细胞、或细胞与细菌通过菌毛相互接触时，质粒触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌），这种类型的胞（细菌），这种类型的DNA转移称为接合作用转移称

11、为接合作用(conjugation)。并非所有质粒并非所有质粒DNA都能转移，而是只有某些较都能转移，而是只有某些较大的质粒（如大的质粒（如F因子）才能通过接合作用发生转移。因子）才能通过接合作用发生转移。因因F因子含有细菌的性鞭毛蛋白编码基因。能表达因子含有细菌的性鞭毛蛋白编码基因。能表达形成细菌的表面性鞭毛。形成细菌的表面性鞭毛。 细菌的基因转移与重组有四种方式：接合、转化、细菌的基因转移与重组有四种方式：接合、转化、转导和细胞融合。转导和细胞融合。目目 录录生物化学基因工程可接合质粒如可接合质粒如 F 因子因子(F factor) 质粒质粒 细菌染色体外的小型环状双链细菌染色体外的小型环

12、状双链DNA分子分子F+F-性鞭毛连接性鞭毛连接酶切单链酶切单链目目 录录生物化学基因工程（二）转化作用（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用化作用 (transformation)。例如：当细菌破裂溶解（溶菌）时，其裂解例如：当细菌破裂溶解（溶菌）时，其裂解的的DNA片断可被另一细菌作为外源片断可被另一细菌作为外源DNA摄取，并摄取，并重组整合进自己的基因组，随细菌基因一起复制、重组整合进自己的基因组，随细菌基因一起复制、转录、翻译，使受体菌获得新的遗传

13、表型。转录、翻译，使受体菌获得新的遗传表型。 目目 录录生物化学基因工程例：例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。目目 录录生物化学基因工程（三）转导作用（三）转导作用 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来，当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来，再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导转移及基因重组即为转导作用作用(transduction)。 自然界常见的转导作用是由噬菌体感染宿主自然界常见的转导作用是由噬菌体感染宿主菌（细胞）时，伴随发生菌（细胞）

14、时，伴随发生DNA转移和基因重组。转移和基因重组。 过程：噬菌体感染宿主菌后有两种生活方式：过程：噬菌体感染宿主菌后有两种生活方式：溶菌性生长途径和溶源性生长途径。溶菌性生长途径和溶源性生长途径。目目 录录生物化学基因工程 噬菌体噬菌体DNA在宿主菌内进行自我复制，迅在宿主菌内进行自我复制，迅速增殖，并进行转录和翻译，组装成大量新的速增殖，并进行转录和翻译，组装成大量新的噬菌体。连续增殖直到把细菌涨破，新的噬菌噬菌体。连续增殖直到把细菌涨破，新的噬菌体释放出来，又可再感染其他细菌。体释放出来，又可再感染其他细菌。1.溶菌性生长途径：溶菌性生长途径：目目 录录生物化学基因工程2.溶源菌生长途径：

15、溶源菌生长途径： 是噬菌体是噬菌体DNA整合进宿主染色体，随宿主整合进宿主染色体，随宿主DNA复制而被动复制，这种整合了噬菌体复制而被动复制，这种整合了噬菌体DNA的细菌称的细菌称为为溶源菌溶源菌。在溶源菌生长中，噬菌体与宿主菌可以共。在溶源菌生长中，噬菌体与宿主菌可以共存维持无数代，直到宿主遭遇特殊事件时，使原噬菌存维持无数代，直到宿主遭遇特殊事件时，使原噬菌体体DNA从细菌染色体上被切下再进入溶菌途径。当从细菌染色体上被切下再进入溶菌途径。当原噬菌体原噬菌体DNA从细菌染色体被切下时，如果有部分从细菌染色体被切下时，如果有部分宿主宿主DNA被随着切下，这种带有宿主被随着切下，这种带有宿主D

16、NA的噬菌体的噬菌体称为称为转导噬菌体转导噬菌体。转导噬菌体再次感染细菌时就可将。转导噬菌体再次感染细菌时就可将前一宿主前一宿主DNA转移至新的宿主细胞，发生转导作用。转移至新的宿主细胞，发生转导作用。生物化学基因工程噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌生长途径(lysogenic pathway)例例目目 录录生物化学基因工程目目 录录目目 录录生物化学基因工程 概念：概念：在整合酶催化下，在两个在整合酶催化下，在两个DNA序列的特异位序列的特异位点之间发生的整合作用称为位点特异重组点之间发生的整合作用称为位点特异重组(sit

17、e-specific recombination) 种类：种类： 噬菌体噬菌体DNA的整合的整合;细菌的特异位点重组；细菌的特异位点重组； 免疫球蛋白基因的重排；免疫球蛋白基因的重排；转座重组等。转座重组等。三、位点特异重组三、位点特异重组目目 录录生物化学基因工程 在在噬菌体噬菌体感染的早期即有大量整合酶产生，故几感染的早期即有大量整合酶产生，故几乎所有被感染的细胞都发生整合作用。乎所有被感染的细胞都发生整合作用。 噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异特异靶位点靶位点发生选择性整合；发生选择性整合；（一）一）噬菌体噬菌体DNA的整合的整合 （了解）

18、（了解）目目 录录生物化学基因工程 2. 2.特异位点：特异位点：噬菌体重组的特异位点称噬菌体重组的特异位点称attP(attachmentattP(attachment site phage) site phage)，含，含P P、O O和和PP三个序列组成三个序列组成。大肠杆菌大肠杆菌的重组位点的重组位点attBattB（ attachment site bacteriaattachment site bacteria），含），含B B、O O和和BB三个序列。三个序列。O O是是15bp15bp的的核心序列核心序列，是是attBattB和和attPattP所共同的所共同的. .而其两侧的

19、序列是而其两侧的序列是B B，BB和和P P，P,P,被被称为称为臂臂。整合酶与两个核心序列都相结合。整合酶与两个核心序列都相结合。P O P B O B目目 录录生物化学基因工程 （2 2）整合宿主因子整合宿主因子（integration host factor integration host factor IHFIHF）由大肠杆菌产生，结合于由大肠杆菌产生，结合于attPattP，对整合起促进作用。，对整合起促进作用。（3 3）切除酶切除酶（excisionase excisionase Xis Xis ）由）由噬菌体噬菌体xisxis基基因编码。指导因编码。指导噬菌体噬菌体DNADNA

20、从宿主的染色体中切出来。从宿主的染色体中切出来。4.4.过程过程：噬菌体编码整合酶。这个酶能指导噬菌体编码整合酶。这个酶能指导噬菌体噬菌体DNADNA通过重组位点通过重组位点attPattP插入插入E.coliE.coli的重组位点的重组位点attBattB处发处发生交叉重组，将两个较小的环状生交叉重组，将两个较小的环状DNADNA分子变成一个大环。分子变成一个大环。3.3.参与的整合的酶参与的整合的酶 （1 1）整合酶）整合酶（integrase integrase IntInt）：由）：由噬菌体噬菌体intint基基因编码，指导因编码，指导噬菌体噬菌体DNADNA插入到宿主的染色体中。插入

21、到宿主的染色体中。目目 录录生物化学基因工程 噬菌体 P O P 包装 感染宿主 P O P B O B Int Int IHF IHF Xis B O P P O B 图 23-21噬菌体的整合和切离 目目 录录生物化学基因工程 鼠伤寒沙门杆菌由鞭毛蛋白决定的鼠伤寒沙门杆菌由鞭毛蛋白决定的H H抗原有两种，分抗原有两种，分别为别为H1H1鞭毛蛋白和鞭毛蛋白和H2H2鞭毛蛋白。但有少数细菌呈相反鞭毛蛋白。但有少数细菌呈相反H H抗原，这种现象称为抗原，这种现象称为鞭毛相转变鞭毛相转变 。这种抗原相位的。这种抗原相位的改变是由一段改变是由一段995bp995bp的的DNAHDNAH片段片段, ,

22、发生倒位所致。发生倒位所致。（二）细菌的特异位点重组细菌的特异位点重组 （了解）（了解） 1.H片段的组成和功能：片段的组成和功能：两端各有一个两端各有一个14bp的的反向重复序列（特异重组位点反向重复序列（特异重组位点-hix）。）。中间是中间是hin基基因，编码特异的重组酶因，编码特异的重组酶-倒位酶，催化倒位酶，催化H片段倒位重组。片段倒位重组。 hin基因两端各有一个启动子（基因两端各有一个启动子（P），其中一个启动），其中一个启动子启动子启动hin基因表达产生倒位酶，另一个启动子正向启基因表达产生倒位酶，另一个启动子正向启动邻近的动邻近的H2和和rH1基因表达，分别产生基因表达，分别

23、产生H2鞭毛蛋白和鞭毛蛋白和H1阻遏蛋白。阻遏蛋白可抑制远方阻遏蛋白。阻遏蛋白可抑制远方H1基因的表达。基因的表达。因而结果是因而结果是H2表达而表达而H1不表达。不表达。 目目 录录生物化学基因工程 以以hixhix为为特异重组位点，在特异重组位点，在倒位酶倒位酶作用下，两个作用下，两个hixhix之间的之间的H片段进行特异位点重组片段进行特异位点重组(倒位倒位)。其结果是。其结果是H2和和rH1基因不表达，基因不表达，因为没有了启动子。但远方因为没有了启动子。但远方的的H1H1基因因没有阻遏蛋白的抑制而得以表达。所以，基因因没有阻遏蛋白的抑制而得以表达。所以，倒位重组的后果是表达倒位重组的

24、后果是表达H1H1鞭毛蛋白而不表达鞭毛蛋白而不表达H2鞭毛鞭毛蛋白。因此，蛋白。因此，沙门氏菌的位相是由于它的两种鞭毛沙门氏菌的位相是由于它的两种鞭毛蛋白质蛋白质H1H1和和H2H2的交迭表达。在某一时期，菌体表达的交迭表达。在某一时期，菌体表达其中的一种，但从不表达两种。其中的一种，但从不表达两种。2.倒位重组及后果：倒位重组及后果：目目 录录生物化学基因工程例例：细菌的特异位点重组：细菌的特异位点重组沙门氏菌沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变片段倒位决定鞭毛相转变 1221目目 录录生物化学基因工程（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排免疫球蛋白免疫球蛋白(Ig)(Ig)，由两

25、条轻链，由两条轻链(L(L链链) )和两条重链和两条重链(H(H链链) )组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链码轻链( ( 和和 ) )，一个编码重链。轻链的基因族上分别，一个编码重链。轻链的基因族上分别有有L L、V V、J J、C C四类基因片段。四类基因片段。L-L-前导片段；前导片段；V-V-可变片可变片段；段；J-J-连接片段；连接片段；C-C-恒定片段。重链的基因族上有恒定片段。重链的基因族上有L L、V V、D D、J J、C C五类基因片段，五类基因片段， D-D-多样性片段。多样性片段。 轻链的基因片段：轻链的基因片段

26、：重链的基因片段：重链的基因片段：L V J C L V D J C 目目 录录生物化学基因工程 重链重链(IgH)基因的基因的V-D-J重排和轻链重排和轻链(IgL)基因的基因的V-J重排均发生在特异位点上。在重排均发生在特异位点上。在V片段片段的下游，的下游，J片段的上游以及片段的上游以及D片段的两侧均存在片段的两侧均存在保守的保守的重组信号序列重组信号序列(recombination signal sequence, RSS)目目 录录生物化学基因工程CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCAC TGTTTTTGG重组信号序列重组信号序列基因片段基因片段回文七核苷酸序列回

27、文七核苷酸序列富含富含A九核苷酸序列九核苷酸序列间隔间隔 其其九核苷酸序列提供最初的识别位点，七核九核苷酸序列提供最初的识别位点，七核苷酸序列为切割位点。苷酸序列为切割位点。催化此重排的重组酶基因催化此重排的重组酶基因rag (recombination activating gene)共有两共有两个，分别产生蛋白质个，分别产生蛋白质RAG1和和RAG2。RAG1识别识别信号序列，然后信号序列，然后 RAG2加入形成复合物，共同促加入形成复合物，共同促进重排。抗体基因片段的连接过程进重排。抗体基因片段的连接过程如图如图。 生物化学基因工程V片段片段J片段片段RSSRSS间插间插DNAOHOHV

28、J单链切开单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应分子内转酯反应单链切开单链切开转移核苷酸转移核苷酸修复、连接修复、连接免疫球蛋白基因重排过程免疫球蛋白基因重排过程目目 录录目目 录录生物化学基因工程四、转座重组四、转座重组有些基因可从基因组的一个位置转移到另有些基因可从基因组的一个位置转移到另一位置，这些可移动的一位置，这些可移动的DNA序列包括有序列包括有插入序插入序列列和和转座子转座子。由插入序列和转座子介导的基因由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座移位或重排称为转座(transposition)。目目 录录生物化学基因工程 1.插入序列插入序列(insertion sequen

29、ces, IS)组成：组成：是一大约长是一大约长7501500bp的的DNA片断。其中包括：片断。其中包括： 二个分离的反向重复二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列；序列； 两翼有特有的正向重复序列；两翼有特有的正向重复序列；一个转座酶一个转座酶（transposase)编码基因，能表达转座酶引起转座。编码基因，能表达转座酶引起转座。 IRTransposase GeneIR 2. 转座形式：转座形式：保守性转座：是指插入序列从原位迁移到新位。保守性转座：是指插入序列从原位迁移到新位。复制性转座：是指插入序列复制后，其中一个复复制性转座：是指插入序列复制后，其中一

30、个复制品迁移到新位，另一个原位不动。制品迁移到新位，另一个原位不动。（一）插入序列转座（一）插入序列转座生物化学基因工程插入序列的复制性转座插入序列的复制性转座目目 录录目目 录录生物化学基因工程 1.转座子转座子(transposons) 概念：概念：可从一个染色体位点转可从一个染色体位点转 移到另一位点的分散的重复序列。移到另一位点的分散的重复序列。 2.转座子组成：转座子组成：两个两个反向重复序列；反向重复序列； 转座酶编码基因，其产物引起转座。转座酶编码基因，其产物引起转座。 抗生素抗性基因等有用的基因。抗生素抗性基因等有用的基因。IRIRTransposase Gene有用基有用基因

31、因（二）转座子转座（二）转座子转座 转座子插入新的靶位点的过程包括：在靶位点交转座子插入新的靶位点的过程包括：在靶位点交错切割错切割DNADNA，将转座子同靶位点的突出末端连接起来，将转座子同靶位点的突出末端连接起来，以及补齐缺口、致使靶位点出现正向重复序列。以及补齐缺口、致使靶位点出现正向重复序列。目目 录录生物化学基因工程生物化学基因工程由转座子介导的转座由转座子介导的转座目目 录录目目 录录生物化学基因工程目目 录录生物化学基因工程第第 二二 节节 重组重组DNA技术技术DNA Recombination Technique 目目 录录生物化学基因工程目目 录录生物化学基因工程重组重组D

32、NA技术的发展史技术的发展史年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验1944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建美国斯坦福大学的科学家构建第一个第一个重组重组DNA分子分子1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家第一家遗传工遗传工程公司，专门应用重组程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。技术制造医学上重要的药物。1980年年 开始建造开始建造第一家第一家应用重组应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂技术生产胰岛素的工厂1997年年 英国罗斯林研究所成功的克

33、隆了英国罗斯林研究所成功的克隆了“多莉多莉”羊。羊。 所有这些工作的基础都是所有这些工作的基础都是重组重组DNA技术技术。重组。重组DNA技术就是技术就是基因工程基因工程，是对基因进行设计和改造，是对基因进行设计和改造的分子工程，包括的分子工程，包括基因重组、基因克隆和克隆基因基因重组、基因克隆和克隆基因的表达的表达。目目 录录生物化学基因工程1.克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。2.克隆化克隆化(cloning)获取同一拷贝的过程称为克隆化获取同一拷贝的过程称为克隆化 (cloning)，即无性繁殖。，即无性繁殖。3.克隆技术水平：

34、克隆技术水平：分子克隆分子克隆(molecular clone)即即DNA 克隆克隆 。在分子水平上进行。在分子水平上进行。细胞克隆。细胞克隆。在细胞水平上进行。在细胞水平上进行。个体克隆个体克隆（动物或植物）（动物或植物）（一）（一） DNA克隆克隆目目 录录生物化学基因工程 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的人工的DNA）与载体）与载体DNA结合成一具有自我复制能结合成一具有自我复制能力的力的DNA分子分子复制子复制子(replicon)，继而通过转化

35、，继而通过转化或转染宿主细胞，再从中筛选出含有目的基因的转或转染宿主细胞，再从中筛选出含有目的基因的转化子细胞，然后进行扩增、提取，获得大量同一化子细胞，然后进行扩增、提取，获得大量同一DNA分子，即为分子，即为DNA克隆克隆。也称。也称基因克隆或重组基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 4.DNA克隆克隆目目 录录生物化学基因工程基因工程的基本程序基因工程的基本程序基因工程的基本程序是基因工程的基本程序是：（1 1）获取目的基因（外源）获取目的基因（外源DNADNA片段）（片段）（2 2）将目的基因连接到载体上，得杂化载）将目的基因连接到载体上，得杂化载体；（体；（3

36、 3）将杂化载体（）将杂化载体（DNADNA重组体）引入宿主细胞重组体）引入宿主细胞（受体细胞），使目的基因及载体上其它基因得以转（受体细胞），使目的基因及载体上其它基因得以转录和翻译。录和翻译。载体质粒载体质粒外源外源DNADNA片段片段外源外源DNADNA插入插入剪切剪切引入宿引入宿主细胞主细胞选出含有重选出含有重组组DNADNA的细的细胞并扩增胞并扩增abbAAb目目 录录生物化学基因工程生物技术工程生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。酶工程、细胞工程等。基因工程基因工程目的：目的： 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA

37、获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质） 基因工程基因工程(genetic engineering) 实实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称又称重组重组DNA工艺学工艺学。目目 录录生物化学基因工程（二）工具酶（二）工具酶n 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶n DNA聚合酶聚合酶n 逆转录酶逆转录酶n T4DNA连接酶连接酶n 碱性磷酸酶碱性磷酸酶n 末端转移酶末端转移酶n Taq DNA聚合酶聚合酶 在重组在重组DNA操作过程中，首先必备的工具就操作过程中，首先必备的工具就是各种工具酶。例如：是各种工具酶。

38、例如：目目 录录生物化学基因工程重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5 磷酸基和磷酸基和3 羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3 末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具

39、有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5 羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3 羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基目目 录录生物化学基因工程Hamilt

40、on O. SmithHamilton O. Smith美国人美国人 Daniel Nathans Daniel Nathans 美国人美国人 发现发现及其在分子遗传学及其在分子遗传学方面的应用方面的应用 ,1978,1978年共获诺贝尔奖。年共获诺贝尔奖。目目 录录生物化学基因工程限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶1.定义定义限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是能识别是能识别DNA的特异序列的特异序列, 并在识别位点或其并在识别位点或其周围切割双链周围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATC

41、C GBam H目目 录录生物化学基因工程 3.作用：作用：在细菌体内与甲基化酶共同构成细菌的限制在细菌体内与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源修饰系统，限制外源DNA， 保护自身保护自身DNA。对。对细菌遗传性状的稳定遗传具有重要意义。细菌遗传性状的稳定遗传具有重要意义。 2.分类：分类： 限制性核酸内切酶已发现限制性核酸内切酶已发现1800种之多。根据种之多。根据酶的组成，所需因子及裂解酶的组成，所需因子及裂解DNA方式不同，可分方式不同，可分为三类：为三类：、型。（基因工程技术中常用型。（基因工程技术中常用型）型）目目 录录生物化学基因工程第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大

42、写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示该酶发现的先后次序。用罗马数字表示该酶发现的先后次序。4.酶的命名：酶的命名：Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶通常用三个斜体字母的略语表示。通常用三个斜体字母的略语表示。目目 录录生物化学基因工程 5. 5.类酶识别类酶识别DNADNA序列特点序列特点 回文结构回文结构 6. 6.平头或钝性末端、粘性末端：平头或钝性末

43、端、粘性末端： 平头或钝性末端：平头或钝性末端：有些限制性核酸内切酶可在同有些限制性核酸内切酶可在同一水平上切断一水平上切断DNADNA双链，即形成平头或钝性末端。双链，即形成平头或钝性末端。HindGTCGACCAGCTGGTCCAGGACCTG目目 录录生物化学基因工程GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H 粘性末端：粘性末端：有些酶在切割有些酶在切割DNA双链时，在双链时，在两条链切口错开数个核苷酸，从而形成突出的两条链切口错开数个核苷酸，从而形成突出的3粘性末端或粘性末端或5粘性末端。粘性末端。目目 录录生物化学基因工程 作用模式图作用模式图产生产生33突出突出粘

44、性末端粘性末端Pst I*CTGCAG*GACGTC*553355335 53 33355OHP P*C T G C A*G55333 355OHP PA C G T C* * * * * * * * * * * *G* * * * * * * * * * * *目目 录录生物化学基因工程 作用模式图作用模式图产生平末端产生平末端( (blunt end) )Alu I*AGCT*TCGA*553 3553355333355OHP*AG*TC55333355 OHPCT*GA*目目 录录生物化学基因工程 不同的限制性内切酶识别不同的限制性内切酶识别DNADNA中的核苷酸序列长中的核苷酸序列长短

45、不一，分别为短不一，分别为4 4、6 6或或8 8个核苷酸序列。如果个核苷酸序列。如果DNADNA序序列是随机的：列是随机的：特异特异4 4核苷酸序列核苷酸序列约约256bp256bp出现一次；出现一次；特异特异6 6核苷酸核苷酸约约4kp4kp出现一次；出现一次；特异特异8 8核苷酸核苷酸约约65kp65kp出现一次。出现一次。目目 录录生物化学基因工程同功异源酶同功异源酶来源不同的限制酶，但能识别和切割来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同一位点，这些酶称同功异源酶同功异源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGA

46、TCC GBst目目 录录生物化学基因工程同尾酶同尾酶有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割但切割DNA后，能产生相同的粘性末端，这类酶后，能产生相同的粘性末端，这类酶称为称为同尾酶同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未这两个相同的粘性末端称为配伍未端端(compatible end) ，配伍未端可进行相互连接。，配伍未端可进行相互连接。 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A目目 录录生物化学基因工程2.DNA2.DNA连接酶连接酶(DNA ligase)(DNA liga

47、se) 基因工程的缝纫针基因工程的缝纫针 催化两条双链催化两条双链DNADNA分子的互补粘性末端或平末分子的互补粘性末端或平末端的端的55磷酸基团与磷酸基团与33羟基形成磷酸酯键。羟基形成磷酸酯键。目目 录录生物化学基因工程 EcoR I*GAATTC*CTTAAG*5353*G*C T T A A 5335OHPA A T T C* G*5335 P OHDNA连接酶连接酶作用模式图作用模式图连接粘性末端粘性末端目目 录录生物化学基因工程 连接平末端平末端Alu I*AGCT*TCGA*5353OHP5335 *TC *AG5335 OHPCT*GA*DNA连接酶连接酶目目 录录生物化学基因

48、工程（三）目的基因（三）目的基因 1. 1.定义：定义：应用应用DNADNA重组技术有目的地分离、获得某重组技术有目的地分离、获得某一感兴趣的基因或一感兴趣的基因或DNADNA序列，或某一感兴趣的蛋白质的序列，或某一感兴趣的蛋白质的基因基因, ,这些感兴趣的这些感兴趣的DNADNA序列或基因就称为目的基因或序列或基因就称为目的基因或目的目的DNADNA，又称外源基因。，又称外源基因。 2. 2.类型：有二种：类型：有二种： （1 1）cDNA cDNA (complementary DNA)(complementary DNA)是以是以mRNAmRNA或病毒或病毒RNARNA为模板，经反转录合

49、成的与为模板，经反转录合成的与RNARNA互补的单链互补的单链cDNA cDNA 。以单链以单链cDNAcDNA为模板经聚合反应可合成双链为模板经聚合反应可合成双链cDNAcDNA。 （2 2）基因组基因组DNADNA (genomic DNA) (genomic DNA)是代表一个细胞或是代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有生物体整套遗传信息的所有DNADNA序列。序列。目目 录录生物化学基因工程（四）基因载体（四）基因载体 （除红字外为了解）（除红字外为了解） 1.定义定义:为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些义的蛋白质所

50、采用的一些DNA分子。分子。 克隆载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计序列被扩增而特意设计的载体称为的载体称为克隆载体克隆载体。 表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录、翻译成多序列可转录、翻译成多肽链而特意设计的载体称为肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。目目 录录生物化学基因工程2.载体的选择标准载体的选择标准具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；选和鉴定；分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源D

51、NADNA。（5 5）具有适当的启动子、增强子等调控元件；）具有适当的启动子、增强子等调控元件；（6 6）生物安全性好。）生物安全性好。 3.常用载体常用载体 质粒质粒DNA、噬菌体、噬菌体DNA、病毒、病毒DNA目目 录录生物化学基因工程1. 1.质粒质粒 (plasmid)存在于细菌染色体以外的小型环状双链存在于细菌染色体以外的小型环状双链DNA分子分子目目 录录生物化学基因工程质粒的特点：质粒的特点：有限制性内切酶切口，有限制性内切酶切口，便于插入外源性便于插入外源性DNA。 能在宿主细胞内独立自主复制；能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息，带有某些遗传信息， 会赋予宿主细胞一些

52、遗会赋予宿主细胞一些遗传性状。例如，质粒含有抗药性基因，使细菌传性状。例如，质粒含有抗药性基因，使细菌对青霉素、四环素或重金属产生抗性，有利于对青霉素、四环素或重金属产生抗性，有利于基因工程中筛选转化子细菌；基因工程中筛选转化子细菌；目目 录录生物化学基因工程(2). (2). 有三种构型：有三种构型：超螺旋型超螺旋型（SCSC）、）、开环型开环型(OC)(OC)及及线型线型(LC),(LC),在一般实验条件下三种在一般实验条件下三种构型的构型的DNADNA分子电泳时，一般分子电泳时，一般SCSC最快，最快，LCLC次之，次之，OCOC最慢。最慢。- +OCLC SC目目 录录生物化学基因工程

53、 pBR322 pBR322质粒是较早构建的质粒载体。是由天质粒是较早构建的质粒载体。是由天然质粒然质粒pSC101pSC101、CoLE1pCoLE1p和和SF2124SF2124构建而成。构建而成。1、pBR322质粒质粒特点：特点： 其分子量比较小，为其分子量比较小，为4363bp； 含有一个复制起始点含有一个复制起始点(Ori)及与复制调节有关及与复制调节有关的序列，故能自我复制；的序列，故能自我复制；目目 录录生物化学基因工程 含有抗氨苄青霉素含有抗氨苄青霉素(ampr)和抗四环素基因和抗四环素基因(tetr)，分别编码抗氨苄青霉素和抗四环素的酶，分别编码抗氨苄青霉素和抗四环素的酶，

54、使细菌产生抗性。便于重组转化菌的筛选。在使细菌产生抗性。便于重组转化菌的筛选。在ampr和和tetr上各有一些限制酶切位点，这些酶切上各有一些限制酶切位点，这些酶切位点提供了外源位点提供了外源DNA插入质粒的缺口。当外源插入质粒的缺口。当外源DNA插入这些位点时，插入这些位点时，ampr和和tetr基因失活，使基因失活，使细菌失去抗生素抗性，可用于重组转化菌的筛选。细菌失去抗生素抗性，可用于重组转化菌的筛选。 有多种单一酶切位点。可在酶切位点处插有多种单一酶切位点。可在酶切位点处插入外源入外源DNA。生物化学基因工程目目 录录目目 录录生物化学基因工程 噬菌体噬菌体DNA改造成的载体系统改造成

55、的载体系统: gt系列系列（插入型，适用（插入型，适用cDNA克隆）克隆） EMBL系列系列（置换型，适用基因组（置换型，适用基因组DNA克隆）克隆） 2. 噬菌体噬菌体(phage) 一种侵袭细菌的病毒。一种侵袭细菌的病毒。 常用作克隆载体的噬菌体常用作克隆载体的噬菌体DNA有有噬菌体噬菌体和和M13噬菌体。噬菌体。 M13噬菌体噬菌体DNA改造的载体系统改造的载体系统:（含（含lacZ基因）基因） M13mp系列和系列和pUC系列系列。它们是在。它们是在M13基因间隔区插基因间隔区插入了大肠杆菌的一段入了大肠杆菌的一段调节基因调节基因及及lacZ基因基因的的N端端146个个aa残基编码基因

56、，其产物是残基编码基因，其产物是半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的片段片段。目目 录录生物化学基因工程 含有含有pBR322pBR322的的复制起始点复制起始点、抗氨苄青霉素基因抗氨苄青霉素基因和和大肠杆菌乳糖操纵子大肠杆菌乳糖操纵子lacZlacZ的一段基因的一段基因，能编码，能编码半乳半乳糖苷酶的糖苷酶的片段片段。 突变型突变型lac-E.colilac-E.coli因编码因编码半乳糖苷酶半乳糖苷酶肽段的肽段的基因缺陷，只能表达该酶的基因缺陷，只能表达该酶的片断片断（酶的（酶的C C端）。端）。 及及片断单独存在均无片断单独存在均无半乳糖苷酶活性，必半乳糖苷酶活性，必须是在宿主细胞与克隆载体同时表达

57、两个片段时，须是在宿主细胞与克隆载体同时表达两个片段时，半乳糖苷酶才有活性。从而使特异性化合物变为半乳糖苷酶才有活性。从而使特异性化合物变为蓝色蓝色化合物。此称为化合物。此称为互补互补。M13 噬菌体噬菌体pUC：目目 录录生物化学基因工程 当当在在lacZ基因内插入外源基因时基因内插入外源基因时，lacZ基因不基因不能表达能表达片段，转染片段，转染lac-E.coli后，在含有底物后，在含有底物X-gal的培养基生长时出现的培养基生长时出现白色菌落白色菌落。当。当在在lacZ基因基因内无外源内无外源DNA插入时插入时， lacZ基因基因能表达能表达片段，片段， lac-E.coli 能表达能

58、表达肽，肽，基因互补基因互补形成有活性的形成有活性的半半乳糖苷酶，因此在含有底物乳糖苷酶，因此在含有底物X-gal的培养基生长时，的培养基生长时，菌落呈蓝色菌落呈蓝色。这种。这种lacZ基因内基因内-半乳糖苷酶基因的半乳糖苷酶基因的插入灭活（即插入灭活（即肽段不再互补）是常用的筛选重组肽段不再互补）是常用的筛选重组体的方法。称为体的方法。称为互补筛选法，互补筛选法，也称为也称为蓝白筛选蓝白筛选。 目目 录录生物化学基因工程 蓝白斑筛选蓝白斑筛选目目 录录生物化学基因工程目目 录录生物化学基因工程 3. 3.柯斯质粒载体柯斯质粒载体( (也叫粘性也叫粘性cosmid)cosmid) 是兼有质粒和

59、噬菌体双重特点的大容量载体，是兼有质粒和噬菌体双重特点的大容量载体，能插入能插入DNA片断片断3045kb左右。左右。目目 录录生物化学基因工程酵母人工染色体载体酵母人工染色体载体 (yeast artificial chromosome, YAC)细菌人工染色体载体细菌人工染色体载体 (bacterial artificial chromosome, BAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他载体：其他载体：目目 录录生物化学基因工程二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理基本原理基本原理目的基

60、因的获取目的基因的获取DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 生物化学基因工程 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程目目 录录目目 录录生物化学基因工程（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取 根据已知氨基酸顺序推导出基因的核苷酸序根据已知氨基酸顺序推导出基因的核苷酸序列，然后可用列，然后可用DNA合成仪人工合成目的基因。合成仪人工合成目的基因。先先合成小片段，再将小片段依次连接成一个完整基合成小片段，再将小片段依次连接成一个完整基因链。人工