中药益气化纤汤抗大鼠肺纤维化的实验研究

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减中药益气化纤汤抗大鼠肺纤维化的实验研究（作者：单位：邮编：）作者：蔡望喜，尹杉杉，常建方【摘要】目的观察益气化纤汤对肺纤维化模型大鼠肺泡巨噬细胞（AM）和肺间质巨噬细胞（IM）中转化生长因子B 1（TGF B1）mRNA 表达的影响。方法选用Wistar大鼠96只，随机分为假手术组、模 型组、益气化纤汤组（剂量为4g kg-1 d-1）、氢化可的松组（剂量为 20mg kg-1 d-1）;采用博莱霉素A5（剂量为6mg/kg）气管注入法复制肺 纤维化模型；分别于造模第7、28天分离培养AM、IM，采用分子原 位杂交法（ISH）检测TGF BmRNA的表达。结

2、果濮型组AM、IM中 TGfD B1mRNA表达阳性细胞百分率及积分光密度（D）值显著升高（均 P0.01）;益气化纤汤可显著降低 AM、IM中TGF BmRNA表达阳性细 胞百分率及D值（均P0.01）,其作用与氢化可的松相仿。结论益气化 纤汤治疗肺纤维化的作用可能与其能降低 TGF B的表达，抑制纤维 化的发展进程有关。【关键词】 益气化纤汤/药理学 肺纤维化/中药疗法 转化生长因子（3肺泡巨噬细胞/病理学 肺间质巨噬细胞/病理学 疾病模型 动物 大 鼠肺纤维化进程中转化生长因子3 1（TGF 31）的作用极为关键。 tgf 31是致纤维化关键性的细胞因子，它可以通过自分泌、旁分泌 等不同

3、的方式，调节细胞增殖、分化、移行，促进成纤维细胞对胶原 蛋白、纤维连结蛋白、蛋白多糖等细胞外基质的合成和沉积，从而导 致脏器纤维化的形成1。益气化纤汤为我院治疗特发性肺纤维化的验 方。本实验依据病理进程，分别收集实验第7天肺泡巨噬细胞（AM）、 第28天肺间质巨噬细胞（IM）标本，采用分子原位杂交法（ISH）观察 不同时间点巨噬细胞中TGF 31 mRNA的表达情况，探讨益气化纤汤 治疗肺纤维化的作用机制，现报道如下。1材料与方法1.1实验动物 雄性SPF级Wistar大鼠，体质量170210g， 由湖北省实验动物研究中心提供，合格证号为SCXK（鄂）20050005。1.2主要试剂与仪器益气

4、化纤汤（0.4g/mL）由湖北省中医院药 剂科提供，批号：20060101;注射用氢化可的松琥珀酸钠由天津市生 化制药厂生产，批号：20060204;博莱霉素A5为天津太河制药有限 公司产品，批号：050601;TGF p1原位杂交试剂盒购自武汉 Boster 公司，批号：060405;寡核苷酸探针序列： 5 _ACCTGCAAGACTATCCACATGGAGCTGGTG，5 TGTACAACAGCACCCGCGACCGGGTGGCCG，5gTACCAGAAATACAGCAACAATTCCTGGCG 3;Ficoll 细胞分 离液为美国GE公司产品，批号:289124;胶原酶I为美国Invit

5、rogen公 司产品，批号：124224IQNA酶由中国华美生物技术有限公司提供， 批号：2213123L。1.3动物造模2、分组及给药 大鼠用戊巴比妥钠(30mg/kg)腹 腔注射麻醉后固定于操作台上，颈部正中线切口，钝性分离暴露气管， 8号头皮针从气管软骨环间隙刺入气管，将博莱霉素A5 (6mg/kg)注入并使药物均匀分布在肺内，缝合肌肉、皮肤。假手术组除注入气管 的为生理盐水(NS)外，其他同手术造模法。将96只大鼠随机分为4 组，假手术组、模型组、益气化纤汤组和氢化可的松组，每组 24只。 假手术组及模型组均灌胃给予生理盐水10mL kg-1 d-1;益气化纤汤组灌胃给药益气化纤汤 4

6、g kg-1 d-1;氢化可的松组皮下注射氢化可 的松20mg kg-1 d-1，依据病理进程，各组大鼠分别于第 7、28天各 处死9只。1.4肺泡巨噬细胞、肺间质巨噬细胞分离培养3-4肺泡巨噬细 胞分离收集：第7天处死动物，收集肺泡灌洗液 3mL离心(4 C、 2500r/min x10min )，弃上清，用 NS 洗涤细胞 3 次(4 C、2500r/min X10min)。将沉淀与0.5mL NS混匀，取100山做细胞涂片(玻片用 多聚赖氨酸处理)，用1g/L焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的多聚甲醛固 定30min，蒸馏水冲洗4次，吹干，-20C保存。肺间质巨噬细胞分离培养：无菌新生牛血清

7、(FCS)于56 C水浴 30 min灭活补体，加入I型胶原酶、DNA酶配成含体积分数10% FCS 的RPMl1640消化液，其中I型胶原酶浓度为200U/mL，DNA酶浓度为0.02mg/L，抽滤灭菌，4C保存。第28天处死大鼠，常规消 毒，在超净工作台内，取右肺于无菌培养皿中。用DHanks液洗净， 剪碎肺组织，玻璃匀浆器研磨，离心(4 C、2500r/min xi5min)，弃上 清，加入消化液消化(37 C、体积分数5%CO2)23h后取出，离心 (4C、2500r/min xiOmin ) ,DHanks液反复吹打后过100目筛网(使 之成为单细胞)，离心(4C、2500r/min

8、 X5min )，弃上清。在试管中 加入适量Ficoll分离液，将沉淀与D Hanks液充分混匀，将混悬液 缓慢滴加于分离液面上，水平离心(4 C、2500r/min X20min )。离心 后管内分为3层，上层为血浆和D_Hank_s液，下层主要为红细胞和 粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细 胞为主的白色云雾层狭窄带，主要为淋巴细胞和单核细胞(包括巨噬细胞)，用毛细管吸取单个核细胞，置入另一试管中，加入5倍以上体积的DHanks液，离心(4C、2500r/min XOmin )， 洗涤细胞2 次，将灭菌盖玻片置于6孔板内，滴加分离的细胞，加入适量RPMIJ640培养

9、液，37 C、体积分数5%CO2培养23h，在倒置 显微镜下观察细胞贴壁后取出，生理盐水冲洗2次，在玻片上用DEPC处理的多聚甲醛固定30min，蒸馏水冲洗4次，吹干，-20C 保存。分子原位杂交(ISH)按试剂盒说明书进行。1.5观察指标1.5.1阳性细胞百分率 光镜下观察，胞质中出现棕黄色颗粒为 阳性，每一玻片随机取 5个视野，计算阳性巨噬细胞数，再根据 5 个视野中总巨噬细胞数算出该片平均阳性细胞比例。1.5.2积分光密度（D）样本玻片置于高清晰度彩色病理图文报 告分析系统（HMIAS_2000）配套的Olympus显微镜下，CCD系统摄 取细胞图像（40 X10），作尺寸及光密度定标。

10、每例标本随机选取100个分散、无重叠的目标细胞，采用不同彩色分刻法获得图形，由系统 计算出该切片TGF （31 mRNA阳性面积的D值。1.6统计学方法计量资料用F检验，计数资料采用Wilcoxon 秩和检验，组间比较采用多因素方差分析。2结果大鼠模型组AM、IM中TGF 31 mRNA表达阳性细胞百分率及 D值与假手术组比较显著升高（均P0.01），提示博莱霉素能造成大鼠 TGF 31 mRNA表达增高；氢化可的松组 AM、IM中TGF 31 mRNA 表达阳性细胞百分率及D值与模型组比较差异均有显著性意义（P0.05或P0.01）;益气化纤汤组与模型组比较， AM、IM中TGF 31 mR

11、NA表达阳性细胞百分率及 D值显著下降（均P0.01），提示益气化 纤汤组与氢化可的松组有同样的生物学特性，能干预博莱霉素造成的TGF 31 mRNA表达增高。结果见表1、表2，图1、图2（彩图见第 316页）。表1各组AM、IM中TGF 31mRNA表达阳性 P0.01， 与假手术组比较：P0.05，P0.01,与模型组比较3讨论对于肺纤维 化的发病机理，近年来细胞因子网络学说5备受重视，各种致病因素 引起肺泡上皮和（或）毛细血管内皮细胞损伤，外周血中免疫细胞聚集 到肺部，肺常驻细胞（主要是巨噬细胞）细胞因子的基因表达均增强, 分泌大量细胞因子，活化后与靶细胞特异受体结合，致使成纤维细胞、

12、成肌纤维细胞在病灶部位增殖，肺泡上皮细胞非正常增生，最终导致 肺泡与肺间质纤维化。肺泡巨噬细胞在肺纤维化时，不仅其数量和活性增加，细胞表 面抗原的表达也增加。作为在纤维化早期阶段升高的主要细胞类型之 一，它在最初损伤及伴随组织损伤后的炎症反应中起关键性的作用。 它能合成和释放大量具有多种生物活性的细胞因子（如TGF B1），在 肺纤维化发生、发展过程中发挥重要作用，并产生和自分泌大量介质， 对其他炎症和非炎症细胞起化学趋化剂和生长因子作用6。肺间质巨噬细胞位于肺间质内，其产生的生物活性物质可直接 作用于其他间质细胞及细胞外基质而影响肺间质的代谢。有研究表明7，IM的活化及其产生的生物学特性，对

13、肺纤维化的形成更有意义。TGFQ B1作为最重要的促纤维化细胞因子，是迄今发现的最强 的细胞外基质沉积促进剂，能作用于多个环节，刺激各种细胞外基质 成分的合成和沉积，产生细胞外基质（ECM）蛋白如胶原、糖蛋白、纤 维结合蛋白（FN）;是一种强大的细胞增殖调节剂，对成纤维细胞有增殖 效应，能够诱导特征性成纤维细胞向肌成纤维细胞表型转换，而肌成纤维细胞是胶原产生的主要位点；可抑制蛋白水解酶的产生，使细胞 外基质沉积进一步增加8。肺内许多细胞能分泌TGF B1，如肺泡巨噬细胞、上皮细胞、 内皮细胞、成纤维细胞等，其中巨噬细胞被认为是分泌TGF B1的主要细胞9。因此，研究肺纤维化AM，特别是IM中T

14、GF （31的变化，对揭示肺纤维化的发病机理具有特别重要的意义。本实验结果显示, 博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠，其肺泡炎症期 AM、肺纤维化期IM 中TGF BlmRNA表达与假手术组比较均显著性增高（P0.01）,提示这 些变化可能是肺纤维化演变发展的重要原因。中医学认为，”肺虚络痹”是肺纤维化的基本病机。若肺气亏虚， 络中血气运行无力，而血气瘀滞于肺络之中则形成肺虚络阻之证。治当益肺补气，活血通络。叶天士在临证指南医案指出：”大凡络虚，通补最宜”，其所谓补是补益络中之血气，通是化其痰瘀以疏通 络道10。益气化纤汤由黄芪、虎杖、水蛭等组成。方中黄芪为君，味甘， 性微温，功能补气升阳，托毒生肌；

15、虎杖味苦性平，有祛风、利湿、 破瘀、通络等功效；水蛭味咸性寒入血，且破瘀通络而不伤正气，二 药为臣，共佐黄芪奏益气活血、化瘀通络之效。以上诸药并用，可从整体上对肺纤维化形成的诸多环节进行综合性干预，减弱或阻断肺内 持续进展的炎性细胞聚集，减少多种细胞因子尤其是致纤维化关键性 细胞因子TGF B1合成与分泌，调整致纤维化细胞因子与抗纤维化细 胞因子之间的平衡，减弱或阻断肺损伤后的异常修复过程， 延缓或阻 断肺纤维化的发生与发展。本研究结果表明益气化纤汤可减少AM，特别是IM中TGF； B1的表达，减弱细胞因子网络对于肺纤维化形成 的促进作用，抑制纤维化的发展进程。【参考文献】1 Sempowsh

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