电化学作业1-30章-1532052-殷保祺

1、30 等离子纳米结构修饰的酶电极的光谱电化学介绍.1014纳米多层电极. .1016粗糙银电极. .1016Au-Ag和Ag-Pt电极. . . 1018光谱电化学. . . .1020Ag-TiO2电极. .1022计算拉曼增强因子.1023确定生物电催化中电子转移的途径. . 1025人亚硫酸盐氧化酶. 1027膜结合的氢化酶（MBH）. . . 1028转换率的测定. 1029结语. . 1029参考文献. . 1030摘要纳米贵金属表现出独特的光学性质。其中性质之一就是在光照射下，能够产生局部表面等离子体共振,这使得它可以通过表面增强光谱学来研究吸附的分子成为可能。通过电化学的粗加工或

2、电沉积方法可以使金和银纳米结构的电极带有等离子体的属性。为了研究酶/电极系统的金属表面必须进行官能化使其具有生物相容的表面层。一旦电极并入到电化学电池系统就可以通过光谱电化学进行研究。这种组合方法催化效率可以通过电化学方法测得而酶的结构状态是通过表面增强拉曼光谱探测。本章将罗列一些由电化学方法来构造等离子电系统的技术。焦点是将混合形成的电极系统,让它可以研究酶/电极间的相互作用而非离子体接口。此外光谱电化学对几个酶/电极系统进行了讨论。它表明了电化学与光谱的结合方法可以用来深度观察酶表面的功能。这些信息可以被用于设计合理的生物传感器和生物燃料电池。关键词酶生物燃料电池 纳米贵金属 表面等离子体

3、共振 表面增强拉曼光 光谱电化学 结构与功能的关系介绍纳米贵金属表现出独特的光学性质。其中性质之一就是在光照射下，能够产生局部表面等离子体共振1。表面等离子体共振是指在金属表面存在的自由振动的电子与光子相互作用产生的沿着金属表面传播的电子疏密波。根据纳米结构的尺寸、几何形状和化学成分, 在特定波长的入射光下可以使光子和电子气之间达到共振耦合。在共振条件下，表面等离子体会在金属/介质界面会产生一个强大的局部电场，这可用于表面束缚分子的光谱分析。最先进的光谱分析方法是利用表面增强拉曼光谱学(SER)，它有很强大的关于识别表面束缚样本的分子和结构的能力。 相比于更容易应用和不需要高成本设备的电化学粗

4、加工或电沉积技术，各类文献中所描述的构造具有光学性质的等离子体纳米结构大多数都是基于高成本的光刻方法2-6。虽然它们缺乏表征表面形貌，但电化学构造的纳米结构表现出的等离子增强已经满足表面增强拉曼光谱学。另外这些等离子体载体可以作为电化学电池的工作电极，在其上面进行的氧化还原反应过程中可以用光谱来分析被吸附的分子5。等离子体电极系统的兴趣点是生物传感器和生物燃料电池领域的开发。在酶生物传感器中，酶/电极系统的电催化响应可用于底物识别6, 而生物燃料电池的酶/电极复合体用于燃料的产生或消耗7。这些系统的优化需要对表面结合的酶的结构与功能的关系有着详细的认知。这可以通过同时使用电化学和光谱的方法来获

5、得。这样组合的好处在于,催化效率可以通过电化学测试得到,而酶的结构是通过表面增强拉曼光谱探测获得（SERS）。 然而,电极材料的选择对于酶/电极系统的效率有着很大的影响。生物电催化中的标准材料包括贵金属如金，铂或金属氧化物如二氧化钛和纳米铟锡金属氧化物8,9。在可见区域的激发波长下，等离子体增强最大的是银, 它用于SER光谱的标准载体材料。然而，银作为生物电催化负载材料只起到次要的作用。这使得从SER光谱电化学所取得的成果难以转化成现实中的系统。解决这个问题的几种方法将在以下部分中描述: “纳米多层电极” 被设计成等离子体混合含银电极作为等离子体放大器而不是酶吸附的金属或金属氧化物界面。氧化还

6、原蛋白细胞色素C（Cyt c）和细胞色素b5（Cyt b5）被用作模板酶。在 “拉曼增强因子的计算” 这一节，它说明了在电化学方法帮助下可以计算出这些体系的表面磁场增强因子。 “生物电催化中的电子传递途径”描述了电化学和表面光谱如何相结合来分析，以两个含血红素的酶为例（人亚硫酸盐氧化酶(hSO)10和膜结合氢化酶三聚物）11。对上述光电系统中的酶/电极体系的调查汇总在表1。纳米多层电极本节中，使用电化学粗糙化的银和含有多层电极的银将就关于两者在酶/电极体系的SERR光谱电化学中的差异进行讨论。调查的结果汇总在表2中。粗糙银电极纳米银和其他贵金属电极可以通过电化学表面粗化的过程来构造。氧化还原循

7、环法(ORC)应用于金属电极抛光。根据金属的氧化还原电位,时变位势的顺序可应用于纳米表面的形成。粗糙银电极表现出的SERS活性可以很容易地由ORC技术测得。在图1 b，从电化学粗糙银电极的扫描电镜照片可以看出这是一个随机的珊瑚状纳米结构。Tian等人详细描述了关于什么样的序列施加到银和其他金属上可以达到最佳的SERS活性12。与光刻方法制成的高度有序的纳米结构相比，没有明显的共振频率可以来确定电化学电极的粗糙度。特别是粗糙银电极可以在一个波长范围从400nm到近红外区来实现表面的增强13。虽然这非常广泛的增强范围不利于吸附物的信号强度,但有利于激发线的选择。为了利用所述共振拉曼（RR）的效果，

8、应选择分子吸收最大值的分析物，所以要特别选择生色团和入射光的波长。这个特定分析物的分子吸收最大和一个特定的表面等离子体共振的纳米电极不一定会匹配。粗糙电极的增强的宽范围，使它更容易将表面增强和共振拉曼散射的作用结合起来,并以应用于表面增强共振拉曼光谱(SERRS)对于吸附物的分析。图1(a)纳米多层电极的制备方案。大部分银电极先进行电化学粗糙(步骤1),然后涂层绝缘介质隔离钝化 (步骤2)。第三步金属离子附着在涂层电极发生电化学还原从而形成一个覆盖物薄膜。银电极的SEM照片显示以下步骤:粗加工(b)，二氧化硅涂层(c)，覆盖物沉积铂(d)，覆盖沉积物金(e)。(f,g) Ag-SiO2-Pt多

9、层电极的电场计算电极几何形状没有(f)和(g)的缺陷。缺陷的引入到Pt表面促进局部增强在Pt/水界面 20Copyright 2009 American Chemical Society, Feng et al. 23 Copyright 2010 Wiley-VCH and Ly et al. 26 Copyright 2012 American Chemical Society除了银，其他的贵金属如金和铜等也能够在红外和近红外区产生表面等离子体共振。然而，银仍然是唯一在波长范围从500到400nm范围内产生等离子体局域增强的的材料。许多常见的蛋白质辅酶因子如血红素或黄素在这个范围分子吸光度

10、很大。用SERR分析生物系统,只有银可以作为负载材料。电化学调查发现银是第二选择材料,银电极的窄电位范围限制了它们的适用性，如传感器的发展。此外对于蛋白质电化学研究发现，银的生物相容性低，不利于吸附蛋白质。在银表面上涂薄层自组装单层膜14，SiO215或高分子聚合物16可改善其生物相容性。任何涂层,增加了分析物与等离子体银表面的距离,从而减少分析物信号强度。介电涂层的厚度为大致2nm，这种效果是导致SER强度下降了一个数量级17,18。如果看电介质的表面电场的衰变，这种距离效应可以合理化。局部表面等离子体可以视为偶极振荡。电场，通过这种振荡产生，将衰减与D3，D是偶极和分析物之间的距离。通过这

11、种振荡产生电场，将在d3处衰变，d是偶极子和分析物之间的距离。电场的强度是电场的绝对值的平方。另一个也必须考虑到,从分析物发射的拉曼散射光将会增强。因此,SER增强将引起第四电场大规模增强。这也导致SER增强正比于距离的近似值d12。这个近似值是在几个假设下成立的：首先，拉曼增强散射光和入射光的是一样的，这种入射光可能并不适用于具有非常明确的表面等离子体共振条件的等离子体材料。第二，周围环境必须由一个电介质组成，并且电介质具有均匀的介电常数。这些假设可以适用于涂单层介质的粗糙电极。因此d12距离与SER增强的关系可以得出在电极上涂上一层层分析物的不同厚度17,19。作为一个经验法则,这限制了S

12、ERR光谱研究比为4nm更近的等离子体表面分析物。Au-Ag和Ag-Pt电极如果单一介质涂层取代多层各自具有不同介电性能的结构，可以观察到SER增强依赖距离的强偏差性。一个例子是一个交替的绝缘涂层结构的电介质隔片和金属薄膜。在这种多层结构理论计算的预测是外界面上的增强电场在距离上远远大于体系中用单一均匀层的厚度20, 21。分析物在多层电极只有底层等离子材料组成时(如银)，实验出乎意料的发现SER信号非常高。这样一来高SERS活性多层电极可以非常简单的通过电化学沉积来进行构造，如图1。构造这些多层结构, 首先一个电化学粗糙化的银电极涂上一种由SAM 23或者二氧化硅薄膜组成的电介质隔片20,

13、22。功能化的SAM可以可通过链烷硫醇的溶液与一种适当的功能基团来在该电极上培养得到。隔片的厚度可通过选择SAM与不同长度的烷烃链进行调节。然而，利用这种方法只有涂层厚度达2.5纳米才可以获得。更广泛隔片厚度的的选择可以使用硅涂料，这种方法现在很完善24。二氧化硅薄膜是通过水解前驱体硅酸盐。二氧化硅涂层的厚度由前驱体的浓度控制25。生成的二氧化硅涂层覆盖在银电极完全不改变其表面的纳米结构,如图1c。引入的隔片需要钝化的银表面和把银从第二金属膜分离。该第二金属膜是通过涂层的银电极在含有各金属离子的盐溶液中培养出来的。静电吸引力也导致在电介质隔片顶上方吸附金属离子。因此隔片的功能化与金属离子的电荷

14、有关。AuCl4或PtCl4等带负电荷的离子, 涂有末端氨基的SAM银电极将是非常好的。在二氧化硅涂层的情况下，最后的功能化是用氨基丙基硅烷（APTES）来构造。电极在金属离子溶液被培养数小时后，它被放回到电化学细胞缓冲溶液。在施加负电势，被吸附的金属离子被还原。这个最后一步的结果是在涂层银电极的上方覆盖了一层金属薄膜。金属薄膜显示出了珊瑚状纳米结构，与底层银的形貌完全不同。典型的例子图1d，e 20，26。一般覆盖纳米珊瑚状的晶粒尺寸较小，该膜中含有大量的孔，光可以通过涂层与等离子体银表面相互作用。通过在图中1f，g26所示的覆盖膜/电介质界面的电场增强的计算证明了在覆盖膜上孔和缺陷的存在是

15、很关键的。那里的电场增强可以看出多层的像电极的几何形状。涂层由银作为固体载体，SiO2作为隔片层，以及Pt作为覆盖的金属。可以清楚地看出，含有缺陷的Pt薄膜层在铂/水界面可以促进场增强。这种含缺陷的薄膜可以由电化学沉积方法来构造。与此相反的其他技术，如薄膜溅射会形成一个封闭的膜。虽然这显然具有相对于表面化学的其它优点，但这不利于SER光谱的高表面增强。多层电极的高表面增强可以通过SER（R）来检测官能化的覆盖层金属膜负载的实验蛋白质所证实。与任一羧基或胺端基的SAM进行覆盖金属的官能化必须要避免蛋白质变性。合适实验分子是基于血红素氧化还原蛋白如细胞色素C（Cyt c）或细胞色素b5（Cyt B

16、5）。由于血红素辅因子的存在,，强SERR信号预计出现在紫激光的照射下，也就是该413nm的线性氪激光照射。而且这些蛋白质的氧化还原性质,在生物学中主要功能是作为电子传递单元,也可用于测试系统的电化学性能。细胞色素C负载被官能化的铂覆盖膜的SERR光谱，如图中2a所示。与观察到的光谱相比,如果蛋白质直接负载到功能化的银电极, 观察多层电极系统发现拉曼强度只有很轻微的损失。对于电介质隔片厚度约的2nm，如果分析物是专门结合到覆盖膜，可以观察到SER强度大致降低1.5-2倍。从氧化还原活性分析物的SER信号强度，拉曼信号的增强因子可以得出。“计算拉曼增强的因素”章节中详细描述中给出了计算步骤。覆盖

17、层的金属选择，拉曼增强因子(REF)扮演一个次要的作用。如果这个假设是电场增强是完全由等离子体银的负载造成的，这就可以合理化。覆盖的薄膜不是等离子体活性位点，仅反映了银表面等离子体的振荡偶极子。然而,隔片的厚度是不像人们预计的依赖d12那样至关重要。即使对于一个20nm二氧化硅间隔层,信号强度的降低仅仅是一个数量级23。选择金属用作覆盖物膜不再影响观察的距离的依赖性如图3中所示。光谱电化学SERR光谱电化学可用于探测在多层体系的氧化还原蛋白和电极之间的电子传递。当细胞色素C负载到金或铂覆盖膜，循环伏安法测量显示该蛋白在施加变化的电势时，快速的发生氧化还原反应。在图2 c曲线b中Ag-Pt电极作

18、为例子。比较细胞色素c与纯粗糙银(曲线a)的阴极和阳极峰振幅,可以估计蛋白质在多层系统的数量增加了3 - 4倍。在Ag,Au-Ag,Ag-Pt系统中，蛋白质的氧化还原电位是相同的。血红素辅基的氧化还原依赖性的变化,可以通过已经被密集研究过的血红素共振拉曼光谱很敏感的检测到27。被氧化和被还原的血红素辅因子的拉曼光谱在波段1300至1700cm1显示出明确的差异可以很容易地检测到。分析在不同的电位附加到金或铂覆盖层膜色素C的SERR光谱可使由此确定每个施加的电势还原和氧化蛋白质的摩尔比。图2a中细胞色素C的施加电位在-0.4 V和0.15 V（相对于Ag/ AgCl电极）的光谱。在卟啉环振动能级

19、（v4，v3，v2，和V10）的氧化还原依赖性的位移可以清楚地看到，该蛋白在各自的电势可被完全还原并氧化。图3拉曼增强因子（REF）在金属/蛋白质界面Ag- Au电极（空心正方形）和Ag-Pt电极（实心正方形）可以得出二氧化硅隔片的厚度图。(Reprinted with permission Ly et al. 26 Copyright 2012 American Chemical Society) 图2（a）氧化还原酶细胞色素C吸附于功能化的Ag-Pt电极分别施加电位-0.4v（顶部）和0.15 V（底部）的SERR光谱。（b）细胞色素b5吸附在AgTiO2电极并分别施加电位-0.3v（顶部

20、）和0.1 V（底部）的SERR光谱。（c）细胞色素C负载在功能化的银电极的循环伏安曲线（曲线a）和负载在Ag-Pt电极（曲线b）。氧化还原活性物质的量在Ag- Pt电极上增加。（d）用于不同的扫描速率（100，300，600，800，和1000 V/ S）对细胞色素b5负载在Ag-TiO2电极进行循环伏安测试(Adapted with permission from Ly et al. 26 Copyright 2012, Sivanesan et al. 28 Copyright 2013 American Chemical Society)Ag-TiO2电极 原则上由金属覆盖膜上自由电子

21、发生等离子体振荡会使覆盖层/分析物界面的信号增强是合理的。覆盖膜本身不能增强电场。然而，如果场已经被银所增强，覆盖膜为了和等离子体振荡所耦合，覆盖膜能够将电场输送到外部金属/分析物界面。如果覆盖膜是由金属制成，这样的解释是合理的。然而，如果TiO2用作覆盖膜材料，也能观察到强的拉曼信号28。 Ag-TiO2多层电极的构造和先前描述的银-金属电极非常相似。在这种情况下，主要区别是在银涂层中的隔片是羧基官能化的SAM。在酸性条件下二氧化钛纳米颗粒可以通过共价键合到SAM的羧酸酯基团从而达到TiO2吸附的目的29，30。在此过程的TiO2覆盖层岛膜的构造和在图中1d，e所示的金属薄膜看起来非常相似。

22、 由于其高的生物相容性，二氧化钛对蛋白质附着并不需要进一步的官能化。细胞色素b5是用作实验的氧化还原酶，因为它可通过羧酸残基共价结合到二氧化钛界面，这种结合方式和SAM的羧酸基团相同。细胞色素B5的SERR信号（图2b）可以看出，该酸性条件下的信号甚至超过蛋白质直接附着到一个官能化的银电极上的信号。若要用等离子体耦合来解释这种高拉曼信号并不像在金属膜的情况下简单。二氧化钛是半导体，没有自由电子可以和外部振荡场耦合。因此，说明几何效应也发挥了作用。也可能是这种情况，即二氧化钛层被放置在两个珊瑚状结构银之间。有趣的是，共价连接银也影响氧化钛纳米结构的电子特性。循环伏安测量显示氧化还原蛋白发生了强烈

23、的氧化还原反应和电子快速地从蛋白转移到电极上，如图2d。这是意料之外的，因为二氧化钛自身导电率相当差。然而，二氧化钛和银是通过隔片连接，可能是在这些条件下的银上的电子跃迁到了TiO231的导带中。这样的话就能够解释体系的高导电性。另外跃迁的电子能和等离子体耦合从而增强高SERS信号。总之，Ag-TiO2电极表现出非常有趣的性质。但其中SERS活性和快速的电子转移的机理仍然需要进一步阐明。计算拉曼增强因子给定的纳米结构的局部电场增强是一个很重要的参数，但从实验中不能容易地获得。实验可以获得正在研究的附着在表面分析物的SERS强度参数。原则上，如果表面结合的分析物分子的数量是已知的，拉曼增强因子可

24、以得出。根据该拉曼增强近似等于场强的功率，后者可以从REF值来计算。必须意识到测得的拉曼强度得出的是激光斑探测到的所有分子的平均增强因子。这个平均拉曼增强因子通常可通过下面的等式3得到：IR和ISERS分别是探针分子在溶液和吸附在SERS-active表面的拉曼强度。这些强度必须归一化到相同的积累时间和激光强度。NR和西NSERS是指在激光的焦点下分子的数目。这个数目与照射量VL和体积浓度CR和到照亮面积AL和在SER实验中的表面浓度SERS有关。而像CR，IR和ISERS等一些参数可以很容易地测定，但精确测定的表面覆盖度，激光照射量VL和表面积AL是非常难测定的。为了确定AL和CL，必须知道

25、非常精确的激光束半径rL。如果rL已知, 理想照亮电极的表面积是由AL =rL2可求得。然而,当我们观察纳米表面时, 这个方程需要乘以一个迄今未知的粗糙度因子f。VL近似等于一个半径为rL，高度h = 2 rL 2/的圆柱,是激光的波长。自真正的激光点的高斯光束的形状,它变得明显,六世给最高的拉曼增强因子的计算的不确定性。因为真正的激光光斑具有高斯光束的形状， VL也就造成了计算拉曼增强因子的高不确定性。测定表面覆盖度SERS将电化学测量结合使用氧化还原活性拉曼探针。在给定的扫描速率下，积分阴极或阳极电流Ia的峰面积，表面覆盖度a通过下列公式算出32：在这个方程中，n是转移电子的数量。T 、R

26、和F分别指温度、气体和法拉第常数。这个方程的高不确定性还是纳米电极的表面积A的值。为了解决这个问题，电极面积等于其几何面积A0和它的粗糙度系数f的乘积表示(即Ao指理想平电极暴露于电解质溶液的面积)。如果SERS和电化学实验探测相同的分子，等式1可以由等式3替代， REF的公式为：公式3现在只包含实验参数。然而，应用公式3时有两点须加以考虑。第一， 能产生SERS信号的所有分子也具有电活性，这个等式才有效。这里使用细胞色素C作为模型分析物的优点更显而易见，当它吸附在羧基官能化的电极表面时显示出高共振拉曼强度，完全具有氧化还原活性。然而，即使当表面分子只有一部分具有电活性的情况下，SERS测量可

27、以被用来确定氧化还原惰性的摩尔分数。这个摩尔分数是等式3中分母的一个因子。第二，假设SERS光谱实际上能看到在激光光斑内的全部分子。因为由于纳米结构表面，一些分子被激光屏蔽，这个假设不一定是真实的。因此在计算中，REF可能是算得偏小。确定生物电催化中电子转移的途径在 “纳米结构多层电极”这一章，SERR光谱电化学研究了蛋白质和纳米结构电极之间的氧化还原化学。相同的技术也可以应用于酶体系中电子转移过程的耦合的催化反应。理解这种酶/电极复合体之间的催化底物转化和电荷转移的相互作用是生物传感器和生物燃料电池领域发展高度关注的。为获得有效的底物转化，酶结合到官能化的电极表面的方式要有一定的条件，第一催

28、化反应不会改变，第二，电子非常快地转移到电极上。这就需要恰当的电极功能化,阻止酶变性,促进一个从电极催化中心的封闭电子传递途径。尽管对于每种酶最佳反应条件必须单独发现，某些固定的策略已经显示出巨大的潜力。一个就是酶经由特定单个氨基酸残基的共价键和载体结合完成，如一个表面暴露的半胱氨酸。虽然这种固定的策略无疑控制了酶取向，但也强烈地限制了其表面流动性。如果酶表现出显著偶极矩，静电吸引可用于固定化。虽然这个策略不能控制酶的取向，但它可以提高酶表面流动性。当酶能够随时间在表面上的取向不同，这种流动性将有利于电荷转移。电化学是一种强大的技术来确定电子转移和催化流动率。然而不能用于确定表面活性物种。此外

29、氧化还原或催化中心的结构信息,将有助于理解电子转移的机理和底物转换，但不能通过应用电化学来得到这个信息。这个信息可通过SER光谱学得到, 但SER光谱不能求出整体催化效率。因此,只有这两种方法的结合才可以描绘出在电极/酶界面发生的过程。其他的视野可以由是时间分辨（TR）-SER光谱给出。拉曼测量中施加电位或加入底物33的变化像是触发器。图4a是TR-SERS的绘制图。获取它的图谱比一个SER光谱所需的累积时间小得多，该反应必须被反复触发。在这种情况下，激光只能在延迟时间后短时间用探针来触发。图4（a）延迟时间后底物增加或电位变化的SERR图。 （b）加入亚硫酸前后的HSO的SERR光谱。 （c

30、）低（曲线a）和高（曲线b）离子强度缓冲条件，氨基官能化电极上HSO的循环伏安图。 （d）H2加入前后的MBH的SERR光谱，表示由于H 2分裂后，血红素得到还原。 （e）官能化电极上MBH的循环伏安图，证明固定化酶的催化活性（f，g）电极上HSO和MBH的电子转移途径。第一种情况下，符合催化活性的要求的电子转移是通过血红素;在第二种情况下它不是。(Adapted with permission from Sezer et al. 35, Copyright2010 Royal Society of Chemistry and Sezer et al. 37, Copyright 2011 A

31、merican ChemicalSociety)催化中心本身是否可以通过SERRS来进行分析很大程度上取决于它的光学特性。虽然一些辅因子如黄素和血红素做有在可见光区域强吸收（并因此高RR信号强度），但许多其他如Fe-Ni或钼（Mo）催化中心却没有。所以后者不能用SERR光谱来分析。但是，催化活性在很大程度上依赖于从催化中心快速供应和消耗电子。在许多含血红素亚基的酶具有这样的特性。但对于大多数酶，在固体电极固定时，电子传递途径和动力学会发生改变。虽然催化中心仍然完好无损，但酶催化周期可能会停止。 SERR光谱和电化学联用可同时探测血红素辅因子的结构变化和催化周期电流，因此能够确定复合酶系统中电极

32、表面的电子转移途径。这将在从氧产碱杆菌获得人类亚硫酸盐氧化酶（HSO）和膜结合氢化酶（MBH）三聚体来证明。在生理条件下，在这两种酶的电子传递途径都是通过血红素亚基进行。然而，它们在电极上的行为是完全不同的。人类亚硫酸盐氧化酶(hSO)亚硫酸盐氧化酶（SO）可催化亚硫酸盐氧化成硫酸盐，在生命有机体中亚硫酸盐解毒发挥着至关重要的作用。，SO/电极系统的亚硫酸盐检测传感器可以用作在食品和葡萄酒的生物技术中34。人类亚硫酸盐氧化酶（HSO）由三个部分组成，一个部分是催化钼（Moco）中心，第二个部分包含一个血红素辅因子。第三部分可用于二聚化。钼中心和血红素域通过循环松散地联系在一起。这种灵活性可使血

33、红素瞬间和钼中心结合，并消耗亚硫酸盐氧化期间产生的一个电子。然后该组成部分再短暂地脱附和结合外部的细胞色素C。然后循环重复就是第二电子发生过程。对氨基功能化纳米银电极上HSO的SERR光谱调查显示，血红素辅基35的振动指纹图谱有着很强的拉曼信号。获得很强的SERR信号是使用低离子强度缓冲液（10 mMTris），这表明在这种条件下固定在表面上的酶的量很多。但是，电化学响应是微弱的，因为在亚硫酸盐（图4c曲线a）的存在下，没有观察到催化电流。这一观察表明，电子传递途径是在某些点是中断的。电位SERR光谱表明施加一个电位时，血红素可以充分氧化和还原。因此，电子传递的中断不会血红素和电极之间发生。如

34、果缓冲溶液的离子强度增加，情况急剧变化。然后在亚硫酸盐的存在下，伴随着SERRS的开路电位来还原血红素（图4b），观察到了有效的催化周期（图4c曲线b）。这里血红素还原可由v4的振动偏移来识别，从1372cm-1（氧化血红素）到1360cm-1（还原血红素）。整体SERR信号强度却降低了，但可以通过降低离子强度得到恢复。这表明酶不会在高离子强度下发生解吸。然而，血红素域和电极之间的相互作用是微弱的，使得酶在接近电极的构象和接近钼的构象会发生转换如图4f。这种灵活性才使得一个从催化中心到电极的封闭的电子途径得以存在。膜结合的氢化酶（MBH）固定化策略无法广义适用于其他的酶/电极系统。在这方面一个很好的例子就是由真氧产碱杆菌（MBH）提取的膜结合氢化酶三