miRNA在腭裂发生过程中对Wnt信号通路调控作用的研究进展

1、miRNA在腭裂发生过程中对Wnt信号通路调控作用的研究进展先天性唇腭裂是指胚胎发育过程中由多种因素引起的颅颌面部发育受阻或不全所导致的出生缺陷性疾病，其发病机制不明，目前认为由遗传因素和环境因素的共同作用所致。根据伴有或不伴有其他全身系统疾病，先天性唇腭裂分为综合症型唇腭裂和非综合症型唇腭裂。先天性唇腭裂全球发病率约为1.43，而我国发病率高于全球水平，为1.67。先天性唇腭裂不但影响患者的言语、美观、功能等，同时也给患者及其家属带来巨大的经济压力和精神负担。近年来，通过大量实验研究发现了Wnt信号通路、miRNA在腭发育过程中的重要调控作用，研究已经发现了miRNA可参与调控Wnt信号通路

2、相关因子在腭发育过程中的传导，其突变可能导致腭裂的发生。本文主要对miRNA通过在腭裂发生过程中对Wnt信号的传导进行综述，以期为腭裂防治提供新思路。1.miRNA与Wnt信号通路1.1miRNA人类的基因组中约有93%的序列可以被转录，但其中仅有2%具有编码蛋白质的功能，其余的98%被称为非编码RNA（noncodingRNAs，ncRNA）。miRNA是一种内源性、非编码的、小分子RNA，作为基因表达的转录后抑制因子，通过其与信使RNA（messengerRNA，mRNA）的3非翻译区（untranslatedregion，UTR）上的互补靶点结合而发挥作用。单个UTR可能具有多个miRN

3、A的结合位点或单个miRNA的多个位点，表明了这些调控RNA对基因表达的转录后调控是机制复杂。大多数miRNAs在细胞核中被RNA聚合酶II（RNApolymeraseII，PolII）转录，pri-miRNAs的转录被Drosha及其主要辅助因子DGCR8裂解，裂解为前体miRNA（pre-miRNA）后至细胞质中。在miRNA生物形成过程中，RNase酶Dicer1通过切割前体miRNA，并产生成熟miRNA来参与miRNA加工的最后一步，成熟miRNA作为RNA诱导沉默复合物（RNAinducedsilencingcomplex，RISC）的一部分，与mRNAs内的靶点相互作用并诱导立即

4、切割或转录后抑制。miRNA参与了多种组织器官中的发育过程，包括上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）、细胞迁移、分化、增殖和凋亡等一系列过程。miRNA在调节细胞分化中起着重要作用，其机制可能与抑制mRNA转运有关。1.2Wnt信号通路目前主要发现了3种Wnt信号通路：经典Wnt/-catenin信号通路，主要参与胚胎发育的调控、细胞增殖、迁移等一系列过程；非经典Wnt/Ca2+通路，参与调控细胞黏附和细胞活力；非经典平面细胞极性通路（planarcellpolarity，PCP），参与细胞骨架重组、细胞极性的建立和细胞运动。作为进化上保

5、守的Wnt信号蛋白，其在组织器官的生长发育、体内平衡及疾病的控制中发挥着重要的作用。在经典Wnt/-catenin信号通路途径中：当Wnt配体不存在时，细胞内-catenin不断磷酸化，被-catenin复合物即腺瘤性息肉病杆菌（adenomatosispolyposiscoli，APC）-轴蛋白（Axin）-糖原合成酶激酶（glycogensynthasekinase，GSK-）中的GSK-3降解，使磷酸化的-catenin通过蛋白酶系统去除。在Wnt配体存在时，与跨膜受体卷曲蛋白（Frizzled，Fzd）及辅助受体低密度脂蛋白受体相关蛋白（lowdensitylipoproteinrec

6、eptor-relatedprotein，LRP）结合后，激活细胞内的散乱蛋白（Disheveled，Dsh），并使Dsh与Axin结合，从而抑制GSK-3的激活后使-catenin复合物无法形成，存在于胞质中过多的-catenin进入细胞核，并与T细胞因子（Tcellfactor，Tcf）1/淋巴增强因子（lymphoidenhancingfactor，Lef）1结合，调节各种细胞/组织中Wnt关键靶基因的转录激活。非经典通路主要有以下两条：平面细胞极性通路中，Wnt蛋白与Fzd及辅助受体（tyrosinekinase-likeorphanreceptor2，Ror2或receptortyr

7、osinekinase，Ryk）相结合，激活小G蛋白（Rho或Rac1），进而激活转录因子c-Jun和活化转录因子（activatingtranscriptionfactor，ATF2）来参与下游转录因子的调控。Wnt/Ca2+通路中，Dsh向Fzd的募集导致三聚体G蛋白Ga/Gb/Gc的募集和磷脂酶C（phospholipaseC，PLC）的激活。这种酶作用于细胞膜中的磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸，产生三磷酸肌醇（inositoltriphosphate，IP3）和二酰甘油（diacylglycerol，DAG）。IP3会释放细胞内的钙，从而激活钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（calmodul

8、in-dependentproteinkinase，CamKII）和控制细胞黏附、迁移的转录因子NFAT。DAG激活蛋白激酶C（proteinkinaseC，PKC）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinases，MAPKs），参与控制不同的细胞活动。2.Wnt信号通路在腭裂发生中的调控作用近年来，大量研究已经发现了Wnt信号通路相关因子突变与腭裂的发生密切相关。哺乳动物基因组中各自有基因编码的19种Wnt配体蛋白受体和共受体起作用。在19个Wnt配体中，已经发现了Wnt2、Wnt2b、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7b、Wnt9a、W

9、nt10a、Wnt10b、Wnt11以及Wnt16在腭前体中均有表达。在人群中Wnt3、Wnt3a、Wnt5a、Wnt7a、Wnt8a、Wnt9b以及Wnt11的单核苷酸多态性（single-nucleotidepolymorphisms，SNPs）与非综合征型唇腭裂（nonsyndromiccleftlipwithorwithoutpalate，NSCLP）有关。其中Wnt3a、Wnt5a和Wnt11与NSCLP呈显著相关。Wnt3a的外显子抑制GSK-3的活性，使-catenin核移位，并激活Tcf1/Lef1转录因子，使WNT/-catenin相关基因在心肌成纤维细胞中的表达。相关研究已

10、经证明了GSK-3作为Wnt信号通路中相关因子，在腭发育中起着重要作用，其突变与腭裂发生密切相关。研究还证明了Wnt3a的突变与腭裂发生有关，但Wnt3a在腭裂发生过程中的作用是否与在心肌成纤维细胞中的作用一致，有待进一步研究。He等发现Wnt5a基因通过Ror2介导的非经典Wnt信号通路调节小鼠腭部发育，Wnt5a及其受体在腭发育过程中沿前后轴呈梯度表达，其中前轴表达较高，后轴其表达水平较低。当缺乏Wnt5a时，可通过调节细胞定向迁移而导致腭裂发生。有研究指出，Wnt11仅在发育中的腭中缝上皮（medialedgeepithelium，MEE）中表达，提示其在腭融合过程中可能发挥着作用。Le

11、e等体外实验结果表明，Wnt11基因的敲除会导致持续的腭中缝（midlineepithelialseam，MES），并阻止腭骨融合，从而导致腭裂的发生。Abdul等再次证明了Lee的观点。研究已经证明了APC、Axin1、Ctnb1、Dvl2和GSK-3的位置和功能在Wnt信号通路中发挥着重要作用，且Axin1、Ctnb1、Dvl2和GSK-3基因多态性与腭裂发生的相关性已被证实。其中GSK-3rs13314595与NSCL+P之间存在显著的相关性。小鼠GSK-3失活导致腭裂，该基因被认为是腭裂的内在调节因子。APCrs448475与NSCL+P有微弱的相关性，但其SNPs可能在基因表达中发挥

12、作用，其在基因30非翻译区（UTR）中的位置与miRNAs的潜在相互作用。3.miRNA在腭裂发生中的调控作用miRNA作为非编码基因组的一部分，由于其与癌症、心血管疾病、糖尿病和许多发育障碍等一系列复杂疾病的关系而引起关注。miRNA在腭发育过程中发挥着重要作用。一些miRNA（如miRNA140、miRNA-17-92簇、miRNA-200b、miRNA-133b）在斑马鱼和小鼠模型以及人类中均被报道与腭裂的发生密切相关，其中已经发现了miR-140通过调控神经嵴细胞的迁移、miR-200b调控腭融合、miR-17-92b簇调控腭板生长来调节腭发育过程。Shin等发现了miR-200b特异

13、性表达于腭发育中的上皮细胞，并作为Smad2、Snail、Zeb1和Zeb2的新靶点，可直接靶向结合于Smad2、Snail、Zeb1和Zeb2，进而影响发育中的腭上皮和间充质组织，最终导致两侧腭突融合失败而产生畸形。Eberhart等在研究斑马鱼胚胎发育过程中，发现了miR-140靶向结合于血小板衍生生长因子受体（platelet-derivedgrowthfactorreceptoralpha，PDGFR-），并通过升高或抑制miR-140的表达而导致腭部发育畸形。Li等实验证明miR-17-92簇通过靶向结合于TGF-1介导信号通路的下游分子TGF-2受体和Smad调节腭间充质细胞的增殖

14、抑制与胶原蛋白合成从而影响腭发育。Wang等通过实验发现了缺乏miR-17-92表达的小鼠通常患有腭裂和双侧唇裂，这可能是由于直接靶点Tbx3、Osr1、Fgf10和Shox2的失调所致。4.Wnt信号通路相关miRNA调控腭裂发生的机制Wang等发现has-miR-27b-3p、hsa-miR-720、hsa-miR-1260b、hsa-miR-24-3p和hsa-miR-205-5p在NSCLP患者组织中高表达，并证明了hsa-miR-205-5p和hsa-miR-24-3p调节GSK-3和Axin2的水平。GSK-3和Axin2作为Wnt信号通路中的重要调控因子，在颅面部形态发生过程中对

15、细胞命运的调控具有重要的进化保守作用，其异常突变可导致腭裂的发生。而王鑫等利用miRNA芯片技术将NSCL/P患者的唇腭部组织的miRNA表达谱与健康新生儿脐带组织的miRNA表达谱进行比较研究后发现了差异表达的miRNA，并通过生物信息学软件对表达显著差异的10个miRNA进行靶基因预测，结果显示：hsamiR-1260b，hsa-miR-205-5p，hsa-miR-24-3p，hsa-miR-27b-3p和hsa-miR-720均通过靶向结合于Wnt5a、Wnt9b、Wnt10a等Wnt家族中的信号分子，从而影响唇腭部细胞的增殖、凋亡、分化和黏附。Yu等通过使miR-205与GSK-3编

16、码蛋白的3UTR结合后抑制GSK-3表达，证明了GSK-3是miR-205在3T3-L1脂肪细胞中的直接靶点，miR-205对GSK-3表达的抑制导致Wnt通路的激活，从而在上皮细胞内稳态中发挥着重要的作用。GSK-3作为Wnt信号通路中的重要调节因子，在腭裂发育中的作用也已经被大量实验证实。Liu等发现了GSK-3纯合子缺失小鼠表现为腭裂、中线肋骨和胸骨不完全融合以及胸骨骨化延迟。Wnt4是hsa-miR-24-3p靶向结合Wnt信号通路的一个成员，在腭上皮广泛表达，目前尚未有研究证明Wnt4的突变与腭裂发生的相关性，需进一步研究。Suzuki等通过对miRNA进行了细胞增殖与生存能力测定，

17、发现了miR-133b、miR-374a-5p和miR-4680-3p过表达导致人腭胚突间充质细胞培养物细胞增殖活性降低30%以上。研究还发现了通过miR-4680-3p处理的人腭间充质细胞中，Wnt5a的表达显著下调，再次证明了He等的观点。王俊伟等36通过实验发现了miRNA-133a-3p是Wnt通路重要转录调节因子，其差异表达倍数上调达到182倍，并基于先前实验可推测miRNA-133a-3p的高表达对Wnt通路起到抑制作用，导致Wnt信号通路相关基因的缺乏，使细胞的定向迁移消失，协同其他上调miRNA最终导致唇腭裂的发生。虽然目前没有直接证据表明miR-1260b是如何调节Wnt基因并影响腭部融合的。但Hirata等发现miRNA-1260b可以抑制分泌卷曲蛋白相关受体蛋白1（secretedfrizzled-relatedreceptorprotein1，SFRP1）、Dkk2和Smad4，从而影响癌细胞的增殖和侵袭以及凋亡细胞的百分比。而Iwata等研究发现Smad4能协同调节小鼠腭融合过程中腭中缝上皮，因此可推测miRNA-