XB209单纯疱疹病毒实验室检测

1、实验室主题文件编号XGYYJ-6-XB-209东莞市谢岗人民医院性病实验室单纯疱疹病毒实验室检测第 - 9 - 页 共 9 页第 1 版 第 次修改颁布日期： 2012 年 1 月 1日单纯疱疹病毒实验室检测 单纯疱疹病毒是引起生殖器溃疡的主要病原之一。HSV包括HSVI型和HSV2型，多数生殖器疱疹有HSV2型引起。生殖器疱呈慢性复发过程，原发感染常表现为潜伏状态，尽管临床可以根据典型的水泡诊断生殖器疱疹，但三分之二的感染表现为无症状，且潜伏期排毒。实验室诊断对于无症状感染具有重要意义，不仅防止性传播，而且防止母婴传播。细胞学检查 原理 IISV感染宿主细胞可形成多核巨细胞，细胞经涂片染色，

2、通过检查多巨细胞病变帮助诊断。 材料 姖姆萨染液 巴氏染液 方法 1.标本采集： 疱液：用结核菌素注射器和25针头，穿刺水疱抽取疱液，转入病毒运输液中，或用针头刺破水疱后棉拭子吸取疱液。溃疡：用棉拭子抹去溃疡表面的痂皮或污物，再用干净拭子用力擦拭溃疡基底部，充分沾取组织液或渗出液。 宫颈：见淋球菌取材。 2.将标本涂片，室温干燥数分钟。 3.染色 皮肤黏膜标本用甲不相酵固定5-10分钟，用姖姆萨染液染30分钟，待干、镜检。 宫颈标本用95%乙酵固定15-60分钟，用巴氏溧色（见HPV染色），镜检。 结果 感染细胞呈胞浆空泡变，感染细胞相互融合成多核巨细胞，有时见核内包涵体。 注意事项 HSV感

3、染细胞在水疱或溃疡基底处，尽可能取水疱标本。 临床意义 查到多核巨细胞或包涵体可作辅助性诊断。但其敏感性较培养法低。HSV细胞培养 原理 HSV在体外感染细胞，引起细胞病变，通过观察细胞病变初步判断病毒的进一步结合免疫学方法鉴定。 材料 1.Vero、Hela和BHK细胞等 2.标本运输培养基（配制见附录I）。 3.HSV生长培养基（配见附录I）。 4.HSV维持培养基（配见附录I）。 6.HSV荧光单克隆抗体试剂。 方法 2.标本采集： 疱液：用结核菌素注射器和25针头，穿刺水疱抽取疱液，转入病毒运输液中，或用针头刺破水疱后，用棉拭子充分沾取疱液，洗入运输液中。 溃疡：用棉拭子去除溃疡表面的

4、痂皮或污物，再用干净拭子用力擦拭溃疡基底部，充分沾取组织液或渗出液，将标本洗入运输液中。 宫颈：见淋球菌取材。 标本置于运送培养基中，24小时接种，超过24小时应置于低温冰箱保存。 2.细胞复苏和传代：冻存细胞管于37速溶内容物 内容物移至细胞生长培养基中 375%CO2环境下培养8小时 更换生长培养基，再培养2-5天细胞成片倒去培养液加入5ml胰酶-EDTA洗涤倒去洗涤液加入5ml胰酶-EDTA液培养瓶置于37，4分钟细胞脱落转移至10ml生长培养基加入10%DMSO分装保存于超低温冰箱备用 3.单层细胞制备：胰酶消化细胞混合液计数调整细胞数量为1X105/ml分装24孔培养板，每孔0.5m

5、l37培养8小时单层细胞 4.标本接种与感染细胞：0.3-0.5ml标本培养孔（1-2孔）37，5%CO2下1-2小时吸去标本液，换维持培养基。37培养3-7日每日观察细胞病变（CPE）记录：0为无CPE；1+为25%细胞CPE；2+为25-49%细胞CPE；3+为50-74%细胞CPE；4+为75%以上细胞CPE。荧光单抗染色 5.染色镜检： 直接免疫荧光法：感染细胞涂片用甲醇固定10分钟，淋洗。加荧光标记单抗隆抗体，37染色30分钟。封片后镜检。 结果 感染细胞阳性可见苹果绿色荧光的包涵体。 注意事项 1.棉拭和木杆含有对病毒有影响的物质，应将标本洗脱到运输培养基后，弃去拭子。 2.使用阴

6、道制剂的病人标本不宜作HSV培养。 3.如果细胞生长过密，包涵体染色迵暗，则应降低培养中的细胞浓度。 4.如发现细胞生长稀疏、条束化，不能成片或被 染则应重开一瓶保存的细胞作培养。 5.不同病期的标本对培养阳性率影响较大。应尽可能取疱液。 6.正确保存标本，24小时不能接种的标本应放-70保存。 临床意义 细胞培养是诊断和鉴定HSV的“金标准”方法。敏感性特性均高。斑丘疹、水疱、溃疡、结痂性皮损标本中，HSV培养阳性率分别为25%、94%、87%、70%和127%。HSV抗原检测（ELISA法） 原理 将特异性HSV抗体（1、2型）包被在酶标反应孔上，加入含有HSV抗原的标本及酶标记抗HSV抗

7、体共同体孵育，反应形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，在底物作用下产生颜色，颜色的深浅与抗原量成正比。 材料 1.标本运送保存液 2.阳性对照 3.阴性对照 4.酶结合物 5.洗液 6.放大剂A（底物A） 7.放大剂B（底物B） 8.终止液 方法 1.标本收集：用无菌棉拭或涤沦拭子取疱液、溃疡液、痂皮组织、宫颈拭子或其它部位标本置于1ml保存液的标本瓶中，即做或2-8可保存三天，-20可保存四周。 2.标本处理：取新鲜标本或解冻至窒温标本，用强力涡漩振荡器振荡1分钟提取抗原。 3.阳性对照用前窒温涡漩混匀1分钟，阴性对照用前窒温涡混匀15分钟. 4.操作方法如下表待测标本阳性对照阴性对照20020

8、0200酶标抗体505050 37孵育90分钟，洗涤4次，每次2分钟底物A100100100底物B100100100 37孵育30分钟终止液505050肉眼观察或酶标仪比色测OD值（波长490nm） 结果 Cut-off值计算：Cut off=N+0.15 N=3孔阴性OD值之平均值 每孔OD值要符合要求 阳性：ODCut off+0.015。示疱疹感染 阴性：ODCut off+0.015。示没有疱疹感染 可凝：OD=Cut off+0.015。示不能确定，可考虑重做 注意事项 1.应尽量多取标本，疱液要刺破疱壁，用无菌棉签蕉取疱液，感染的溃疡面，要用棉签擦去脏物，再刮取溃疡基底组织液，宫颈

9、标本应抹去宫颈口分泌物，再取宫项标本，或鬃宫颈溃疡物。 2.洗涤要充分。洗涤过程注意防止交叉污染造成假阳性。 3.每盒试剂第一次要做阴阳性对照，确定Cut off值，阳性对照OD0.50，阴性对照OD0.30，每孔阴性值应在均值N0.05范围，否则弃去。 临床意义 ELISA法由于方法简单、灵敏度和特异性高等优点，是目前HSV检测的常用方法。HSV抗原阳性表示HSV现症感染，对症状不典型患者更具诊断意义。免疫荧火法（分型） 原理 先将异硫氰酸萤光素（FTTC）与特异性抗HSV抗体结合，在一定条件下，再与标本中相应HSV抗原产生反应，形成抗原-荧光抗体复合物，通过荧光显微镜观察复合物发出的荧光，

10、即表示标本中存在相应的抗原。 材料 1.0.01mol/L的pH值7.2的PBS缓冲液。 2.荧光素标记的抗体。 方法 1.直接法 （1）标本取材后用丙酮或甲酵固定处理，标示标本区域。 (2)滴加标记荧光抗体于标本上，平置湿盒内，37温箱孵育30分钟取出。 （3）先用PBS缓冲液轻轻冲洗，然后连续通过三缸同样PBS浸泡，每次5分钟，并不时振摇，最后蒸馏水浸泡1-2分钟脱盐冷风待干，滴加缓冲甘油（分析纯甘油9份加0.01mol/LpH7.2PBS缓冲液1份）封片。 （4）荧光显微镜检。 3.间接法 （1）待检标本涂片经固定后，滴加HSV抗体（一抗）放湿盒内，置37温箱孵育30分钟，用PBS缀冲液

11、漂洗或浸泡三次，每次5分钟，并不时振摇，最后用蒸溜水洗一次，室温待干。 （2）滴加荧光素标记的抗球蛋白抗体（二抗），放湿盒内置37温箱孵育30分钟，洗洗、封同片上。 （3）荧光显徽镜检。 结果 在荧光显徽镜下观察，果阳性时，上皮细胞或多核细胞内可见到苹果绿色荧光。 结果记录方法 3+4+：强阳性，荧光闪亮且范围广泛。 2+： 阳性，荧光明亮. 1+： 弱阳性，荧光较弱，但清晰可见。 ： 可疑，极弱可疑炎炎光。 -： 阴性，无荧光。 注意事项 1.试验完毕,立即荧光镜检查，否则可暂放冰箱保存。 2.由于组织细胞中存在自然荧光，易出现非特异性 果，每次试验均应设置已知阳性和阴性标本对照。 3.择特

12、异性好，质量可靠的抗体，最好选用单抗。 临床意义 直接法方法简单，需时短，特异性高，但敏感性较差。间接法敏感性高，一般比直接法高510倍，但方法较繁琐，需时较长。免疫荧光试验阳性有助现症病人诊断，而且可以分型。HSV抗体检测（ELISA法） 原理 将HSV特异性糖蛋白G（1.2型）作为抗原包被在微孔板条的反应孔上，加入经处理血清在反应孔中孵育，如果标本阳性，特异性HSV（1.2型）IgM或IgG与抗原结合，再加入酶标记抗入IgM或IgG抗体孵育形成复合物，然后加入酶底物显色，颜色的深浅与HSV抗体浓度成正比。 材料 1.薇孔板条：包被有抗原（HSV1.2）。直接使用。 2.标准血清：人IgM、

13、人IgG。直接使用。 3.阳性对照血清：人IgM、人IgG。直接使用。 4.阴性对照血清：人IgM、人IgG。直接使用。 5.酶结合物：过氧化物酶标记的抗人IgM、IgG。直接使用。 6.标本吸收缓冲液：检测IgM用，包含IgG/RF吸附剂羊抗人IgG抗体。直接使用。 标本稀释缓冲液：检测IgG用，直接使用。 7.清洗缓冲液：10倍浓缩。 8.底物液：直接使用。 9.终止液：直接使用。 方法 1.IgG血清稀释：10ul血清+1.0ml标本稀释缓冲液混匀（测I、II型IgG共用）。 IgG血清稀释：10ul血清+1.0ml标本稀释缓冲液混匀，室温吸收至少10分钟（测I、II型IgG共用）。 2

14、.操作方法。 IgG（HSVI、II）检测按下表（单位：nl）血清样本阳性对照阴性对照标准：C1C2100100100100100室温孵育30分钟，PBS洗涤4次，30秒/次酶标抗体100100100100100室温孵育30分钟，PBS洗涤4次，30秒/次底物100100100100100室温避光15分钟（19-23）终止液100100100100100酶标仪比色测定OD值，波长450nm 注：C1为高浓度（200RU/ml）；C2为中浓度（20RU/ml） IgG（HSVI、II）检测按下表（单位：nl）血清样本阳性对照阴性对照标准：C100100100100室温孵育30分钟，PBS洗涤4次

15、，30秒/次酶标抗体100100100100室温孵育30分钟，PBS洗涤4次，30秒/次底物100100100100室温避光15分钟（19-23）终止液100100100100 酶标仪比色测OD值（30分钟内），波长450nm 3.计算：本法检测IgG为定量试验，根据C1和C2的OD值分别绘制标准典线，然后依样本OD值查标准线得到样本浓度。检测IgM为半定量试验，根据样本OD值与标准OD值比确定样本的阴性、阳性及阳性程度。 结果 IgG阳性：样本OD值/C2的OD1，查表报XXRU/ml（相对单位）。 IgG阴性：样本OD值/C2的OD1，报阴性。 IgG阳性：样本OD值/C的OD1，报阴性。1比值2，报1+；比值2.05.0报2+；比值5.0报3+。 IgG阴性：样本OD值/C的OD1，报阴性。 注意事项 1.底物孵育时间与温度成反比，根据温度不同可作调整。室温 1418，孵育18分钟；室温 1923，孵育15分钟；室温2430，孵育12分钟。 2.IgM时要用吸收剂将样本的IgG吸收完全。 3.不能用吸附剂处理后的血清检测IgG型抗体。 4.检测IgM同时，使用吸收后样本进行IgG检测，可确认IgG/RF吸RF吸收效果，只有IgG检测阴性