海洋微生物多样性及其研究方法

1、海洋细菌多样性及其研究进展浩瀚的海洋是地球上生命的摇篮，它覆盖地球表面积的70.8%。从海面到海底深层蕴藏着数量惊人的生物、能源、矿产以及空间资源。目前的研究表明，海洋微生物不仅在海洋生态环境和物质循环中具有极其重要的作用，也是各种新型生物活性物质的潜在来源。由于世界面临严重的资源、环境、人口问题，海洋生物资源包括海洋微生物资源的开发与多样性研究已成为各沿海国家关注的热点。1914年，Issatchenko出版第一本海洋微生物研究专著北冰洋细菌的研究，确定了海洋微生物学的研究方向，并使海洋微生物学发展成为独立的学科。 Certes, A. 1884. On the culture, free

2、from known sources of contamination, from waters and from sediments brought back by the expeditions of the Travailleur and the Talisman: 1882-1883. C.R.Hebd.Sances Acad. Sci., 98:690-693v ZoBell,C.E. 1946. Marine Microbiology. Chronica Botanica, Waltham, MA.v Johnson,T.W. et al. 1961. Fungi in Ocean

3、s and Estuaries(海湾）. Weinheim published by J.Cramerv Wood,E.J.F. 1965. Marine Microbial Ecology. Chapman &Hall pressv Wood,E.J.F. 1967. Microbiology of Oceans and Estuaries. Elsevier Publishing, Londonv Colwell,R.R., et al. 1974. Effect of the Ocean Environment on Microbial Activities. University Pa

4、rk Press, Baltimore.v Colwell,R.R., et al. 1975. Marine and Estuarine Microbiology Laboratory Manual. University Park Press, Baltimorev Wood,E.J.F. 1975. The living ocean: Marine microbiology. Croom Helmv Litchfield,C.D. 1976. Marine Microbiology. Dowden,utchingon & Ross Inc.v Sieburth,J.McN. 1979.

5、Sea Microbes. Oxford University Pressv Vincent,W.F. 1988. Microbial Ecosystems of Antarctica. Cambridge University press, New Yorkv Austin,B. 1988. Marine Microbiology. Cambridge University Pressv Bartlett,D.H. 2000. Molecular Marine Microbiology. Horizon Scientific pressv Kirchman, D.L. 2000. Micro

6、bial Ecology of the Oceans. Wiley_Liss pressv Paul,J.H. 2001. Marine Microbiology (Methods in Microbiolgy, volume 30) Academic Pressv Smith J. 2002. Microbiology of Marine & Freshwater Environments. Chapman & Hallv Munn,C.B. 2004. Marine Microbiology: Ecology and Application. BIOS Scientific Publish

7、ersv Hobbie,J.E. 1984. Heterotrophic Activity in the Sea (NATO conference series) Plenum Pub Corpv Vreeland,R.H. 1991. Microbiology of Deep-Sea Hydrothermal Vents（热水口） (Microbiology of Extreme and Unusual Environments). CRC Pressv Karl,D.M. 1995 The Microbiology of Deep-Sea Hydrothermal Vents (Crc S

8、eries on Microbiology of Extreme and Unusual Environments). Crc Pr I Llc 。v 薛廷耀编. 海洋细菌学. 科学出版社. 1962 北京v 克里斯 A E.著. 孙国玉，李世珍译. 海洋微生物学（深海）. 科学出版社. 1964 北京 v 林永成， 周世宁主编. 海洋微生物及其代谢产物. 化学工业出版社. 2003 北京海洋细菌的多样性摘自Martinko J M., et al. 1997, Brock Biology of Microorganisms（中译本）生物系统发育摘自Martinko J M., et al.

9、1997, Brock Biology of Microorganisms（中译本）细菌系统发育微生物种类多样性What is marine bacteria?关于物种的概念物种是一个可以相互交配繁殖的自然群体，并与其他群体在生殖上是隔离的（Mayr, 1969）；物种是一个具有自身进化趋向和历史结局的祖裔群体的单一谱系，并维持其特性与其他类似谱系不同（Wiley, 1978）；微生物的种是一群具有高度表型相似的菌株的集合体，该菌株集合与其他类群的菌株存在明显差异（Stanier, 1986）； species, units of evolution and ecology, should b

10、e considered as ecologically unique (e.g. different biotypes, virulence（至病） properties, habitats, host ranges) -from: Ward D.M., A natural species concept for prokaryotes. Curr Opin Microbiol 1998, 1:271-277Major horizontal zonation in an ocean profile. (Soruce: Odum1971.) Intertidal:潮间带neritic浅海区 e

11、uphotic zone 透光层 Aphotic zone无光层 Continental shelf大陆架 Continental slope大陆斜坡 Continental rise大陆隆 hadal zone深海带(6000米以下)abyssal plain深海平原trench沟 Principal environmental characteristics of an estuary.HWOST= high water line of spring tide; LWOST= low water line of spring tide.Thermal Vent Communitiesv M

12、arine bacteria should exhibit growth at salinities between 20-40 parts per thousand. v True marine bacteria will not grow in the absence of sodium chloride.v Marine bacteria must be capable of growth at the low nutrient concentrations found in the oceans.v Marine bacteria must be capable of growth a

13、t low temperatures.海洋细菌种类多样性及其分布古菌（ARCHAEA）嗜泉古菌界（Crenarchaeota）广域古菌界（Euryarchaeota）初生古菌界（Korarchaeota） 真细菌（EUBACTERIA）变形细菌（Proteobacteria）-、-subclass蓝细菌（Cyanobacteria）革兰氏阳性细菌（Gram-positive bacteria）噬纤维菌属-黄杆菌属（Cytophaga-Flavobacterium）浮霉状菌（Planctomycetales）疣微菌（Verrucomicrobiales）螺旋体（Spirochaeta）绿色非硫细

14、菌（Green non-sulfur bacteria）海洋环境中发现的部分Proteobacteria类群的细菌类群属- ProteobacteriaAgrobacterium，Brucella，Erythrobacter，Hyphomonas，Nitrobacter，Pseudomonas，Rodopseudomonas，Roseibium， Roseobacter，sphingomonas - Proteobacteria（含-亚簇）Achromobacter，Acinetobacter，Aeromonas，Alcaligenes，Alteromonas，Beggiatoa，Candid

15、atus Endobugula sertula （ 共 生 细 菌 ）Chromobacterium，Colwellia，Hahella，Halomonas，Idiomarina，Leucothrix，Marinobacter，Marinomonas，Moritella，Nitrosomonas，Oceanospirillum，Photobacterium Pseudoalteromonas，Pseudomonas，Psychrobacter，Serratia， Shewanella，sulfur-oxidizing endosymbioticbacteria，Thalassomonas，Th

16、iobacillus，Thiocapsa，Thioflavicoccus ，Thiomicrospira，Vibrio- Proteobacteria“ Candidatus Entothenella palauensis ” ，Desulfobacter，Desulfobacterium，Desulfobotulus，Desulfofustis，Desulfomena，Desulfomonile ， Desulfosarcina，Desulfotalea，Desulfotignum，Desulfovibrio- ProteobacteriaArcobacter，ectosymbiont of

17、 Alvinella pompejana，Sulfurospirillum ，Thiovulum海洋环境中发现的部分革兰氏阳性细菌类群属高 G+C 革兰氏阳性细菌Streptomyces，Arthrobacter，Nocadia，Mycobacterium，Corynebacterium，Actinoplanes，Gordonia，Micromonospora，Thermoactinomyces，Rhodococcus，Brevibacterium，Actinomycete低 G+C 革兰氏阳性细菌Bacillus，Paenibacillus，Staphylococcus，Streptococ

18、cus，Peptococcus，Micrococcus，Clostridium，Sarcina，Planococcus，Halobacillus海洋细菌基因资源多样性目前已克隆的来自海洋细菌的基因基 因产 物 及 其 功 能微 生 物参 考 文 献C h i A几 丁 质 酶V i b r i o s p . s t r a i n F i :7B e n d t e t a l . 2 0 0 1O m p 2细 胞 外 膜 孔 道 蛋白B r u c e l l a m a r i sC l o e c k a e r t e t a l .2 0 0 1L u x冷 光 形 成V i b

19、 r i o fi s c h e r iV . p a r a h a e m o l y t i c u sM c C a r t e r 1 9 9 8 ；S t e v e n s e t a l . 1 9 9 7G r o E S , g r o E LG r o E S , G r o E L( 分 子 伴 娘 )V i b r i o h a r v e y iK u c h a n n y e t a l . 1 9 9 8T n 5影 响 支 架h o l d f a s t 形 成海 洋c a u l o b a c te r s p .（ M C 5 6 ）Y u n

20、e t a l . 1 9 9 4S w m AS w m A多 肽 ，海 洋S y n e c h o c o c c u sB r a h a m s h a 1 9 9 6F l a C D E F G H I J鞭 毛 蛋 白海 洋 古 菌M e t h a n o c o c c u s v o l t a eT h o m a s e t a l . 2 0 0 1R u b i s C Or i b u l o s e - 1 ,5 -b i s p h o s p h a t ec a r b o x y l a s e /o x y ge n a s e海 洋 细 菌S 1

21、8 5 - 9 A 1C a s p i e t a l . 1 9 9 6R p o E细 胞 一 蛋 白 质海 洋V i b r i o a n g u s t u mH i l d e t a l . 2 0 0 0R p o A，r p o DR N A聚 合 酶 -亚 基 ,细 胞 因 子深 海 嗜 压S h e w a n e l l av i o l a c e a D S S 1 2N a k a s o n e e t a l .2 0 0 1 a ， 2 0 0 0C y o - o p e r o n对 苯 二 酚 氧 化 酶S h e w a n e l l a v i

22、 o l a c e aN a k a s o n e e t a l .2 0 0 1 bP p o A多 酚 氧 化 酶M a r i n o m o n a sm e d i t e r r a n e aS a n c h e z - A m a t e t a l .2 0 0 1果 胶 酶 基 因果 胶 酶P s e u d o a l t e r o m o n a sh a l o p l a n k ti sT r u o n g e t a l . 2 0 0 1M b l a - 内 酰 胺 酶M o r i t e l l a m a r i n aT a n a k

23、a e t a l . 2 0 0 1A T P s u l f u r y l a s eg e n eA T P 硫 酸 化 酶 基因深 海 热 液 出 口 共 生 细 菌文 库L a u e e t a l . 1 9 9 4A P碱 性 磷 酸 酯 酶海 洋 弧 菌A s g e i r s s o n e t a l .2 0 0 1海洋细菌的特性及其对多样性研究的影响海洋细菌的培养特性1 附着性和集结性2 生长缓慢3 特殊的培养要求4 存在活的不可培养状态（viable-but-nonculturable）海洋细菌的形态和生理生化特性1 海洋微生物细胞形态的多变性2 生理生化反应的

24、多变性3 不易传代和保存4 难以分类鉴定 各种生态环境中可培养的微生物占该生境微生物总数的比例 要判断海洋环境中分离的微生物是海洋生物十分困难。尽管大部分在大海发现的细菌与非海洋细菌有区别，但长期以来，却没有一个确定的标准用于区别海洋的与非海洋的细菌，也没有对海洋细菌做出明确定义。海洋细菌多样性研究方法及其进展Beijerinck, M.W.(1889):v How may one recover samples of water or sediment from the desired location and know that the samples are uncontaminated

25、 by the overlying water?v How does one culture these mysterious creatures?v What are their requirements for growth ?v Will they even grow in the laboratory at all?v What kinds of microorganisms are there?v Do they fit into the classical taxonomic schemes?取样的方法1 海水样品的采集 微生物采水器、错流过滤设备2 海洋沉积物的采集 底栖生物采泥

26、器、shinkai6500、Kaikov 依赖微生物分离培养的研究方法v 不依赖微生物分离培养的研究方法海洋细菌多样性研究方法依赖微生物培养的研究方法1 海洋细菌的分离培养2 海洋细菌的分类鉴定特定海洋细菌类群的分离方法古菌（H. volcanii）细菌（E. coli）真核生物（Dictyosteliumdisoidenum）古菌7059-6354-56细菌7553古菌、细菌和真核生物核糖体小亚基RNA基因序列的同源性（%）16S rRNA基因（16S rDNA）的特点1 存在于所有的生物细胞中，具有相似的结构和功能2 具有分子计时器的特点，分子序列变化缓慢3 基因中存在进化速率不同的结构区

27、域，交替分布，互不影响，可用于亲缘关系远近不同的生物之间的系统学研究 16S rRNA基因（16S rDNA）的结构模式图 V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 Variable region Conserved region通过比较不同微生物16S rDNA序列之间的差别，可能发现某种生物类群相关的特征性核苷酸序列或突变，这些特征性核苷酸序列，为各种微生物资源的鉴定、分类建立起一个简单而统一的标准。大肠杆菌 r DNA小亚基二级结构模式图不依赖微生物分离培养的研究方法显微镜直接检查法脂肪酸分析基因序列分析探针杂交分析脂肪酸分析 脂肪酸指纹图谱是细菌分类和鉴定中十分有用的技术，

28、尤其是磷脂酸（phospholipid ester-linker fatty acid， PLFA），不同类群的细菌具有特征性的磷脂酸组成，它们易于从土壤、沉积物等环境样品的微生物细胞中抽提出来，因此可用于评估自然环境包括海洋环境中活的微生物生物量或微生物种群结构. Gruntzig v., et al., 1985 FEMS Microbiol Ecol. 31:147-158基因序列分析扩增性rDNA限制性酶切片段多态性分析（ARDRA ）末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）变性（或温度）梯度凝胶电泳（DGGE or TGGE）rDNA间隔区分析（RISA）荧光原位杂交技术（FISH）

29、rRNA点/狭线印迹杂交（rRNA dot/slot blot )海洋细菌多样性研究中常用的基因分析技术基于核糖体RNA基因序列分析的流程基因序列分析 由于核糖体RNA基因（rDNA）具有高度的保守性，在所有的细胞生物中都存在，且序列不受环境影响，从而成为迄今为止在细菌多样性研究中应用最多的核基因。 基本研究步骤：（1）环境样品中总DNA的提取和纯化；（2）rDNA的PCR扩增；（3）扩增产物的克隆；（4）克隆产物的序列测定；（5）序列的比较分析和系统学研究。 Stahl D.A., et al. 1985 Appl Environ Microbiol. 49:1379-1384海洋沉积物中D

30、NA提取方法之比较DNA 提提取取方方法法操操 作作 要要 点点特特 点点间间接接提提取取法法通过缓冲液反复洗涤、差速离心，将微生物菌体与沉积物颗粒分开，再从菌体中提取 DNA得到的 DNA 质量较好；但总DNA 回收率低（33-35%） ，且回收率受样品性质的影响极大直直接接提提取取法法在沉积物中直接裂解微生物后提取DNA操作简单，DNA 回收率较高；但得到的 DNA 中含有大量杂质混混合合提提取取法法通过缓冲液反复洗涤，将微生物菌体与沉积物颗粒分开，提取菌体 DNA，同时采用直接法提取沉积物残存的 DNA回收率较高，杂质含量得到部分减少扩增性rDNA限制性酶切片段多态性分析(Amplifi

31、ed Ribosomal DNA Restriction Analysis，ARDRA) 将16S rDNA-PCR技术与RFLP技术相结合而发展起来的微生物多样性研究技术；即采用识别4个碱基的限制性内切酶对克隆获得的16S rDNA进行酶切，通过电泳分析酶切后的片段长度多态性。 Rooney-Vara J.N., et al. 1998 Syst Appl Microbiol. 21:557-568末端限制性片段长度多态性(Termanal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP) 利用一定的标记引物对样品中DNA进行特异扩增，然后进行

32、限制性内切酶酶切，检测末端限制性片段的多态性。 Moesender M.M., et al. 1999 Appl Environ Microbiol. 65:3518-3525变性梯度凝胶电泳技术(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) 使用一对特异性引物PCR扩增环境样品中的16S rRNA基因，产生长度相同但序列不同的DNA片段混合物，该混合物在含梯度浓度变性剂（变性剂浓度由低到高）的聚丙烯酰胺凝胶中电泳，在一定温度下，同一变性剂浓度下，序列不同的产物，其解链的温度和程度不同，导致电泳的迁移率不同，从而将不同序列（只要有一个碱基的差别）

33、的DNA分开。 Benlloch S., et al. 2002 Environ Microbiol. 4(6):349-360rDNA间隔区分析(rDNA internal spacer analysis，RISA) 利用16S rDNA 3保守区和23S rDNA 5保守区设计引物，PCR扩增环境样品中的16S-23 rDNA间隔区，通过分析该扩增片段的核苷酸序列或比较其差异，进行微生物多样性研究。 Garca-Martnez J. et al. 1999 J Microbiol Method 36:55-6416S 23s rDNA间隔区示意图荧光原位杂交(Fluorescence in

34、 situ Hybridization, FISH) 将荧光标记的具有属种（或类群）特异性的寡核苷酸探针与经固定的环境样品中的DNA或RNA进行杂交，并通过扫描共聚焦显微镜（scanning confocal laser microscopy， SCLM）检测杂交信号。该技术广泛应用于环境中特定微生物的种群鉴定、种群数量分析及特异微生物跟踪检测。 Ravenschlag K., et al. 2000 Appl Environ Microbiol 66:3592-3602 用于海洋细菌多样性分析的探针1 基于不同的域、科、属、种乃至亚种核糖体RNA基因（rDNA）设计的特异性探针2 针对海洋特

35、有细菌类群设计的寡核苷酸探针3 针对某些特殊生理类群细菌核糖体RNA或功能基因设计的寡核苷酸探针探探 针针 序序 列（列（5-3） 适合的微生物类群适合的微生物类群 GAM660 TCCACTTCCCTCTAC Marine -Proteobacteria, endosymbionts DSS225 TGGTACGCGGGCTCA TCT Svalbard clone group SV AL1 cl81-644 CCCA TACTCAAGTCCCTT Svalbard clones Sva0081 and Sva0863 GCTGTACTCAAGTTACCCAGTTCTAA Bacterial

36、 endosymbiont SAR11-A1 SAR11-A2 SAR11-B2 SAR11-B3 SAR11-D4 SAR11-G1 AAGCTTTCTCCGTAAAGACTTA T； GCAGGCTCA TCCAA TGGT CGGGCTCA TCTTTCGGC CTCTTCGCDTCTCAYTGTAAGT AA TGTTAGTAACTAAACGTAGGG CCTGTGAAGGCTTA TTCAGTA TT Marine SAR11 lineage NOR1-56 TTACCGCTCGGACTTGCA Marine NOR1 lineage NOR2-1453 GGTCA TCGCCA T

37、CCCC Marine NOR2 cluster groupA SAR86-1249 GGCTTAGCGTCCGTCTG Marine SAR86 cluster Bn1253 CA TCGCTGCTTCGCAACCC Symbiont specific Bn240f TGCTA TTTGA TGAGCCCGCGTT Symbiont specific GP1 GP2 GP3 GP4 GP5 CA TCA TCTAGCAAGCTAGACA TG CAGCGA TTAGCAAGCTAA TCCTG CAGCGAAGTGCAAGCACTTCCTG CA TCTTCTAGCAAGCTAGAAA TG

38、 CAGCGA TAGCAAGCTA TCCTG Marine-clone cluster MALF-1/1b Marine -Proteobacteria CYA664 GGAA TTCCCTCTGCCCC Marine Cyanobacteria 海洋特有细菌类群的16S rDNA 探针 探针 2 探针 4计算机分析杂交图象并由探针的杂交情况推导样品的多样性 探针 5探针 3 探针 1DNA 样品与基因芯片上16S rDNA 特征性寡核苷酸探针结合基因芯片技术在海洋细菌多样性分析中的应用Eilers et al.（2000）：对德国北海浮游细菌的研究表明，培养获得的两个优势细菌类群（Ros

39、eobacter和Cytophaga-Flavobacterium）中，前者在16S rDNA克隆文库中找到了相关序列，而后者没有；Webster et al.（2001）：从海绵共生体中获得的16S rDNA克隆文库中，没有序列与分离培养获得的共生细菌16S rDNA序列相似；Acinas et al.（1999）：海水浮游细菌16S rDNA克隆文库中优势类群SAR86 cluster，目前没有在任何可培养的细菌中发现； study（2002）：南沙沉积物16S rDNA克隆文库中，没有序列与分离培养获得的细菌16S rDNA序列相似新 技 术 = 新 发 现直接镜检研究法海洋细菌形态多样

40、性附生玻片法海洋细菌形态多样性取样设备深海嗜压（耐压）细菌稀释培养法寡营养细菌基于 16S rDNA 序列分析的技术海洋细菌系统类群多样性新的细菌系统类群SAR11v Giovannoni SJ., et al. 1990 Genetic diversity in Sargasso Sea bacterioplankton. Nature 345(6270):60-63v Britschgi TB., Giovannoni SJ. 1991 Phylogenetic analysis of a natural marine bacterioplankton population by rRNA

41、 gene cloning and sequencing. Appl Environ Microbiol 57(6):1707-1713v Field KG., et al. 1997 Diversity and depth-spcecific distribution of SAR11 cluster rRNA genes from marine planktonic bacteria. Appl Environ Microbiol 63(1):63-70v Connon SA., Giovannoni SJ. 2002 High-throughput methods for culturi

42、ng microorganisms in very-low-nutrient media yield diverse new marine isolates. Appl Environ Microbiol 68(8):3878-3885v Rappe MS., et al. 2002 Cultivation of the ubiquitous SAR11 marine bacterioplankton clade. Nature 418(6898):630-633v Morris RM., et al. 2002 SAR11 clade dominates ocean surface bact

43、erioplankton communities. Nature 420(6917):806-810关于海洋细菌多样性研究若干问题的讨论Marine Microorganisms as a Biomedical Source: Are They Unculturable or Uncultured?Uphoff et al.(2001) ：设计了12种不同的培养基，与12种不同的培养条件搭配对，对海洋浮游细菌进行研究，得到了属-Proteobacteria、-Proteobacteria、high-GC Gram-positives以及Cytophaga/Flavobacterium /Bacteroides等类群的细菌；Eilers et al.（2000）：改进培养方法，获得一些海洋细菌，这些细菌的16S rDNA序列表明它们与西太平洋一类尚未培养的细菌类群NOR1一致；Eilers et al. （2001）：分离获得了全球分布的原来未获培养的属-Proteobacteria的NOR5细菌类群；Webster et al.（2001）：应用新的分离培养方法，从海绵中得到了与FISH的结果具有较大的一致性的共生细菌的类群；Joulian et al.（2001）：培养获得的硫酸盐还原细菌与克隆文库中部分序列所代表的属种是一致的