生物制品质量监控

1、123生物药物生物药物（来源和生产方法）（来源和生产方法）生化药物生化药物生物合成药物生物合成药物生物制品生物制品4l利用生物体、生物组织或组成生物体的利用生物体、生物组织或组成生物体的各种成分，综合运用生物学、生物化学、各种成分，综合运用生物学、生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药学的微生物学、免疫学、物理化学和药学的原理与方法制得的一大类药物。原理与方法制得的一大类药物。5l定义：定义：l 指从动物、植物及微生物提取指从动物、植物及微生物提取的，也可用生物的，也可用生物-化学半合成或用现化学半合成或用现代生物技术制得的生命基本物质及代生物技术制得的生命基本物质及其衍生物、降解物以及大分

2、子的结其衍生物、降解物以及大分子的结构修饰物等，如氨基酸、多肽、蛋构修饰物等，如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、多糖、脂质、核甘酸类。白质、酶、多糖、脂质、核甘酸类。6l定义定义:l由微生物代谢所产生的药物和必须利用由微生物代谢所产生的药物和必须利用微生物及其酶转化反应共同完成的半合微生物及其酶转化反应共同完成的半合成药物成药物,如如: 山梨醇、木糖醇、甘露醇、山梨醇、木糖醇、甘露醇、维生素、甾体激素、酶与辅酶类药物等。维生素、甾体激素、酶与辅酶类药物等。7 生物制品生物制品( (Biological Products)是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、

3、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备，用于疾病预防、治疗和诊断的药品。8 按生物制品的组成和性质可分为按生物制品的组成和性质可分为: :疫苗（疫苗（VaccinesVaccines）抗毒素及免疫血清抗毒素及免疫血清(Antitoxin and Antisera)(Antitoxin and Antisera)血液制品（血液制品（Blood ProductsBlood Products）细胞因子和重组细胞因子和重组DNADNA产品（产品（Cytokines and Cytokines and Recombinant DNA ProductsRecombinant DNA Product

4、s）诊断制品诊断制品(Diagnostic Reagents)(Diagnostic Reagents)其他制品其他制品9 由细菌、螺旋体或其衍生物制备而成，包括：由细菌、螺旋体或其衍生物制备而成，包括：l减毒活疫苗：卡介苗、人用炭疽和人用鼠疫减毒活疫苗：卡介苗、人用炭疽和人用鼠疫疫苗等疫苗等l灭活疫苗：霍乱菌体疫苗、钩端螺旋体疫苗灭活疫苗：霍乱菌体疫苗、钩端螺旋体疫苗等等l亚单位疫苗：脑膜炎球菌多糖疫苗、伤寒亚单位疫苗：脑膜炎球菌多糖疫苗、伤寒ViVi多糖疫苗等多糖疫苗等l重组重组DNADNA疫苗：重组疟疾疫苗、重组幽门螺疫苗：重组疟疾疫苗、重组幽门螺杆菌疫苗等杆菌疫苗等10 由病毒、衣原体

5、、立克次体或其衍生物制备由病毒、衣原体、立克次体或其衍生物制备而成，包括：而成，包括：减毒活疫苗：乙型脑炎减毒疫苗、麻疹疫苗、减毒活疫苗：乙型脑炎减毒疫苗、麻疹疫苗、风疹疫苗、风疹疫苗、OPVOPV等等灭活疫苗：乙型脑炎灭活疫苗、出血热疫苗、灭活疫苗：乙型脑炎灭活疫苗、出血热疫苗、狂犬疫苗等狂犬疫苗等亚单位疫苗：重组乙肝疫苗等亚单位疫苗：重组乙肝疫苗等重组重组DNADNA疫苗：重组乙肝疫苗等疫苗：重组乙肝疫苗等11 由两种或两种以上疫苗抗原原液配制而成由两种或两种以上疫苗抗原原液配制而成的具有多种免疫原性的疫苗。的具有多种免疫原性的疫苗。 例如：例如： 吸附百白破联合疫苗吸附百白破联合疫苗 麻

6、风腮三联疫苗麻风腮三联疫苗12由特定抗原免疫的动物血清而制备由特定抗原免疫的动物血清而制备 主要产品：主要产品： 白喉抗毒素白喉抗毒素 破伤风抗毒素破伤风抗毒素 抗狂犬病血清等抗狂犬病血清等13 由健康人的血浆或特异免疫人血浆分由健康人的血浆或特异免疫人血浆分 离、提纯或由重组技术制成的血浆蛋离、提纯或由重组技术制成的血浆蛋 白组分或血细胞组分制品白组分或血细胞组分制品 。 主要产品：主要产品：人血白蛋白人血白蛋白 人免疫球蛋白人免疫球蛋白 人凝血因子等人凝血因子等14由健康人血细胞增值、分离、提纯或由健康人血细胞增值、分离、提纯或 由重组技术制成的多肽类或蛋白类制由重组技术制成的多肽类或蛋白

7、类制 剂。剂。 主要产品：干扰素主要产品：干扰素(IFN)(IFN) 白细胞介素白细胞介素(IL)(IL) 集落刺激因子集落刺激因子(CSF) (CSF) 红细胞生成素红细胞生成素 (EPO)(EPO)等等15 由特定抗原、抗体或有关生由特定抗原、抗体或有关生物物质制成的用于体外诊断疾病的试剂或试物物质制成的用于体外诊断疾病的试剂或试剂盒，如伤寒、副伤寒等细菌的诊断菌液，剂盒，如伤寒、副伤寒等细菌的诊断菌液，沙门氏菌属诊断血清，沙门氏菌属诊断血清，HBsAgHBsAg诊断试剂盒等。诊断试剂盒等。 由抗原制成的用于体内诊断由抗原制成的用于体内诊断疾病的试剂，如卡介苗纯蛋白衍生物（疾病的试剂，如卡

8、介苗纯蛋白衍生物（BCG-BCG-PPDPPD）、锡克试剂毒素、标记的单克隆抗体等。）、锡克试剂毒素、标记的单克隆抗体等。16 由有关生物材料或特定方法制成的，由有关生物材料或特定方法制成的，上述上述5 5类产品以外的生物制品，如变态类产品以外的生物制品，如变态反应原、微生态制剂、重组反应原、微生态制剂、重组DNADNA产品、产品、基因治疗产品、单克隆抗体制剂、某基因治疗产品、单克隆抗体制剂、某些细胞治疗制剂等。些细胞治疗制剂等。17 疫苗疫苗、类毒素、类毒素、被动免疫制剂被动免疫制剂 免疫学诊断试剂、基因诊断试剂、免疫学诊断试剂、基因诊断试剂、 生化试剂生化试剂 血液制剂、细胞因子制剂、酶和

9、激素、血液制剂、细胞因子制剂、酶和激素、 特异性抗体特异性抗体、非特异性免疫治疗制剂、非特异性免疫治疗制剂、 基因及细胞治疗制品等基因及细胞治疗制品等18（二） 生物制品的分类192021u分子量不是定值。分子量不是定值。大部分生物制品的活性组分均为大分子的生命物质（如蛋白质、多肽、核酸、多糖类等）。组分相同，但相对分子量不同而产生不同的生理活性，因此常需进行相对分子量的测定。u生化法结构确证。生化法结构确证。由于有效结构或分子量不确定，其结构的确证很难沿用化学药物或结构已知的生化药物所常用的方法，还需要生物化学分析如：氨基酸组成、N末端氨基酸序列、肽图等。2223u要求安全性检查要求安全性检

10、查。生物制品组分复杂，生物制品组分复杂，有效成分浓度很低，生物大分子杂质含有效成分浓度很低，生物大分子杂质含量比较高，生产工艺复杂，易引入特殊量比较高，生产工艺复杂，易引入特殊杂质和污染物。如重组乙型肝炎疫苗涉杂质和污染物。如重组乙型肝炎疫苗涉及的安全性检查包括：细胞外源因子检及的安全性检查包括：细胞外源因子检查、原液、半成品、成品中有关血清白查、原液、半成品、成品中有关血清白蛋白残留量、蛋白残留量、CHO细胞细胞DNA残留量检查、残留量检查、热原检查、过敏试验、异常毒性检查等。热原检查、过敏试验、异常毒性检查等。24u需做效价测定。需做效价测定。对于生物制品有效成分的检测，除应有一般化学方法

11、或理化分心进行有效成分含量测定外，更应根据产品的特异生理效应或专一化反应拟定其专属性的生物效价测定方法，以表征其所含生物活性成分的含量。例：人凝血酶原复合物的效价测定。25l生物制品化学性质与生物学性质都很不稳定，又易受微生物污染，故对生物制品的均一性、有效性、安全性和稳定性等应有严格要求，以生产出具有药理活性高、针对性强、毒性低、副作用小，疗效可靠及营养价值高等特点的安全、高效的生物制品。为此，必须进行原材料、生产过程和最终产品的全程质量控制，以确保产品符合质量标准要求。2627生物制品及检定规程草案（生物制品及检定规程草案（1952年）年）生物制品制造检定规程（生物制品制造检定规程（195

12、9年）年）中国生物制品规程（中国生物制品规程（2000年）年）中华人民共和国药典三部（中华人民共和国药典三部（2010年）年）收载生物制品101种28l品名l定义、组成及用途l基本要求l制造l检定（原液、半成品、成品）l保存运输及有效期l使用说明（仅预防类含此项）29生物制品生物制品u品名u定义、组成及用途u基本要求u制造u检定（原液、半成品、成品）u保存运输及有效期u使用说明（仅预防类含此项）化学药品化学药品品名化学结构、分子式性状鉴别检查含量测定3031u有效成分的同一性、结构确证u有效成分的均一性、纯度检查u有害物质及残余杂质等的控制u高效、灵敏的生物活性及比活性等实验方法生物制品质量控

13、制基本方法：u鉴别试验u杂质检查u安全性检查u含量测定（生物活性或效价）32l依据生物制品的化学结构、理化性质和生物学特点，利用化学法、物理法及生物学方法进行某些特殊反应，或测定某些专属的理化常数如紫外吸收系数、等电点、电泳迁移率、色谱保留时间和肽图等，判断与确证产品的真伪。（一组实验）l需用标准品或对照品在同一条件下进行对照实验。331、化学鉴别法、化学鉴别法 利用药物与某试剂在一定条件下反应，生成有颜色的产物或沉淀进行鉴别。如胰岛素的沉淀反应。2、紫外分光光度法（红外）、紫外分光光度法（红外） 蛋白质生物制品主要由芳香族氨基酸侧链如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸产生紫外吸收。如重组人促红素最大吸

14、收279nm。3、高效液相色谱法高效液相色谱法 （主峰保留时间和肽图的一致性）（主峰保留时间和肽图的一致性） 例如脑蛋白水解液不同批次肽图的一致性343536373839401、酶法、酶法利用酶对底物特异性的催化活力，做为酶类生物制品简便、快速鉴别方法。如尿激酶的鉴别2、电泳法、电泳法 等电点聚焦电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳等。可用于蛋白质类生物制品的鉴别。如重组人生长激素的鉴别：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳414243（一）血清学法（一）血清学法-体外抗原抗体试验体外抗原抗体试验抗原抗体类生物制品的鉴别抗原抗体类生物制品的鉴别 抗原抗体在体外结合时，可因抗原物理性抗原抗体在体外结合时，可因抗原

15、物理性状不同或参与反应的成分不同而出现各种类型状不同或参与反应的成分不同而出现各种类型的反应，如凝集反应、沉淀反应、中和反应和的反应，如凝集反应、沉淀反应、中和反应和补给结合反应，即经典血清学反应，在此基础补给结合反应，即经典血清学反应，在此基础上，又衍生出免疫扩散、免疫电泳、荧光标记、上，又衍生出免疫扩散、免疫电泳、荧光标记、酶标记等高度敏感的检测技术。酶标记等高度敏感的检测技术。 44l利用生物体对生物制品特定的生物活性的反应为基础进行供试品的鉴别来鉴别药物。454647 可用来判断药品的优劣。由于生物可用来判断药品的优劣。由于生物制品来自生物体，生物活性特特异性强，制品来自生物体，生物活

16、性特特异性强，制造与纯化工艺复杂，分子结构常常不制造与纯化工艺复杂，分子结构常常不确定，有时产品并非单一，极微量杂质确定，有时产品并非单一，极微量杂质可能产生显著的效应，因此，其杂质检可能产生显著的效应，因此，其杂质检查显得尤为重要。主要包括：查显得尤为重要。主要包括：l一般杂质检查一般杂质检查l特殊杂质检查特殊杂质检查l安全性检查安全性检查48l一般杂质检查一般杂质检查 氯化物、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、氯化物、硫酸盐、磷酸盐、铵盐、铁盐、重金属、酸度、溶液的澄清度、铁盐、重金属、酸度、溶液的澄清度、溶液的颜色、水份及干燥失重、炽烧残溶液的颜色、水份及干燥失重、炽烧残渣渣49从原料中带入或生产工

17、艺中或贮藏过程中引入的杂质根据生物制品的生产工艺特点与产品的稳定性，其特殊杂质分为：u生物污染物：生物污染物：微生物污染、宿主细胞蛋白、外源性DNA、培养基成分等u产品相关杂质：产品相关杂质：二聚体和多聚体、脱氨或氧化产物、突变物、裂解产物等u工艺添加剂：残余抗生素、蛋白分离剂聚乙二醇、乙醇、佐剂氢氧化铝，产品稳定剂如辛酸钠、肝素，防腐剂苯酚、硫柳汞，细菌与病毒灭活剂甲醛、戊二醛等。5051525354l生物制品生产用细胞、工程菌相关的特殊杂质。l方法：ELISA55l测定方法：l分子杂交技术l基于DNA结合蛋白分析系统l实时定量PCR方法56l生物制品在生产制造、分离纯化和贮藏保存过程中产生

18、的与产品结构类似的同系物、异构体、突变物、氧化物、聚合体或降解物。l常用HPLC法和电泳法。l如重组人生长激素中相关蛋白质的测定总相关蛋白质含量不超过10%。57l如果生物制品在生产过程中使用了抗生素，则不仅要在纯化工艺中除去，而且要在原液检定中增加残余抗生素活性的检测方法。l常用方法：抑菌圈测量。l结果判定：对照溶液有抑菌圈，阴性对照无抑菌圈，供试品溶液抑菌圈的直径小于对照溶液抑菌圈的58l（一）热原检查法和细菌内毒素检查（一）热原检查法和细菌内毒素检查 法法l（二）异常毒性检查（二）异常毒性检查l（三）过敏试验（三）过敏试验l 检查异性蛋白检查异性蛋白l（四）降压试验（四）降压试验l 检查

19、组胺、类组胺或其他导致血压下降检查组胺、类组胺或其他导致血压下降的物质的物质l（五）无菌试验（五）无菌试验检查药品及敷料是否有活菌的一种方法检查药品及敷料是否有活菌的一种方法59l（一）含量测定（一）含量测定l表示方法：表示方法：l百分含量：百分含量：适用于结构明确的小分子药适用于结构明确的小分子药物或经水解变成小分子的药物物或经水解变成小分子的药物l测定方法：测定方法：l1、HPLCl2、SDS-PAGEl（二）效价测定二）效价测定l表示方法：表示方法：l生物效价或酶活力：生物效价或酶活力：适用于酶类或蛋白适用于酶类或蛋白质类药物。质类药物。60616263（一）滴定分析法（一）滴定分析法

20、根据生物制品中某些成分能与标准溶根据生物制品中某些成分能与标准溶液定量地发生酸碱中和反应、氧化还原液定量地发生酸碱中和反应、氧化还原反应等特性，通过滴定进行含量测定。反应等特性，通过滴定进行含量测定。如胰酶中胰脂肪酶的测定。以橄榄油为如胰酶中胰脂肪酶的测定。以橄榄油为底物，经胰脂肪酶水解后产生脂肪酸，底物，经胰脂肪酶水解后产生脂肪酸，用氢氧化钠液滴定。用氢氧化钠液滴定。64651、比色法、比色法 例如：硫酸软骨素的测定例如：硫酸软骨素的测定2、紫外分光光度法、紫外分光光度法 糜蛋白酶与底物糜蛋白酶与底物N-乙酰乙酰-L-酪氨酸酪氨酸 237nm测定测定3、荧光分光光度法、荧光分光光度法 反应物

21、或反应产物激发产生应观荧光反应物或反应产物激发产生应观荧光 应用荧光试剂产生荧光应用荧光试剂产生荧光 应用另一酶的催化反应产生荧光应用另一酶的催化反应产生荧光66l特点：特点：适合于对高沸点、大分子、适合于对高沸点、大分子、强极性和热稳定性差强极性和热稳定性差l 色谱柱：色谱柱：C8、C18流动相：甲醇流动相：甲醇-水（或缓冲液）、乙腈水（或缓冲液）、乙腈-水水 （或缓冲液）（或缓冲液）检测器：检测器：UV、荧光、荧光、ECD色谱条件：67l多肽及蛋白质等生物药物的分离及其分多肽及蛋白质等生物药物的分离及其分子量测定子量测定l特点：特点：l活性蛋白质可以回收活性蛋白质可以回收l流动相通常为缓冲

22、液，为改善分离，可流动相通常为缓冲液，为改善分离，可加少量有机改性剂或表面活性剂加少量有机改性剂或表面活性剂l根据有效粒径分离根据有效粒径分离l68色谱条件：l色谱柱：色谱柱：SEC-3000柱柱l流动相：流动相：0.01mmol/LKH2PO4：0.1mmol/L Na2SO4（1：1），），内加内加0.05%叠氮化钠叠氮化钠l流速：流速：1mL/minl柱温：柱温：l检测波长检测波长:280nm色谱条件：697071l酶法酶法酶活力测定法酶活力测定法以酶为分析对象以酶为分析对象l 酶分析法酶分析法以酶为分析工具或分析试剂以酶为分析工具或分析试剂l酶活力测定法酶活力测定法l酶催化一定化学反应

23、的能力。测定一个被酶所催酶催化一定化学反应的能力。测定一个被酶所催化的化学反应速度。酶反应速度以单位时间底物化的化学反应速度。酶反应速度以单位时间底物的减少或产物的增加来表示。的减少或产物的增加来表示。 酶活力酶活力72l（1）底物浓度的影响：选择）底物浓度的影响：选择Km小的作底物小的作底物 l（2）pH的影响的影响l（3）温度的影响：温度控制在）温度的影响：温度控制在0.1度度l（4）辅助因子的影响）辅助因子的影响l（5）空白和对照试验）空白和对照试验 空白空白：杂质反应和自发反应引起的变化量：杂质反应和自发反应引起的变化量 对照实验对照实验：用纯酶或标准酶制剂测定。用：用纯酶或标准酶制剂

24、测定。用 于比较或测定的标准。于比较或测定的标准。73l（1）取样测定法）取样测定法l 停止酶反应的方法：添加变性剂停止酶反应的方法：添加变性剂l 加热使酶失效加热使酶失效l（2）连续测定法）连续测定法 74l1、UV-VIS根据产物和底物特征吸收根据产物和底物特征吸收 差别差别l2、荧光荧光l3、旋光法、旋光法l4、酶偶联测定法、酶偶联测定法 例如：例如：ELASAl5、其他：电化学法、离子选择电极测其他：电化学法、离子选择电极测定等定等 75l以酶为分析工具的方法。分析的对象可以是酶的底物、辅酶活化剂或酶抑制剂。l影响因素：酶和作用物的浓度、反应时间、温度和pH76l生物制品药物分析的重要

25、手段。生物制品药物分析的重要手段。l在电解质溶液中，带电粒子或离子在电场作在电解质溶液中，带电粒子或离子在电场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移。迁移。l1、自由界面电泳、自由界面电泳l2、区带电泳、区带电泳:纸电泳、纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、PAGE、SDS-PAGE。l3、HPCE：CZE、MECC、CGE、CIEF电泳原理电泳原理电泳分类电泳分类777879l1、纸电泳法：、纸电泳法： （1）操作方法；）操作方法； （2）定量方法：同纸色谱）定量方法：同纸色谱 （3）应用：蛋白质、核苷酸类）应用：蛋白质、核苷酸类80l

26、应用：血清蛋白、脂蛋白等的分离测定应用：血清蛋白、脂蛋白等的分离测定3、PAGE法法 聚丙烯酰胺凝胶，分离效果取决于分子聚丙烯酰胺凝胶，分离效果取决于分子所带电荷与分子大小的比例及分子筛效应。所带电荷与分子大小的比例及分子筛效应。 4、SDS-PAGE法法 测定酶和蛋白等大分子物质分子量，蛋白测定酶和蛋白等大分子物质分子量，蛋白分子相对迁移率的大小完全取决于分子量的分子相对迁移率的大小完全取决于分子量的高低，从已知分子量的标准蛋白的对数和相高低，从已知分子量的标准蛋白的对数和相对迁移率的标准曲线中求出对迁移率的标准曲线中求出。81l（1）操作方法）操作方法l（2）染色与洗脱）染色与洗脱l（3）

27、定量测定）定量测定l（4）应用）应用82l 利用药物对生物体（整体动物、离体利用药物对生物体（整体动物、离体组织、微生物等）的作用测定其效价或组织、微生物等）的作用测定其效价或生物活性的方法。以药物的药理作用为生物活性的方法。以药物的药理作用为基础，生物统计为工具，运用特定的实基础，生物统计为工具，运用特定的实验设计，通过供试品和相应的标准品在验设计，通过供试品和相应的标准品在一定条件下比较产生特定生物反应的剂一定条件下比较产生特定生物反应的剂量比例，来测试供试品的效价。量比例，来测试供试品的效价。定义定义83l1、药物的效价测定、药物的效价测定l2、大分子结构的测定、大分子结构的测定l3、微量生物活性物质的测定、微量生物活性物质的测定l特点：特点：l结果误差较大，重现性也较差，测结果误差较大，重现性也较差，测定费时，适用于无适当理化方法进定费时，适用于无适当理化方法进行检定的药物行检定的药物84851234586678788生物药物生物药物（来源和生产方法）（来源和生产方法）生化药物生化药物生物合成药物生物合成药物生物制品生物制品89 由病毒、衣原体、立克次体或其衍生物制备由病毒、衣原体、立克次体或其衍生物制备而成，包括：而成，包括：减毒活疫苗：乙型脑炎减毒疫苗、麻疹疫苗、减毒活疫苗：乙型脑炎减