中医药研究常用分子生物学技术课件

1、中医药研究常用分子生物学技术1 第二章 遗传物质及遗传信息的传递 n除了少数的RNA病毒之外，DNA几乎是所 有生物遗传信息的携带者。 DNA遗传信息的传递中心法则 n遗传信息从DNA到RNA转录 n遗传信息从mRNA到蛋白质翻译 中医药研究常用分子生物学技术2 nDNA模板与模板与mRNA 分子及多肽链之间分子及多肽链之间 存在共线性关系。存在共线性关系。 中医药研究常用分子生物学技术3 第一节第一节 DNADNA的变性、复性和的变性、复性和DNADNA杂交杂交 n一、变性一、变性(denaturation)(denaturation) n在化学或物理因素的影响下，维系核酸二级结构在化学或物

2、理因素的影响下，维系核酸二级结构 的氢键和碱基堆积力受到破坏，的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA双螺旋解旋双螺旋解旋 成为单链的过程称为变性。成为单链的过程称为变性。 n变性可发生在整个变性可发生在整个DNA分子中，也可发生在局部分子中，也可发生在局部 的双螺旋阶段上的双螺旋阶段上 。 nDNA变性不涉及核苷酸中磷酸二酯键的断裂。变性不涉及核苷酸中磷酸二酯键的断裂。 n引起引起DNADNA变性的因素有：变性的因素有：酸酸、碱（碱（PH=11.3PH=11.3）、热热、 某些变性剂（如尿素、胍）和某些有机溶剂（如某些变性剂（如尿素、胍）和某些有机溶剂（如 乙醇、丙酮）等。乙醇、丙酮）等。 中医药

3、研究常用分子生物学技术4 二、复性（二、复性（renaturationrenaturation） n变性的变性的DNA两条互补单链，在适当条件下重两条互补单链，在适当条件下重 新缔合成双链的过程称为新缔合成双链的过程称为DNA复性或退火。复性或退火。 n复性可分为两个阶段：首先是复性可分为两个阶段：首先是成核成核 （nucleation），然后是），然后是拉链式拉链式(zippering)(zippering)。 n复性开始时复性开始时, ,两条两条DNADNA单链随机碰撞形成局部单链随机碰撞形成局部 双链，双链， 如果是正确的互补区形成的碱基对，如果是正确的互补区形成的碱基对， 就就成核（成

4、核（101020bp20bp）。）。如果不是正确的互补如果不是正确的互补 区，就解开，继续碰撞。区，就解开，继续碰撞。 n成核后，两条单链的其余部分碱基就像成核后，两条单链的其余部分碱基就像“拉拉 链链”哪样完成整个复性过程。哪样完成整个复性过程。 中医药研究常用分子生物学技术5 DNA复性速度受多种因素影响：复性速度受多种因素影响： nDNA大小与信息的多少大小与信息的多少 ：DNA片段小的片段小的 比大的容易复性，反之亦然。信息含量比大的容易复性，反之亦然。信息含量 少的比多的容易复性。少的比多的容易复性。 n离子强度离子强度 ：通常增加盐浓度，可加速两通常增加盐浓度，可加速两 条互补链重

5、新结合的速度。所以，要保条互补链重新结合的速度。所以，要保 持单链持单链DNADNA，盐浓度低于，盐浓度低于0.01mol/L0.01mol/L。 n DNADNA浓度：浓度：DNADNA浓度越大两条互补链彼此浓度越大两条互补链彼此 相遇的可能性越大，复性的速度也就越相遇的可能性越大，复性的速度也就越 快。快。 中医药研究常用分子生物学技术6 三、杂交三、杂交 n上述复性上述复性DNA中，如果两条链来源不同，中，如果两条链来源不同， 这就叫做杂交分子。这就叫做杂交分子。 n杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基 序列完全互补，只要有一定同源序性（不序列完全互补

6、，只要有一定同源序性（不 同来源）的单链彼此间有一定程度的互补同来源）的单链彼此间有一定程度的互补 序列就可以形成杂交链。序列就可以形成杂交链。 n杂交分子可以在杂交分子可以在DNADNA和和DNADNA、DNADNA和和RNARNA、 RNARNA和和RNARNA以及以及人工合成的寡核苷酸单链与人工合成的寡核苷酸单链与 RNARNA或或DNADNA单链单链之间进行。之间进行。 中医药研究常用分子生物学技术7 第二节第二节 DNADNA的合成的合成 n一、半保留复制一、半保留复制 nDNADNA复制时，两条链间的氢键破裂并使双链复制时，两条链间的氢键破裂并使双链 解旋和分开，然后以每条链为模板

7、、按碱解旋和分开，然后以每条链为模板、按碱 基配对原则进行互补合成基配对原则进行互补合成DNADNA，新形成的每，新形成的每 个子代个子代DNA的一条链来自亲代的一条链来自亲代DNA，另一，另一 条链则是新合成的，这种复制方式称为半条链则是新合成的，这种复制方式称为半 保留复制保留复制(semi conservation replication)。 中医药研究常用分子生物学技术8 1、复制起点和复制子、复制起点和复制子 nDNA复制在生物细胞中要从复制在生物细胞中要从DNA分子上特分子上特 定位置开始，这个特定的位置就称为定位置开始，这个特定的位置就称为复制复制 起点起点(Origin of

8、replication)，用，用ori表示。表示。 nDNA复制从起点开始双向进行直到终点为复制从起点开始双向进行直到终点为 止，每一个这样的止，每一个这样的DNA单位称为单位称为复制子复制子或或 复制单元复制单元(replicon)。 n复制起点在复制起点在DNA内部内部 n原核生物只有一个复制子原核生物只有一个复制子 n真核生物有多个复制子，真核生物有多个复制子，每个复制子长约每个复制子长约 50-200kb。 中医药研究常用分子生物学技术9 2、DNA复制的特点复制的特点 nDNA复制的最主要特点复制的最主要特点（1 1）半保留复制半保留复制 n（2 2）半不连续复制半不连续复制(Sem

9、i-ondisctinuous replication)。 n在复制起点两条链解开形成复制泡在复制起点两条链解开形成复制泡 (replication bubbles)，DNA向两侧复制向两侧复制 形成两个复制叉形成两个复制叉(replication forks)。 n以复制叉移动的方向为基准以复制叉移动的方向为基准 ，一条链连续，一条链连续 复制，为先导链复制，为先导链(leading strand) ；另一；另一 条链不连续复制，形成条链不连续复制，形成冈崎冈崎片段片段(Okaxaki fragments) ，是后随链，是后随链(lagging strand) 。 中医药研究常用分子生物学技

10、术10 二、参与二、参与DNA复制的有关物质复制的有关物质 n模板模板DNA，三磷酸核苷酸，三磷酸核苷酸(dATP,dGTP， dCTP，dTTP)是是DNADNA合成的原料。合成的原料。 n还需要一些酶参与还需要一些酶参与DNA合成合成 n(一一)螺旋酶螺旋酶(Helicase) n又称为解旋酶，是一类特殊的蛋白质可以又称为解旋酶，是一类特殊的蛋白质可以 促使促使DNA在复制叉处打开双链。在复制叉处打开双链。 n螺旋酶可以和单链螺旋酶可以和单链DNA结合，并且与结合，并且与ATP 结合，利用结合，利用ATP分解成分解成ADP时产生的能量时产生的能量 沿沿DNA链向前运动促使链向前运动促使DN

11、A双链打开。双链打开。 中医药研究常用分子生物学技术11 中医药研究常用分子生物学技术12 (二二)单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(SSBP) n单链单链DNA结合蛋白结合蛋白(single strand DNA binding protein SSBP)能很快地和单链能很快地和单链 DNA结合，防止其重新配对形成双链结合，防止其重新配对形成双链DNA 或被核酸酶降解。或被核酸酶降解。 中医药研究常用分子生物学技术13 (三三)DNA拓扑异构酶拓扑异构酶(DNA Topisomerase) nDNA拓扑酶催化同一拓扑酶催化同一 DNA分子不同超螺旋分子不同超螺旋 状态之间的转变。状态之间的转变

12、。 nDNA拓扑异构酶有两拓扑异构酶有两 类类 ：拓扑异构酶拓扑异构酶 ， 如如大肠杆菌的大肠杆菌的蛋白蛋白 (MW-110000) ； n拓扑异构酶拓扑异构酶 ，如，如大大 肠杆菌中的肠杆菌中的DNA旋转旋转 酶酶(DNAgyrase) 中医药研究常用分子生物学技术14 螺旋与超螺旋螺旋与超螺旋 由于强行分开双螺旋末端而由于强行分开双螺旋末端而 引发产生的超螺旋结构引发产生的超螺旋结构 中医药研究常用分子生物学技术15 (四四)引发酶引发酶(Primase)和和RNA聚合酶聚合酶(RNA Polymerase) n引发酶催化引物引发酶催化引物RNA分子的合成分子的合成 。 nRNA聚合酶也是

13、催化聚合酶也是催化RNA分子的合成。分子的合成。 n人们认为后随链前体片段的引物是由引发人们认为后随链前体片段的引物是由引发 酶合成的，而先导链的引物是由酶合成的，而先导链的引物是由RNA聚合聚合 酶合成的。酶合成的。 n可能在大多数情况下，两种类型的引物都可能在大多数情况下，两种类型的引物都 是由引发酶合成的，而是由引发酶合成的，而RNA聚合酶的主要聚合酶的主要 作用就是通过转录过程而解开局部的作用就是通过转录过程而解开局部的DNA 双螺旋。这种作用就称为双螺旋。这种作用就称为转录激活转录激活 (transcriptional activation)。 中医药研究常用分子生物学技术16 （五

14、）（五）DNA聚合酶聚合酶(DNA Polymerase) n这类酶的共同性质是这类酶的共同性质是: n1以脱氧核苷酸三磷酸以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化为前体催化 合成合成DNA; n2需要模板和引物的存在需要模板和引物的存在; n3不能起始合成新的不能起始合成新的DNA链链; n4催化催化dNTP加到生长中的加到生长中的DNA链的链的3 - OH末端末端; n5催化催化DNA合成的方向是合成的方向是53。 中医药研究常用分子生物学技术17 1、大肠杆菌、大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 n大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶(DNApolymerase， DNApol) n这是这是195

15、6年由年由Arthur Kornberg首先发现的首先发现的 DNA聚合酶，又称聚合酶，又称Kornber酶。酶。 n由一条多肽链组成，约含由一条多肽链组成，约含1000个氨基酸残基，个氨基酸残基， MW为为109KD。 n经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成经过枯草杆菌蛋白酶处理后，酶分子分裂成 两个片段，大片段分子量为两个片段，大片段分子量为76KD，通常称，通常称 为为Klenow片段片段，小片段的分子量为，小片段的分子量为34KD。 中医药研究常用分子生物学技术18 DNApol I的功能的功能 n1聚合作用聚合作用:在引物在引物RNA-OH末端，以末端，以dNTP为为 底物，按模板

16、底物，按模板DNA上的指令由上的指令由DNApol逐个将逐个将 核苷酸加上去，就是核苷酸加上去，就是DNApol的聚合作用。的聚合作用。 n23 5 外切酶活性外切酶活性校对作用校对作用：从从 35 35 方向识别和切除不配对的方向识别和切除不配对的DNADNA生长链末生长链末 端的核苷酸。端的核苷酸。 n35 3 外切酶活性外切酶活性切除修复作用切除修复作用： 从从5 3 5 3 方向水解方向水解DNADNA生长链前方的生长链前方的DNADNA链，链， 主要产生主要产生5-5-脱氧核苷酸。脱氧核苷酸。 中医药研究常用分子生物学技术19 中医药研究常用分子生物学技术20 中医药研究常用分子生物

17、学技术21 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶(DNApol) n 1970年发现了年发现了DNApol。此酶。此酶MW为为 120KD，每个细胞内约有，每个细胞内约有100个酶分子，个酶分子， 但活性只有但活性只有DNApol的的5%。该酶的催。该酶的催 化特性如下：化特性如下： n(1)聚合作用聚合作用 n(2)该酶也具有该酶也具有3 5 外切酶活性，但无外切酶活性，但无 5 3 外切酶活性。外切酶活性。 n(3)该酶对作用底物的选择性较强该酶对作用底物的选择性较强 n(4)该酶不是复制的主要聚合酶该酶不是复制的主要聚合酶 中医药研究常用分子生物学技术22 大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合

18、酶(DNApol) nDNA pol 全酶由多种亚基组成全酶由多种亚基组成 n大肠杆菌每个细胞中只有大肠杆菌每个细胞中只有10-20个酶分子个酶分子 ， 尽管该酶在细胞内存在的数量较少，但催尽管该酶在细胞内存在的数量较少，但催 化脱氧核苷酸掺入化脱氧核苷酸掺入DNA链的速率分别是链的速率分别是 DNA聚合酶聚合酶I I、的的15倍和倍和30倍。倍。 nDNA聚合酶聚合酶是细胞内是细胞内DNA复制所必需的复制所必需的 酶酶 n有聚合作用：有聚合作用： 从从5 3 方向合成方向合成DNA nDNApol也有也有3 5 和和5 3 外切外切 酶活性酶活性 。 中医药研究常用分子生物学技术23 DNA

19、 pol 酶的组成酶的组成 亚基 分子量 (103) 其它名称 生物功能 140dnaE蛋白， polC蛋白 聚合功能和5 3 外切酶活性 253 5 外切酶活 性 10 83 保证 亚基 52dnaZ蛋白 作用的发挥 32dnaX蛋白 40 dnaN蛋白， copol 中医药研究常用分子生物学技术24 2 2、真核生物的、真核生物的DNA聚合酶聚合酶 n真核生物中也具有几种真核生物中也具有几种DNA聚合酶，但这些聚聚合酶，但这些聚 合酶都没有合酶都没有3 5 或或5 3 外切酶活性。外切酶活性。 n主要的酶主要的酶(占总量的占总量的80-90%)是是DNA聚合酶聚合酶， 分子量为分子量为30

20、0KD，含有，含有4个或个或5个亚基，主要负个亚基，主要负 责染色体责染色体DNA的复制。的复制。 nDNA聚合酶聚合酶，分子量为，分子量为45KD，仅含有一条链，仅含有一条链， 主要作用是修复核内主要作用是修复核内DNA。 nDNADNA聚合酶聚合酶，分子量为，分子量为140KD，存在于线粒体，存在于线粒体 内，负责催化线粒体内，负责催化线粒体DNA的复制。的复制。 n DNA聚合酶聚合酶 ，具有具有3 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 。 中医药研究常用分子生物学技术25 分子量分子量300KD45KD140KD ？ 个数细个数细 胞胞 2000 6000/cell 聚合作用聚合作用核内核

21、内DNA 复制复制 修复核内修复核内 DNA 线粒体线粒体 DNA复制复制 与与协同协同 作用作用 3 5 外切酶活外切酶活 性性 无无无无无无有有 真核生物真核生物DNADNA聚合酶种类及作用聚合酶种类及作用 中医药研究常用分子生物学技术26 （六）（六）DNA连接酶连接酶(DNA ligase ) nDNA连接酶是连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。年在三个实验室同时发现的。 n它是一种封闭它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助链上缺口酶，借助ATP或或NAD 水解提供的能量催化水解提供的能量催化DNA链的链的5 -PO4与另一与另一 DNA链的链的3 -OH生成磷酸二酯键。生成磷酸二酯

22、键。 nDNA连接酶连接酶在在DNA复制、修复和重组中起着重要复制、修复和重组中起着重要 的作用的作用 。 n真核生物细胞中的真核生物细胞中的DNA连接酶有两型连接酶有两型 ：DNA连连 接酶接酶分子量约为分子量约为200KD，主要存在于生长旺盛，主要存在于生长旺盛 细胞中，细胞中， nDNA连接酶连接酶分子量约分子量约85KD，主要存在于生长于，主要存在于生长于 不活跃的细胞中不活跃的细胞中(resting cell)。 中医药研究常用分子生物学技术27 三、三、DNA复制的过程复制的过程 nDNA复制过程大致可以分为复制的复制过程大致可以分为复制的引发引发， DNA链的链的延伸延伸和和DN

23、A复制的复制的终止终止三个阶段。三个阶段。 n（一）（一）DNADNA复制的引发复制的引发 n1 1、前引发过程、前引发过程 n（1 1）解开双链：两种方法：）解开双链：两种方法： n螺旋酶在螺旋酶在OriOri处解开双链处解开双链 n通过转录激活解开双链通过转录激活解开双链 中医药研究常用分子生物学技术28 转录激活：转录激活： nRNA聚合酶在聚合酶在Ori处转录一段处转录一段RNA，将双链分开，将双链分开， 便于引发体与便于引发体与DNA结合，在先导链模板链上合成结合，在先导链模板链上合成 引物引物RNA，这一过程称为转录激活。，这一过程称为转录激活。 （2）引发前体（）引发前体（pre

24、primosome)形成形成 n单链结合蛋白结合在被解开的双链上。由单链结合蛋白结合在被解开的双链上。由复制因复制因 子子X（n蛋白）、蛋白）、Y（n 蛋白）、蛋白）、n 蛋白蛋白、i i蛋蛋 白白、dnaBdnaB蛋白蛋白和和dnaCdnaC蛋白六种蛋白质形成引发前蛋白六种蛋白质形成引发前 体体, ,并与单链并与单链DNADNA结合，这一过程叫前引发过程。结合，这一过程叫前引发过程。 中医药研究常用分子生物学技术29 2、引发体（、引发体（primosome)形成形成 n引发前体与引发前体与引发酶引发酶(primase)组装成引发组装成引发 体。引发体可在体。引发体可在DNA上移动，在上移动

25、，在dnaB亚亚 基的作用下，识别基的作用下，识别DNA复制起点位置。复制起点位置。 n首先在先导链上合成一段首先在先导链上合成一段RNA引物，然后引物，然后 引发体沿引发体沿5 3 方向不断移动，在一段方向不断移动，在一段 距离上反复合成引物（距离上反复合成引物（primer)primer)。 中医药研究常用分子生物学技术30 （二）（二）DNA链的延伸链的延伸 nDNA新生链的合成由新生链的合成由DNA聚合酶聚合酶所催化所催化 。 nDNA聚合酶聚合酶在引物在引物3 3-OH-OH端连上核苷酸，以端连上核苷酸，以 使使DNADNA新链得以延长。新链得以延长。 n由由螺旋酶螺旋酶在复制叉处边

26、移动边解开双链。在复制叉处边移动边解开双链。 nDNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶要以打开一条链，使正超螺旋要以打开一条链，使正超螺旋 状态转变成松弛状态；而状态转变成松弛状态；而DNADNA拓扑异构酶拓扑异构酶(旋旋 转酶转酶) )可以在可以在DNADNA解链前方不停地继续将负超螺解链前方不停地继续将负超螺 旋引入双链旋引入双链DNADNA。 n在在DNA复制叉处由两套复制叉处由两套DNA聚合酶聚合酶在同一时在同一时 间分别进行复制间分别进行复制DNA前导链和滞后链。前导链和滞后链。 中医药研究常用分子生物学技术31 引物的切除：引物的切除： nDNA聚合酶聚合酶I发挥发挥5 3 外切酶活性，

27、外切酶活性， 切去引物切去引物RNA并填补空缺（缺刻平移），并填补空缺（缺刻平移）， 留下的缺刻由留下的缺刻由DNA连接酶连接酶连上。连上。 中医药研究常用分子生物学技术32 (三三)DNA复制的终止复制的终止 nDNA复制在复制终止位点处终止复制在复制终止位点处终止 。 n1、环形、环形DNA分子的终止分子的终止 n在单向复制的环形在单向复制的环形DNA分子中，复制终止分子中，复制终止 也即它的复制起点。在双向复制的环形也即它的复制起点。在双向复制的环形 DNA分子中，有的有固定的终点，而大多分子中，有的有固定的终点，而大多 数没有固定的终点。数没有固定的终点。 中医药研究常用分子生物学技术

28、33 2、线性、线性DNA复制的终止复制的终止 n由于引物由于引物RNA的水解，两个子代分子中，各有的水解，两个子代分子中，各有 一个一个5 端缺少一段核苷酸，而没有一个端缺少一段核苷酸，而没有一个DNA 聚合酶能填补。聚合酶能填补。 n（1）T7DNA：形成连环分子（：形成连环分子（concatemer) nT7DNA两端各有一段重复的数百个核苷酸，这两端各有一段重复的数百个核苷酸，这 叫末端冗余（叫末端冗余（terminal redundancy)。 n所以，两个子代所以，两个子代DNA分子中的单链末端可以互分子中的单链末端可以互 补，多余的单链部分被补，多余的单链部分被DNAase除去，

29、然后再由除去，然后再由 DNA连接酶连接起来形成连环分子。连接酶连接起来形成连环分子。 中医药研究常用分子生物学技术34 2、线性、线性DNA复制的终止复制的终止 n（2） DNA的环化法的环化法 n DNA进入宿主细胞内采用环化法，将线性分进入宿主细胞内采用环化法，将线性分 子连成环形。子连成环形。 n（3）真核细胞）真核细胞DNA末端复制依赖于末端复制依赖于端粒端粒和能够和能够 识别或结合端粒的识别或结合端粒的端粒酶端粒酶。 n首先在四膜虫中发现。四膜虫端粒中存在一种端首先在四膜虫中发现。四膜虫端粒中存在一种端 粒酶（粒酶（telomerase)telomerase)，这种酶能将端粒结构中

30、单，这种酶能将端粒结构中单 链尾巴链尾巴5 5 TTGGGG 3 TTGGGG 3延长，延长部分仍是延长，延长部分仍是 5 5 TTGGGG 3TTGGGG 3 。 n各种端粒这种富含各种端粒这种富含G G的序列总是突出的序列总是突出12121616个核个核 苷酸。苷酸。 中医药研究常用分子生物学技术35 端粒酶：端粒酶： n端粒酶是一种核蛋白，由端粒酶是一种核蛋白，由RNA和蛋白质构成。和蛋白质构成。 n1990年，年，Blackburn等人证明了端粒酶中的等人证明了端粒酶中的 RNA是富含是富含G序列的模板。序列的模板。 n例如：游仆虫的端粒酶例如：游仆虫的端粒酶RNA含有含有 n5 CA

31、AAACCCCAAAACC3 n端粒酶实际上是一种逆转录酶，模板存在于酶分端粒酶实际上是一种逆转录酶，模板存在于酶分 子中。子中。 n端粒酶中的端粒酶中的RNA可能还有别的作用。可能还有别的作用。 n由端粒酶连上的富含由端粒酶连上的富含G的尾巴弯起来，作为引物的尾巴弯起来，作为引物 复制以填补复制以填补5 空缺。空缺。 中医药研究常用分子生物学技术36 四、不需要四、不需要RNA引物的引物的DNA复制复制 n有些病毒的基因组是线性有些病毒的基因组是线性DNA，在原核细胞和真，在原核细胞和真 核细胞中复制时不需要核细胞中复制时不需要RNA引物引物。 n如：腺病毒如：腺病毒DNA和枯草菌噬菌体和枯

32、草菌噬菌体29DNA n复制从复制从DNA的一端开始，而且对两端无选择性，的一端开始，而且对两端无选择性， 各占各占50%的机率。的机率。 n这些这些DNA复制时，从一端开始，只能利用一条复制时，从一端开始，只能利用一条 DNA链作为模板，即以链作为模板，即以35链为模板。这样，链为模板。这样， 新合成的新合成的DNA链便将原来的亲代链便将原来的亲代DNA链取代。链取代。 n原来的亲代原来的亲代DNA链链(从合成起始端看是从合成起始端看是53链链) 作为单链从双螺旋中释放出来。这条链自身的作为单链从双螺旋中释放出来。这条链自身的5 和和3可以互补配对，然后在可以互补配对，然后在3端开始以此链为

33、模端开始以此链为模 板重新合成另一条子链。板重新合成另一条子链。 中医药研究常用分子生物学技术37 第三节第三节RNA的合成的合成 n一、一、RNA合成的基本特征：合成的基本特征： n1、 RNA的前体是四种核糖核苷三磷酸：的前体是四种核糖核苷三磷酸： ATP、GTP、CTP、UTP。 2、RNA链的生长方向是链的生长方向是5 3 ，核，核 苷三磷酸加在新生链的苷三磷酸加在新生链的3端，同时除去端，同时除去 一分子焦磷酸而生成磷酸二酯键，焦磷酸一分子焦磷酸而生成磷酸二酯键，焦磷酸 又分解为无机磷酸，从而推动反应向聚合又分解为无机磷酸，从而推动反应向聚合 方向转移。方向转移。 中医药研究常用分子

34、生物学技术38 一、一、RNA合成的基本特征：合成的基本特征： n3、 转录必须以一条转录必须以一条DNA链为模板，按照碱链为模板，按照碱 基配对原则进行转录，因此基配对原则进行转录，因此DNA中的中的A、G、 C、T将分别转录成将分别转录成U、C、G、A。在一个转录。在一个转录 区内，一般只有一条区内，一般只有一条DNA链可以转录。链可以转录。 n4、 RNA聚合酶能起始一条新链的合成，起聚合酶能起始一条新链的合成，起 始的核苷酸一般是嘌始的核苷酸一般是嘌呤呤核苷三磷酸，而且将在核苷三磷酸，而且将在 RNA链的链的5末端保持这一三磷酸基团。末端保持这一三磷酸基团。 中医药研究常用分子生物学技

35、术39 二、二、RNA聚合酶聚合酶 n（一）原核生物（一）原核生物RNA聚合酶聚合酶 n原核生物原核生物RNA聚合酶聚合酶全酶为全酶为2 n全酶可结合约全酶可结合约60个核苷酸，提示其形状应个核苷酸，提示其形状应 为椭圆球形。为椭圆球形。 n亚基和其他肽链的结合不很牢固。当亚基和其他肽链的结合不很牢固。当 亚基脱离全酶后，剩下的亚基脱离全酶后，剩下的 2称为称为 核心酶。核心酶。核心酶本身就能催化核苷酸间磷核心酶本身就能催化核苷酸间磷 酸二酯键的形成酸二酯键的形成 。 n亚基的功能可能是识别其相应的启动子。亚基的功能可能是识别其相应的启动子。 中医药研究常用分子生物学技术40 基因名称基因名称

36、 基因图基因图 位置位置 多肽链多肽链 分子量分子量 全酶中全酶中 的数目的数目 功能功能 RNA聚合聚合 酶的亚基酶的亚基 rpoC89.5 15500 0 1与与DNA结合结合 rpoB89.5 15100 0 1 聚合作用的催化位点聚合作用的催化位点 rpoD66.5 700001 识别启动子，起始识别启动子，起始 转录转录 rpoA72365002? 110001 ? 转录因子转录因子 rho84.5 4600 0 6转录终止转录终止 nusAnus A 65 6900 0 1转录延长，终止转录延长，终止 E.coli RNA聚聚 合酶的合酶的 亚基和亚基和 转录因转录因 子子 中医药

37、研究常用分子生物学技术41 RNA聚合酶可能的结构： 中医药研究常用分子生物学技术42 （二）真核生物（二）真核生物RNA聚合酶聚合酶 n有三类：有三类： nRNA聚合酶聚合酶，存在于核仁，合成，存在于核仁，合成5.8S 5.8S rRNArRNA、18S rRNA18S rRNA、28S rRNA28S rRNA。 n聚合酶聚合酶，存在于核质，合成，存在于核质，合成hnRNAhnRNA （mRNAmRNA的前体）和的前体）和snRNAsnRNA。 n聚合酶聚合酶，存在于核质，合成，存在于核质，合成tRNA和和5S rRNA以及转录以及转录Alu顺序。顺序。 中医药研究常用分子生物学技术43

38、三、启动子三、启动子 n（一）原核生物的启动子（一）原核生物的启动子 n对对100个启动子在转录上游个启动子在转录上游10和和35 处处 有两个共同顺序。有两个共同顺序。 nPribnow框：框：TATAAT六核苷酸序列称之。六核苷酸序列称之。 位于位于10区，是区，是RNA聚合酶牢固结合位点，聚合酶牢固结合位点， 简称结合位点。简称结合位点。 nSextama框：框：TTGACA六核苷酸序列称之。六核苷酸序列称之。 位于位于35区，是区，是RNA聚合酶初始结合位点，聚合酶初始结合位点， RNA聚合酶依靠聚合酶依靠亚基识别该位点，又叫亚基识别该位点，又叫 RNARNA聚合酶识别位点聚合酶识别位

39、点 中医药研究常用分子生物学技术44 Lac CCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTG fdG2 CTTTTTGATGCAATTCGCTTTGCTTCTGACTATAATAGACAGGGTAA PL GGCGGGTGTTGACATAAATACCACTTGGCGGTGATACTGAGCACATCA PR GTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGGTTGCATGTA tRNATyr CGTAACACTTTACAGCGGCGCGTCATTTGATATGATGCGCCCCGCTT Sextama框框pribnow

40、+1 T82T84G78A65C54A45T80A95T45A60A50T96 17bp 中医药研究常用分子生物学技术45 （二）真核生物的启动子（二）真核生物的启动子 n比较了比较了100个启动子，发现真核生物启动子是多个启动子，发现真核生物启动子是多 部位结构（部位结构（multipatide)主要有四个部位。主要有四个部位。 n1、帽子位点（、帽子位点（cap site)：即转录起始位点。其：即转录起始位点。其 碱基大多数是碱基大多数是A（非模板链）两侧各有若干个嘧（非模板链）两侧各有若干个嘧 啶核苷酸。啶核苷酸。A为转录起点。为转录起点。 n2、TATA框：又称为框：又称为Hognes

41、s框。位于框。位于25区附区附 近其一致序列为：近其一致序列为：T82A97T93A85A63A83A50，基本基本 上都是由上都是由A-T组成。组成。 n在在TATA框两侧有富含框两侧有富含G-C碱基对的序列，这是碱基对的序列，这是 TATA框发挥重要作用的因素之一。框发挥重要作用的因素之一。 中医药研究常用分子生物学技术46 （二）真核生物的启动子（二）真核生物的启动子 n3、CAAT框：一般位于框：一般位于75区附近。一区附近。一 致序列为：致序列为：GGCCAATCT，其头两个，其头两个G 的重要性并不亚于的重要性并不亚于CAAT部分。部分。 n作用作用：CAAT框控制着转录的频率。框

42、控制着转录的频率。 n4、增强子：一般在、增强子：一般在100区以上。单位区以上。单位 置较灵活，也可以位于下游或基因内部。置较灵活，也可以位于下游或基因内部。 n作用作用：对转录有增强效用：对转录有增强效用 中医药研究常用分子生物学技术47 四、转录过程四、转录过程 n转录的基本过程转录的基本过程 无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括：无论是原核还是真核细胞，转录的基本过程都包括： 模板识别模板识别 转录起始转录起始 通过启动子通过启动子 转录的延伸和终止。转录的延伸和终止。 中医药研究常用分子生物学技术48 四、转录过程四、转录过程 n（一）（一）RNA合成的合成的 起始和延伸起始

43、和延伸 1、二元复合物的形成、二元复合物的形成 （只有全酶和只有全酶和DNA） n（1）封闭的启动子）封闭的启动子 复合物复合物 n（2）开放性启动子）开放性启动子 复合物复合物 2、三元复合物的形成、三元复合物的形成 （全酶（全酶DNA RNA） 中医药研究常用分子生物学技术49 RNA合成起始合成起始 中医药研究常用分子生物学技术50 大肠杆菌大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区聚合酶全酶所识别的启动子区 中医药研究常用分子生物学技术51 RNA合成的延伸合成的延伸 中医药研究常用分子生物学技术52 由于基因转录所引起的由于基因转录所引起的DNA超螺旋结构变化超螺旋结构变化 中医药研究

44、常用分子生物学技术53 （二）（二）RNA合成的终止合成的终止 n转录终止信号存在于已转录的序列中。这转录终止信号存在于已转录的序列中。这 种提供终止信号的序列称为终止子种提供终止信号的序列称为终止子 （terminator)。 n终止子有两类：终止子有两类： n（1）依赖于蛋白质辅助因子才能实现终）依赖于蛋白质辅助因子才能实现终 止作用，这种蛋白子因子称为释放因子，止作用，这种蛋白子因子称为释放因子， 通常又称为通常又称为 因子。因子。 n（2）不依赖蛋白质辅助因子就能实现终）不依赖蛋白质辅助因子就能实现终 止作用。止作用。 中医药研究常用分子生物学技术54 1、不依赖、不依赖 因子的终止子

45、的特点：因子的终止子的特点： （1）在终止点前）在终止点前 有一段反向重复有一段反向重复 序列序列 （2）方向重复序）方向重复序 列中富含列中富含G-C碱碱 基对基对 （3）在反向重复）在反向重复 序列下游有序列下游有68 个个A-T对对 中医药研究常用分子生物学技术55 2、依赖、依赖 的终止子的特点：的终止子的特点： （1）在终止点前有）在终止点前有 一段反向重复序一段反向重复序 列列 （2）方向重复序列）方向重复序列 中中G-C含量较少含量较少 （3）方向重复序列）方向重复序列 下游的序列没有下游的序列没有 固定特征，其固定特征，其A- T含量较前者低。含量较前者低。 中医药研究常用分子

46、生物学技术56 终止子终止转录的机制：终止子终止转录的机制： n1、不依赖、不依赖 因子：（因子：（1）富含）富含G-C对之对之 后后810碱基处，转录会出现跌宕。碱基处，转录会出现跌宕。 n（2）反向重复序列形成发夹结构之后，）反向重复序列形成发夹结构之后， 阻碍了阻碍了RNA链从三元复合物中释放出来，链从三元复合物中释放出来， 使延宕时间延长。使延宕时间延长。 n（3）一连串）一连串A转录出一连串转录出一连串U n2、依赖、依赖 因子：（因子：（1）G-C含量低，（含量低，（2） 发夹结构缺乏发夹结构缺乏U，所以只有，所以只有 因子可终止因子可终止 转录。转录。 中医药研究常用分子生物学技

47、术57 五、转录后加工五、转录后加工 n（一）转录产物的修饰（一）转录产物的修饰 n1、帽子、帽子 n2、多聚（、多聚（A）尾巴）尾巴 中医药研究常用分子生物学技术58 真核生物真核生物mRNA的帽子结构的帽子结构 中医药研究常用分子生物学技术59 （二）转录产物的剪接（二）转录产物的剪接 n1、rRNA的剪接的剪接 n（1）E.coli的三种的三种rRNA：5SrRNA、 16SrRNA、23SrRNA与与tRNA基因混杂，基因混杂， 需要剪切。需要剪切。 n（2）真核生物）真核生物rRNA n人人rRNA转录初产物为转录初产物为45S，经过剪切成，经过剪切成 为为18SrRNA、28SrR

48、NA、5.8SrRNA。 中医药研究常用分子生物学技术60 n2、tRNA的剪接的剪接 n（1）E.coli tRNA转录单位是多基因的需转录单位是多基因的需 要剪切要剪切 n（2）真核生物酵母约）真核生物酵母约400个核个核tRNA基因，基因， 有约有约40个基因中含有内含子，内含子长个基因中含有内含子，内含子长 1446bp。需要切除内含子。需要切除内含子。 n3、hnRNA切除内含子切除内含子 n内含子内含子5 3 的拼接点序列为：的拼接点序列为： GUAG。 snRNA参与了识别拼接点的参与了识别拼接点的 作用。作用。 中医药研究常用分子生物学技术61 真核生物真核生物 hnRNA内含

49、内含 子剪切示意子剪切示意 图图 中医药研究常用分子生物学技术62 第四节第四节 蛋白质的合成蛋白质的合成 n蛋白质是生物信息通路上的终产物，一个蛋白质是生物信息通路上的终产物，一个 活细胞在任何发育阶段都需要数千种不同活细胞在任何发育阶段都需要数千种不同 的蛋白质。因此，活细胞内时刻进行着各的蛋白质。因此，活细胞内时刻进行着各 种蛋白质的合成、修饰、运转和降解反应。种蛋白质的合成、修饰、运转和降解反应。 中医药研究常用分子生物学技术63 n遗传密码遗传密码三联子三联子 n所谓所谓翻译翻译是指将是指将mRNA链上的核苷酸从一个特定链上的核苷酸从一个特定 的起始位点开始，按每的起始位点开始，按每

50、3个核苷酸代表一个氨基个核苷酸代表一个氨基 酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。这酸的原则，依次合成一条多肽链的过程。这3个个 核苷酸就是一个核苷酸就是一个密码子密码子。 n翻译从起始密码子翻译从起始密码子AUG开始，沿开始，沿mRNA 53 方方 向连续阅读密码子，直至终止密码子为止，生成向连续阅读密码子，直至终止密码子为止，生成 一条具有特定序列的多肽链一条具有特定序列的多肽链蛋白质。蛋白质。 中医药研究常用分子生物学技术64 Crick关于关于tRNA分子破译分子破译mRNA遗传密码三联遗传密码三联 子的原始构想子的原始构想 中医药研究常用分子生物学技术65 n三联子密码及其破译三联子密

51、码及其破译 n因为因为mRNA中只有中只有4种核苷酸，而蛋白质中有种核苷酸，而蛋白质中有20 种氨基酸，以一种核苷酸代表一种氨基酸是不可种氨基酸，以一种核苷酸代表一种氨基酸是不可 能的。若以两种核苷酸作为一个氨基酸的密码能的。若以两种核苷酸作为一个氨基酸的密码 （二联子），它们能代表的氨基酸也只有（二联子），它们能代表的氨基酸也只有42=16 种。若以种。若以3个核苷酸代表一个氨基酸，有个核苷酸代表一个氨基酸，有43=64种种 密码子，满足了编码密码子，满足了编码20种氨基酸的需要。种氨基酸的需要。 中医药研究常用分子生物学技术66 用核苷酸的插入或删除实验证明用核苷酸的插入或删除实验证明mR

52、NA模板上每三个核模板上每三个核 苷酸组成一个密码子苷酸组成一个密码子 中医药研究常用分子生物学技术67 n遗传密码的性质遗传密码的性质 n1. 密码的简并性密码的简并性 4种核苷酸可组成种核苷酸可组成64个密码子，现在已经知道其个密码子，现在已经知道其 中中61个是编码氨基酸的密码子，另外个是编码氨基酸的密码子，另外3个即个即UAA、 UGA和和UAG并不代表任何氨基酸，它们是终止密并不代表任何氨基酸，它们是终止密 码子，不能与码子，不能与tRNA的反密码子配对，但能被终止的反密码子配对，但能被终止 因子或释放因子识别，终止肽链的合成。因子或释放因子识别，终止肽链的合成。 中医药研究常用分子

53、生物学技术68 通用遗传密码及相应的氨基酸通用遗传密码及相应的氨基酸 中医药研究常用分子生物学技术69 nC亮氨酸（亮氨酸（Leu，L）脯氨酸（）脯氨酸（Pro，P）组）组 氨酸（氨酸（His，H）精氨酸（）精氨酸（Arg，R）U亮氨亮氨 酸（酸（Leu，L）脯氨酸（）脯氨酸（Pro，P）组氨酸）组氨酸 （His，H）精氨酸（）精氨酸（Arg，R）C亮氨酸亮氨酸 （Leu，L）脯氨酸（）脯氨酸（Pro，P）谷氨酰胺）谷氨酰胺 （Gln，Q）精氨酸（）精氨酸（Arg，R）A亮氨酸亮氨酸 （Leu，L）脯氨酸（）脯氨酸（Pro，P）谷氨酰胺）谷氨酰胺 （Gln，Q）精氨酸（）精氨酸（Arg，R）G

54、 中医药研究常用分子生物学技术70 nA异亮氨酸（异亮氨酸（Ile，I）苏氨酸（）苏氨酸（Thr，T）天）天 冬酰胺（冬酰胺（Asn，N）丝氨酸（）丝氨酸（Ser，S）U异异 亮氨酸（亮氨酸（Ile，I）苏氨酸（）苏氨酸（Thr，T）天冬酰）天冬酰 胺（胺（Asn，N）丝氨酸（）丝氨酸（Ser，S）C异亮氨异亮氨 酸（酸（Ile，I）苏氨酸（）苏氨酸（Thr，T）赖氨酸）赖氨酸 （Lys，K）精氨酸（）精氨酸（Arg，R）A甲硫氨酸甲硫氨酸 （Met，M）苏氨酸（）苏氨酸（Thr，T）赖氨酸）赖氨酸 （Lys，K）精氨酸（）精氨酸（Arg，R）G 中医药研究常用分子生物学技术71 nG缬氨酸（

55、缬氨酸（Val，V）丙氨酸（）丙氨酸（Ala，A）天）天 冬氨酸（冬氨酸（Asn，N）甘氨酸（）甘氨酸（Gly，G）U缬缬 氨酸（氨酸（Val，V）丙氨酸（）丙氨酸（Ala，A）天冬氨）天冬氨 酸（酸（Asn，N）甘氨酸（）甘氨酸（Gly，G）C缬氨酸缬氨酸 （Val，V）丙氨酸（）丙氨酸（Ala，A）谷氨酸（）谷氨酸（Glu， E）甘氨酸（）甘氨酸（Gly，G）A缬氨酸（缬氨酸（Val，V） 丙氨酸（丙氨酸（Ala，A）谷氨酸（）谷氨酸（Glu，E）甘氨）甘氨 酸（酸（Gly，G）G 中医药研究常用分子生物学技术72 n除色氨酸（除色氨酸（UGG）只有一个密码子外，其他氨基）只有一个密码子外

56、，其他氨基 酸都有一个以上的密码子。酸都有一个以上的密码子。9种氨基酸有种氨基酸有2个密码个密码 子，子，1种氨基酸有种氨基酸有3个密码子，个密码子，5种氨基酸有种氨基酸有4个密个密 码子，码子，3种氨基酸有种氨基酸有6个密码子。个密码子。 n由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为 简并简并（degeneracy），对应于同一氨基酸的密码），对应于同一氨基酸的密码 子称为子称为同义密码子同义密码子（synonymous codon）。）。 nAUG和和GUG既是甲硫氨酸及缬氨酸的密码子又是既是甲硫氨酸及缬氨酸的密码子又是 起始密码子起始密码子。 中

57、医药研究常用分子生物学技术73 密码子的兼并性密码子的兼并性 中医药研究常用分子生物学技术74 n3. 密码子与反密码子的相互作用密码子与反密码子的相互作用tRNA的反密码的反密码 子在核糖体内是通过碱基的反向配对与子在核糖体内是通过碱基的反向配对与mRNA上上 的密码子相互作用的。的密码子相互作用的。1966年，年，Crick提出提出摆动摆动 假说假说（wobble hypothesis），），解释了反密码子解释了反密码子 中某些稀有成分（如中某些稀有成分（如I）的配对，以及许多氨基酸）的配对，以及许多氨基酸 有有2个以上密码子的问题。个以上密码子的问题。 中医药研究常用分子生物学技术75

58、n mRNA上的密码子与 tRNA上的反密码子配 对示意图。 na. 密码子与tRNA反密 码子臂上相应序列配对； nb. 当反密码子第一位是 I时，密码子第三位可 以是A、U或C。 中医药研究常用分子生物学技术76 ntRNAtRNA ntRNAtRNA不但为每个三联密码子翻译成氨基酸提供了接合体，不但为每个三联密码子翻译成氨基酸提供了接合体， 还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了运送还为准确无误地将所需氨基酸运送到核糖体上提供了运送 载体，所以，它又被称为载体，所以，它又被称为第二遗传密码第二遗传密码。 n不同不同tRNAtRNA在结构上存在大量的共性，由小片段碱基互补配在结构上

59、存在大量的共性，由小片段碱基互补配 对形成对形成三叶草形分子结构三叶草形分子结构，有，有4 4条根据结构或已知功能命条根据结构或已知功能命 名的手臂。名的手臂。 n最常见最常见tRNA分子有分子有76个碱基，相对分子质量约为个碱基，相对分子质量约为 2.5104，不同的，不同的tRNA分子可有分子可有7495个核苷酸不等。个核苷酸不等。 中医药研究常用分子生物学技术77 nD臂臂中存在多至中存在多至3个可变核苷酸位个可变核苷酸位 点，点，17：1及及20：1、20：2。最常。最常 见的见的D臂缺失这臂缺失这3个核苷酸，而最个核苷酸，而最 小的小的D臂中第臂中第17位核苷酸也缺失了。位核苷酸也缺

60、失了。 D臂是根据它含有二氢尿嘧啶臂是根据它含有二氢尿嘧啶 （dihydrouracil）命名的。）命名的。 n受体臂受体臂（acceptor arm）由链两端）由链两端 序列配对形成的杆状结构和序列配对形成的杆状结构和3端未端未 配对的配对的34个碱基所组成，其个碱基所组成，其3端端 的最后的最后3个碱基序列永远是个碱基序列永远是CCA， 最后一个碱基的最后一个碱基的3或或2自由羟基自由羟基 （OH）可以被氨酰化。）可以被氨酰化。 nTC臂是根据臂是根据3个核苷酸命名的，个核苷酸命名的， 其中其中表示拟尿嘧啶；表示拟尿嘧啶； n反密码子臂反密码子臂是根据位于套索中央的是根据位于套索中央的 三