样本采集与实验室分析-2014

1、微生物食物中毒标本采集 实验室检测及结果分析概述n一、标本采集n二、检测项目确定n三、实验室检验n四、结果解读报告与分析n五、案例分析准确的检测结果包括正确采集样品正确选择检测方法多种检测方法运用综合分析判断细菌性食品中毒的主要特征及主要检验标本细菌性食品中毒的主要特征及主要检验标本食物中毒细菌食物中毒细菌 常见食品常见食品潜伏期潜伏期病程病程主要症状主要症状主要检验标本主要检验标本沙门菌肉类、蛋品最短68小时，长者23天，平均1224小时37天恶心、呕吐、腹痛、腹泻、发热（3840）、出冷汗、头痛、全身痛粪便 、食品、血液副溶血性弧菌水产品、醃制品324小时，平均10小时13天呕吐、发热、腹

2、痛（上腹部）、腹泻水样便粪便 、食品金黄色葡萄球菌肉类、乳品、淀粉制品30分钟6小时，平均2.53小时12天恶心、呕吐（频繁而剧烈）、腹痛、腹泻食品、呕吐物蜡样芽胞杆菌米饭、肉、乳、淀粉制品最短30分钟1小时，长者8小时约1 天（腹泻型1636h，呕吐型为810h）恶心、呕吐、腹痛、腹泻食品、呕吐物致泻性大肠杆菌凉拌菜、肉食品220小时，通常410小时13天呕吐、腹痛、腹泻水样便或粘液便，发热不超过39粪便 、食品椰毒假单胞菌玉米面、银耳148小时，多数56小时27天头痛、惊恐、抽搐、牙关紧闭、嗜睡、昏迷食品、呕吐物产气荚膜梭菌肉食品822小时，平均1012小时12天腹痛、腹泻、少数有呕吐粪便

3、、食品肉毒梭菌堆放牛羊肉、罐头、香肠、鱼、豆制品2小时14天，平均12天220天咽食困难、复视、失音、呼吸困难食品、呕吐物变形杆菌动物性食品，特别是熟肉和内脏制品冷盘518小时多在13天恢复，极少数可达 12周除腹痛、腹泻等症状外，还有顔面潮红、头痛、荨麻疹等过敏症状食品、粪便 、呕吐物流行病学流行病学实验室实验室n样本采集方案与检测人员沟通，便于实验室分析处理。样本采集方案与检测人员沟通，便于实验室分析处理。样本前期处理，做好实验前准备。样本前期处理，做好实验前准备。n共同商定分析方案：现场工作人员或临床医务工作者共同商定分析方案：现场工作人员或临床医务工作者要和实验室分析人员多沟通，对现场

4、情况、所收集样本要和实验室分析人员多沟通，对现场情况、所收集样本的情况、现场工作的方向等进行讨论，确定应该检验的的情况、现场工作的方向等进行讨论，确定应该检验的毒物种类以及是否需要定量，据此制定实验室检测工作毒物种类以及是否需要定量，据此制定实验室检测工作方案。方案。一、标本采集 （1）及时性原则 （2）针对性原则 （3）适量性原则 （4）不污染原则规范采样是获得可靠检测结果的重要保证n合理的采样时机和种类n足够的样品采样量n多种样品同时采集n正确的采样方法n样品妥善保存运输合理的采样时机和种类合理的采样时机和种类伤寒病人样本采集：血液：宜在病程1-2周发烧期内骨髓：整个病程粪便：宜在病程3-

5、4周内，抗生素治疗前或者停药3天后采集，带菌者以粪便采集为主。根据临床症状确定样品采集根据临床症状确定样品采集根据流行病学、卫生学调查采集根据流行病学、卫生学调查采集细菌性食品中毒的主要特征及主要检验标本细菌性食品中毒的主要特征及主要检验标本食物中毒细菌食物中毒细菌 常见食品常见食品潜伏期潜伏期病程病程主要症状主要症状主要检验标本主要检验标本沙门菌肉类、蛋品最短68小时，长者23天，平均1224小时37天恶心、呕吐、腹痛、腹泻、发热（3840）、出冷汗、头痛、全身痛粪便 、食品、血液副溶血性弧菌水产品、醃制品324小时，平均10小时13天呕吐、发热、腹痛（上腹部）、腹泻水样便粪便 、食品金黄色

6、葡萄球菌肉类、乳品、淀粉制品30分钟6小时，平均2.53小时12天恶心、呕吐（频繁而剧烈）、腹痛、腹泻食品、呕吐物蜡样芽胞杆菌米饭、肉、乳、淀粉制品最短30分钟1小时，长者8小时约1 天（腹泻型1636h，呕吐型为810h）恶心、呕吐、腹痛、腹泻食品、呕吐物致泻性大肠杆菌凉拌菜、肉食品220小时，通常410小时13天呕吐、腹痛、腹泻水样便或粘液便，发热不超过39粪便 、食品椰毒假单胞菌玉米面、银耳148小时，多数56小时27天头痛、惊恐、抽搐、牙关紧闭、嗜睡、昏迷食品、呕吐物产气荚膜梭菌肉食品822小时，平均1012小时12天腹痛、腹泻、少数有呕吐粪便、食品肉毒梭菌堆放牛羊肉、罐头、香肠、鱼、

7、豆制品2小时14天，平均12天220天咽食困难、复视、失音、呼吸困难食品、呕吐物变形杆菌动物性食品，特别是熟肉和内脏制品冷盘518小时多在13天恢复，极少数可达 12周除腹痛、腹泻等症状外，还有顔面潮红、头痛、荨麻疹等过敏症状食品、粪便 、呕吐物 杯状病毒杯状病毒（诺如病毒、扎如病毒）（诺如病毒、扎如病毒）排病毒数量与病程有排病毒数量与病程有关关，发病发病4天内几乎天内几乎100%病人排病毒，易于检查；病人排病毒，易于检查； 病程病程59天时天时50%排病毒；病程排病毒；病程10天后约天后约10%排病毒。排病毒。采样时机对检验结果的影响采样时机对检验结果的影响病程病程病人粪便排毒病人粪便排毒率

8、率假设粪便标本假设粪便标本检验阳性率检验阳性率与暴发事件与暴发事件病因的关系病因的关系发病发病4天内天内100%10%?发病发病5950%10%?发病发病10天天10%10%?注意：样品标签和登记信息，帮助实验室选择最佳样品检注意：样品标签和登记信息，帮助实验室选择最佳样品检测，帮助实验室结果的解释测，帮助实验室结果的解释正确采样方法正确采样方法n无菌操作n防止采集的标本受到影响多种样品同时采集多种样品同时采集（一） 食品（二）水源（三） 临床标本 粪便、血液、呕吐物、手表面、尸体标本（四）物体表面： 刚被稀便污染的尿布、衣服、 床单等，炊事用具，其它可能被污染的物体表面（五） 宿主动物（六）

9、 昆虫等媒介生物（一）食品标本的采集方法n用灭菌工具采取可疑食物，以及原配料、半成品等，置于灭菌容器中。n如已无可疑食物，可用灭菌棉拭在可疑食物的容器内涂抹，置于装有少量生理盐水的试管内。n可疑的食物盒子可直接送检，如仅剩空盒，可将空盒送检。（二）水源标本的采集方法及注意事项n以灭菌的500ml盐水瓶采取水样至少450ml，但不能让水样充满整个瓶子，应留有一定的空气。一般在可疑污染的河流、池塘岸边的30cm深度以内的表层水采取水样。连续采取多份水样时，注意防止水样间相互污染。采取的水样应立即放入冷藏箱中尽快送到实验室。不能在3小时内送检者，应在采水点即将水样加入培养基中，摇匀，室温下运送至实验

10、室。（三） 临床标本的采集方法1. 粪便标本n一般采用自然留便，若采样时病人无便或婴幼儿则可采用肛拭法。n留便：用2个棉拭子分别在自然排出的新鲜粪便中可疑部分多点挑取采集约5g标本。腹泻病人应取脓、血、粘液等异常部分。液体粪便取絮状物约5ml。n肛拭法：先用无菌甘油水或生理盐水湿润棉签，多余的液体紧靠管壁挤出；再用棉拭或肛门采便管由肛门插入直肠内约3cm5cm（幼儿约2cm3cm）处，轻轻旋转360，擦取直肠表面黏液后取出。避免采便量过少（注意棉签上应沾有粪便）。n为作厌氧菌检查应将标本置于厌氧袋中转送。（三） 临床标本的采集方法2. 血液标本n（1）绑上止血带，并用手触摸，以确定固定住的静脉

11、位 置。n（2）用2%碘酒消毒皮肤，从穿刺点中心部位开始向外扩大，消毒范围不应小于5cm（直径）。n（3）待皮肤干后，再75%酒精擦去碘酒，且不能用手指触 摸消毒后的皮肤。n（4）皮肤酒精干后，穿刺采集血液，采血量成人5-10ml，婴幼儿1-5ml。n（5）根据需要，血标本分为抗凝和不抗凝两种，于采集后无菌操作分别注入市售抗凝和不抗凝采集管中。需做抗体检测时，第二份血与第一份血采集时间一般相隔约2周，最短不能少于10天。（三） 临床标本的采集方法3. 呕吐物n用无菌压舌板或棉拭子挑取少量呕吐物作为检材，放入自封塑料袋中并封好袋口或置于灭菌带盖瓶中，然后盖紧瓶盖，立即置于冷藏箱中。（三） 临床标

12、本的采集方法4. 手表面n用灭菌棉拭蘸以灭菌生理盐水，涂抹手表面，立即置于采样管中，盖紧管盖。（三） 临床标本的采集方法5. 尸体标本n应于死后尽可能早地无菌采取，放于无菌容器内，不要使用防腐剂；对于各种器官标本，解剖器材和盛装容器要分开。（四）物体表面标本的采集方法n用灭菌棉拭蘸以灭菌生理水涂擦沾染粪便的衣物、床单等表面或食品表面或水生动物体表，放入到采样管中或直接置于增菌液中增菌。（五） 宿主动物标本的采集方法n以无菌操作采集可疑宿主动物新鲜粪便约5克，置于采样袋中，立即置于冷藏箱中。（六） 昆虫等媒介生物的采集方法n如采集苍蝇标本：在每个采样点以1015只苍蝇作为一份标本放入自封袋中，立

13、即封好袋口，置于冷藏箱中。 标本采集送检注意事项n送检标本时应填写“标本送检单”，写明姓名、地址、发病时间、采集时间、临床诊断等。标本管/袋或瓶上标记样品编号样品编号。病人标本含有大量病菌，标本装入试管或小瓶时，注意勿污染容器口外壁，必须妥善包装以防破碎、渗漏等，放在坚固的送检箱内由专人送往检验室，运送过程中注意安全。 标本的保存n所有标本采集后都应立即置于冷藏箱中，尽快送往实验室。不能在3小时内送达者，细菌标本应尽可能在现场接种；病毒标本可临时保存在4冰箱，但不能超过3天，如近期不能检测，则应直接在-20 或-80 下冻存，有条件的可将样品分成几小份，以避免以后接种标本时的反复冻融。标本的运

14、输n标本采集后必须尽快送至实验室。n用于RNA检测的标本，如果未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。n标本在运送时，应采用不易破碎的容器装载标本。n运送要注意生物安全生物安全1.标本采集时要严格执行生物安全防护要求，防止污染、传播和自身感染 。2.标本采集完毕，首先消毒，然后脱掉防护装备。3.所有使用过的采样相关物品要带离现场，高压灭菌消毒后丢弃。4.采样箱每次用完后要及时消毒处理。二、检测项目的确定标本检测项目的确定标本检测项目的确定n检测那些项目？n谁决定检测项目？ 在暴发调查中，实验室的病因物质在暴发调查中，实验室的病因物质检测，不是搜索寻找病因，是对病因假检测，不是搜索寻找病因

15、，是对病因假设的证实。根据病因假设、检验条件，设的证实。根据病因假设、检验条件，确定检验指标。确定检验指标。流行病学流行病学实验室实验室n样本采集方案与检测人员沟通，便于实验室分析处理。样本采集方案与检测人员沟通，便于实验室分析处理。n共同商定分析方案：现场工作人员或临床医务工作者共同商定分析方案：现场工作人员或临床医务工作者要和实验室分析人员多沟通，对现场情况、所收集样本要和实验室分析人员多沟通，对现场情况、所收集样本的情况、现场工作的方向等进行讨论，确定应该检验的的情况、现场工作的方向等进行讨论，确定应该检验的毒物种类以及是否需要定量，据此制定实验室检测工作毒物种类以及是否需要定量，据此制

16、定实验室检测工作方案。方案。三、实验室检验检什么毒素检测毒素检测 病原分离病原分离 细菌细菌 病毒病毒 寄生虫寄生虫血清学检查血清学检查 抗原抗原 抗体抗体 急性期急性期IgMIgM抗体抗体 急性期和恢复期双份静脉血测定特异性急性期和恢复期双份静脉血测定特异性IgGIgG抗体。抗体。核酸检测核酸检测 特征基因、毒力基因、溯源比较特征基因、毒力基因、溯源比较定性定性/ /定量定量怎么检n用什么方法用什么方法（同时需要考虑方法灵敏度、准确度、同时需要考虑方法灵敏度、准确度、重现性、不同方法结果的可比较性、还需要考虑待测重现性、不同方法结果的可比较性、还需要考虑待测样品（毒物、代谢物）、分析要求（定

17、性、定量）、样品（毒物、代谢物）、分析要求（定性、定量）、样品类型、实验室条件，分析目的等因素，还要考虑样品类型、实验室条件，分析目的等因素，还要考虑时效性、准确性、经济性等要求）时效性、准确性、经济性等要求）n用什么试剂用什么试剂 对重大事件的毒物鉴定或样本检测要同时送数家具有鉴定检验对重大事件的毒物鉴定或样本检测要同时送数家具有鉴定检验资质的实验室同步开展工作，避免因实验室管理和技术因素对结果的资质的实验室同步开展工作，避免因实验室管理和技术因素对结果的影响。影响。 采样时，分装采样时，分装N份，分别保存和送检份，分别保存和送检怎么检快速灵敏方法的应用快速灵敏方法的应用仪器自动化方法仪器自

18、动化方法改进分离培养方法改进分离培养方法怎么检怎么检检验流程：检验流程：1 . 样品采集样品采集 2. 初步检验初步检验（直接镜检、免疫快诊、（直接镜检、免疫快诊、PCR。) 3. 分离培养分离培养 (包括增菌培养和直接平板培养包括增菌培养和直接平板培养) 4. 初筛试验、纯培养初筛试验、纯培养（快速诊断方法的使用）（快速诊断方法的使用） 5. 全面鉴定全面鉴定（菌株鉴定、毒素测定）（快速检测方法）（菌株鉴定、毒素测定）（快速检测方法）四、结果的报告与分析结果的报告与分析n检验结果的正确性不仅取决于实验室的条件检验结果的正确性不仅取决于实验室的条件和技术水平，同时还与检验样品的采集、保和技术水

19、平，同时还与检验样品的采集、保存、送样方法等方面有关。因此在分析检验存、送样方法等方面有关。因此在分析检验结果时，除了应考虑结果是否符合有关实验结果时，除了应考虑结果是否符合有关实验室判定标准外，还应综合考虑各种影响检验室判定标准外，还应综合考虑各种影响检验结果的因素。结果的因素。结果的报告与分析n阳性结果不一定能说明病原因子在爆发事件阳性结果不一定能说明病原因子在爆发事件中的致病作用；反之阴性结果也不一定能完中的致病作用；反之阴性结果也不一定能完全否定某种病原因子的病因假设全否定某种病原因子的病因假设.结果的报告与分析n实验室检测结果是确定病因的重要依据，但实实验室检测结果是确定病因的重要依

20、据，但实验室结果要和现场调查情况、患者的临床表现验室结果要和现场调查情况、患者的临床表现一起分析，才能确定病因。一起分析，才能确定病因。五、案例分析五、案例分析n2010年9月8日起，四川某高职学院陆续有学生发病，症状以腹痛、腹泻为主，部分学生伴恶心、呕吐，个别有发热等症状并到本校医院进行治疗,疾病预防控制中心疫情处理人员于9月15日接到报告后赶赴现场调查和采样。 n问题1：现场调查内容？n1）基本情况学校情况，食堂情况，饮用水情况n2） 发病情况发病情况n3）临床表现临床表现 n4）治疗情况 1）、基本情况n该学院位于岷江二号桥旁，占地三百七十余亩，全院有教职工330人，学生4500人，学生

21、均住校。8月23日新学期整体搬入该新校址。学院生活饮用水为自备式供水，水源位于岷江旁，取水点位于学院污水排污口下方200米；学校未集中供应开水，学生寝室多配有饮水机，主要饮用“龙荪泉”、“清心泉”牌桶装矿泉水。学校的水处理厂没有定期对水源水进行消毒和监测。同时，污水处理设备一直未启用，且污水管道在铺设时不符合标准，导致生活污水泄露，并蓄积在取水点上方的低洼地带，该校生活饮用水取水点设置见图1。 2）、发病情况）、发病情况 9月8日以来陆续有学生发病，症状以腹痛、腹泻为主，部分学生伴恶心、呕吐，个别有发热等症状。共计249例。病例在9月13日以后逐渐增多，9月1416日发病人数达到高峰，17日以后发病人数有所下降，每日新增病例数见图2。病