TALENs的靶向基因修饰技术易懂版

1、TALENs的靶向基因修饰技术的靶向基因修饰技术TALENs-transcription activator-like effectors transcription activator-like effectors nucleases简介简介Cas9锌指核酸酶锌指核酸酶技术技术 (ZFN) 转基因技转基因技术术RNAi技术技术生物应用模型构生物应用模型构建建基因组靶向修饰（TALENs）普通的基普通的基因敲除因敲除什么是基因敲除？v是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近平上设计实验，将该基因去除，或

2、用其它顺序相近基因取代，然后从基因取代，然后从整体观察实验动物（表型）整体观察实验动物（表型），推，推测相应基因的功能。测相应基因的功能。v基因敲除是自基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术。分子生物学技术。基因敲除的技术基础基因敲除胚胎干细胞（ES）分离体外培养技术1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。基因敲除主要是基因敲除主要是应用应用DNA同源重组原理，同源重组原理，用用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除

3、的目的。基因敲除的目的。交叉互换交叉互换基因敲除的技术基础利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤构建重组载体表型研究获得ES细胞鉴定筛选阳性细胞同源重组选择纯合子TALEN基因敲除技术v TALEN（ Transcription Activator-Like Effector Nucleases ）转录激活子样效应因子核酸酶转录激活子样效应因子核酸酶,v 科学家发现天然的科学家发现天然的TALENs最初是由黄单胞菌进入植物细胞分泌的，将它应最初是由黄单胞菌进入植物细胞分泌的，将它应用于基因修饰方面，使它成为了一种崭新的分子生物学方法用于基因修饰方面

4、，使它成为了一种崭新的分子生物学方法.v TALENs技术特点：技术特点：1. 无基因序列、细胞、物种限制。无基因序列、细胞、物种限制。 2. TALE的核酸识别单元与的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应有恒定的对应关系。实验设计关系。实验设计 简单准确、实验周期短、成本低。简单准确、实验周期短、成本低。 3. 成功率几乎可达成功率几乎可达100%。 毒性低、脱靶情况少。毒性低、脱靶情况少。 4. 克服了常规的克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等

5、或更好的相等或更好的活性。活性。TALEN基因敲除技术每周 人们可以对基因组的人们可以对基因组的特定位点进行各种遗特定位点进行各种遗传操作传操作, 包括基因打包括基因打靶、基因定点插入、靶、基因定点插入、基因修复等基因修复等, 从而能从而能够方便快捷地对基因够方便快捷地对基因组实现靶向遗传修饰组实现靶向遗传修饰。TALENs可识别并结可识别并结合特定的合特定的 DNA 序列序列, 并通过切割这一序并通过切割这一序列的特定位点造成列的特定位点造成DNA的双链断裂的双链断裂(DSB)细胞利用天然的细胞利用天然的DNA修复过程非同源末端修复过程非同源末端结合（结合（NHEJ）导致）导致DNA断裂处碱

6、基的变断裂处碱基的变异，造成翻译蛋白的异，造成翻译蛋白的移码突变，从而不能移码突变，从而不能产生正确的蛋白质，产生正确的蛋白质，即最终实现基因敲除即最终实现基因敲除。技术原理技术原理TALEN基因敲除技术TALETALE蛋白能识别并结合特异的蛋白能识别并结合特异的 DNA DNA 序列，序列， Fok I Fok I 则可通过二聚体化产生核酸内切酶活性则可通过二聚体化产生核酸内切酶活性, , 从而在从而在特定的位点切断特定的位点切断DNADNA序列，造成序列，造成 DNA DNA 的双链断裂的双链断裂(Double-stand break, DSB)(Double-stand break, D

7、SB)。TALENs结构TALE蛋白的蛋白的DNA结合结合域结合结合域Fok I 核酸酶的切割结构域核酸酶的切割结构域vTALETALE模块识别模块识别DNADNA的机制在于不同的双连氨基酸残基的机制在于不同的双连氨基酸残基（VDVD）能够特异地分别识别）能够特异地分别识别A A、T T、C C、G 4 G 4 种碱基种碱基中的一种。中的一种。v通过对天然通过对天然TALE TALE 的研究发现，有的研究发现，有2020多种不同的多种不同的VDVD可以特异性的识别碱基，其中可以特异性的识别碱基，其中 Asn /Ile( NI) Asn /Ile( NI)识别识别碱基碱基A; His /Asp(

8、 HD)A; His /Asp( HD)识别碱基识别碱基C; Asn/Gly(NG)C; Asn/Gly(NG)识识别碱基别碱基T; Asn /Asn( NN)T; Asn /Asn( NN)识别碱基识别碱基G/AG/A。vVD VD 的第的第1 1 位氨基酸与蛋白质骨架结合，起到稳定位氨基酸与蛋白质骨架结合，起到稳定VD VD 的作用的作用; ; 第第2 2 位氨基酸则直接与位氨基酸则直接与DNA DNA 的碱基特的碱基特异识别异识别TALETALE是由是由1212和和1313以上特异性识别以上特异性识别DNADNA的串联的串联“蛋白模块蛋白模块”和两侧的和两侧的N-N-末端及末端及C-C-

9、末端序列组成。每个末端序列组成。每个“蛋白模块蛋白模块”包含包含3434个氨基酸，第个氨基酸，第1212和和1313位双连氨基位双连氨基酸残基酸残基 (RVDs) (RVDs)是靶向识别的关键位点，是靶向识别的关键位点，TALEsTALEs上的每个上的每个RVDsRVDs仅能识别一个碱仅能识别一个碱基基, ,这样就产生了一连串的识别序列。这样就产生了一连串的识别序列。v将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到将靶点识别模块克隆入真核表达载体，得到Talen质粒对靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达质粒对靶点识别模块串接成功后需克隆入真核表达载体中。此真核表达载体含有载体中。此真核表达载体含有T

10、AL的其它必需结构的其它必需结构域并在域并在C端融合有端融合有FokI序列。序列。v目前，目前，TALEN系统利用系统利用FokI的内切酶活性打断目的内切酶活性打断目标基因。因标基因。因FokI需形成需形成2聚体方能发挥活性，在实聚体方能发挥活性，在实际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔际操作中需在目标基因中选择两处相邻（间隔17碱基）的靶序列（碱基）的靶序列（14 - 18个碱基）分别进行个碱基）分别进行TAL识别模块构建。识别模块构建。将将TALENTALEN质粒对共转入细胞中可实现靶基因敲除。质粒对共转入细胞中可实现靶基因敲除。TALENTALEN质粒对共转入细胞后，质粒对共转入细胞

11、后，表达的融合蛋白，分别与靶位点特异结合，表达的融合蛋白，分别与靶位点特异结合， 由于两个由于两个TALENTALEN融合蛋白中的融合蛋白中的FokIFokI临近，临近， 形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切切DNADNA， 形成形成DSBDSB（Double-Strand BreaksDouble-Strand Breaks），诱发），诱发DNADNA损伤修复机制。细胞损伤修复机制。细胞可以通过非同源末端结合（可以通过非同源末端结合（NHEJNHEJ）修复）修复DNADNA， 在此修过程中或多或少地删除在此修过程中或多或少地删除或插入了一定数目的碱基，造成移码，形成目标基因敲除突变体。或插入了一定数目的碱基，造成移码，形成目标基因敲除突变体。建立生物模型。建立生物模型。在基因功能，代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要。基在基因功能，代谢途径等研究中模型生物的建立非常重要。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动而进行相关的研究。这些模型可以是细胞，也可以是完整的动植物或微生物个体。最常见的是小鼠、线虫、酵母，斑马鱼等植物或微生物个体。最常见的是小鼠、线虫、酵母，斑马鱼等的基因