携带绿色荧光蛋白人转化生长因子基因真核表达载体的构建

1、13第18卷第1期2005年1月医学研究生学报JournalofMedicalPostgraduatesVol.18No.1Jan.2005论著携带绿色荧光蛋白人转化生长因子基因真核表达载体的构建成俊1,史晓峰1,谢森2,唐礼功2,夏穗生1(11华中科技大学同济医学院器官移植研究所,湖北武汉430030;21广州军区武汉总医院泌尿外科,湖北武汉430070)摘要:目的:构建携带绿色荧光蛋白(GFP)人转化生长因子基因真核表达载体。方法:应用RT2PCR方法扩增人转化生长因子基因,与GFP真核表达载体连接,构建带有标记基因和人转化生长因子基因的真核表达载体,并用限制性内切酶酶切鉴定。结果:构建的

2、新质粒经酶切鉴定和DNA测序,证实新质粒的构建成功。结论:应用RT2PCR方法扩增目的DNA片段,简单快捷;双酶切定向克隆可以保证构建一步到位,免去正反向重组体筛选的问题。关键词:转化生长因子;绿色荧光蛋白;真核表达;载体中图分类号:Q782文献标识码:A文章编号:100828199(2005)0120013204Constructionofeukaryoticexpressionvectorcontaininggreenfluorescentproteinand1genehumantransforminggrowthfactor2CHENGJun1,SHIXiao2feng1,XIESen2

3、,TANGLi2gong2,XIASui2sheng1(11InstituteofOrganTransplantation,TongjiHospital,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,Hubei,China;21DepartmentofUrinarySurgery,WuhanGeneralHospitalofGuangzhouCommand,Wuhan430070,Hubei,China)Abstract:Objective:Toconstructaneukaryoticexpressionvectorcarringg

4、reenfluorescentproteinandhu2mantransforminggrowthfactor2forminggrowthfactor21gene.Methods:Humantrans1genewasamplifiedbyRT2PCR,linkagedwitheGFPeukaryoticexpressionvector,andthenidentifiedtherecombinantplasmidbyrestrictionenzyme.Results:Therecombinantplasmidcarriedhuman2TGF21andGFPgenebyrestrictionenz

5、ymecuttinganalysisandDNAsequenceanalysisweresucceeded.Conclusion:ItissimpletoamplifyaimgenebyRT2PCRinonestep.Theorientationclonecanassuretherecombinantinonestepandavoidscreeningobverse2inverserecombinant.Thenewkindofeukaryoticvectorcanserveasanewtoolandthemethodinthetransplantationarea.Keywords:Tran

6、sforminggrowthfactor2Greenfluorescentprotein;Eukaryoticexpression;Vector1;排斥反应或耐受的发生。T细胞在移植免疫起主导作用,免疫抑制性细胞因子转化生长因子(transform2inggrowthfactor21,TGF21)可抑制移植物的免疫损伤和耐受的形成1。此外,对供、受者间细胞迁移和0引言器官移植后会引起供受者间复杂的免疫应答,包括供受者免疫(非免疫)细胞的活化、迁移,可导致收稿日期:2004204214;修订日期:2004206204作者简介:成俊(19722),男,湖北道山人,医学博士,从事器官移植专业。14医

7、学研究生学报2005年1月第18卷增殖周期变化的研究,可有效了解供者免疫系统的变化,标记特定的细胞有助于研究移植排斥和耐受。因此,我们构建携带绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)人转化生长因子基因的真核表达载体,为器官移植的基因治疗和标记提供适合的载体系统。1材料和方法111材料和试剂DH5菌株购于天为时代公司;BamH限制性内切酶,HinD限制性内切酶,T4DNA连接酶购于宝生物公司(TakaraBiotechnologyCo.,Ltd);GFP表达载体由同济医院泌尿外科郭新医师惠赠;RNA抽提试剂盒购于上海华舜公司,RT2PCR试剂盒和PCR引物由上海生工

8、公司提供,其他均为国产试剂。112外周血单核细胞(PBMC)的收集和总RNA提取人抗凝血50ml,用淋巴细胞分离液梯度离心得到PBMC。采用酸性酚2硫氰酸胍2氯仿法提取细胞中的总RNA,异丙醇沉淀RNA,用去DEPC水溶解后紫外分光光度法定量,并于-70保存备用。113RT2PCR扩增人转化生长因子(hTGF21)cDNA根据文献2和Genbank提供的mRNA序列设计引物,primer1为oligo(dT),primer2正链引物52TAAGCTTACACCAGCCCTGTTCG23,其5端添加HinD酶切位点;primer3负链引物32ATTCCT2GTGGCACGGGGGATCCT25,

9、其5端添加BamH酶切位点。以primer1合成cDNA,primer2和primer3完成cDNA的扩增。逆转录反应:取总RNA3.0g,按下列浓度体积加入反应产物:10扩增缓冲液2l、20mmol/L四种dNTP混合液、引物oligo(dT)0.5g、RNase抑制剂20U、50mmol/LMgCl2、200U/l反转录酶,加水至总体积20l。3760min、7010min灭活,置-20保存备用。PCR扩增:逆转录产物1l,正义、反义引物20mol/L,dNTP150mol/L,Taq聚合酶2U,MgCl21.5mmol/L,10PCR缓冲液2.5l,余量用双蒸水补足25l。PCR扩增条件

10、:941min、632min、723min,共34个循环。RT2PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析。114目的片段和GFP真核表达载体双酶切与新质粒的构建RT2PCR产物和GFP真核表达载体经BamH和Hind双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳,目的条带1.2kbTGF21和4.7kbeGFP片段胶回收、纯化,按TGF21与载体eGFP摩尔数101的比例,加入25l的连接反应体系中,16连接过夜。取5l连接反应产物与等体积的DH5感受态细胞转化,转化后的DH5细胞接种于含卡那霉素(50mg/L)的LB平板中,37孵化过夜。115重组载体的筛选和鉴定选取上述LB平板中的单菌落接种于10ml含卡那霉素的L

11、B培养液摇菌过夜,采用SDS碱裂解法进行质粒的少量提取,经BamH和Hind双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。酶切产物含约1.2kb和4.7kb片段条带的即为阳性重组体克隆,并对其进行DNA人工测序,与Genbank提供的序列进行分析比较。2结果211总RNA提取结果收集PBMC,应用RNA抽提试剂盒一步法提取的RNA,其A260为1.771,A260/A280比值为1.884,RNA浓度为7.084g/l,总RNA纯度高。212RT2PCR结果应用设计带有酶切位点的引物,RT2PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳,产生一约1.2kb的DNA片段(1173bp),见图1。图1反转录聚合酶链反应扩增人T

12、GF21基因结果Figure1ResultsofamplificationhumanTGF21byRT2PCR第1、3泳道为DNA标记物;第2、4泳道为RT2PCR产物213TGF212eGFPDNA重组克隆的鉴定TGF21DNA和eGFP载体连接后,经卡那霉素筛选的阳性菌落,与等浓度的eGFP载体、空载体比较,其转化效率为5%。取10个单菌落进行质粒抽提,酶切电泳分析,有两个克隆菌落经BamH和Hind双酶切后产生1.2kb和约4.7kb的条带(图2)。第1期成俊,等携带绿色荧光蛋白人转化生长因子基因真核表达载体的构建15图2双酶切鉴定重组克隆TGF212cGFPDNAFigure2Eval

13、uationofrecombinationcloneplasmidbyrestrictionendonucleasedoubledigestion第8泳道为1kbDNA,第3泳道可见约1.2kb和4.7kb的条带,第7泳道为eGFP空载体质粒重组克隆DNA序列的测定结果与Genbank提供的序列是一致的,均为正向连接。重组质粒中hu2man2TGF21测序结果如下:3讨论人TGF21基因编码是一个含390个氨基酸的多肽分子,相对分子质量为44341。TGF21在第278个氨基酸位置断开形成二聚体,碳端形成一个112114个氨基酸的单体。在哺乳动物中TGF21高度保守,为重要的看家基因,不同哺乳

14、动物TGF21基因序列几乎100%相同。人和鼠TGF21蛋白的不同仅差一个氨基酸。TGF21通过细胞膜丝氨酸/苏氨酸激酶受体传导信号,在细胞分化中起重要的调节作用,在器官移植领域有重要作用和功能。在多种类型细胞(上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞、间质细胞)中,TGF21的中心作用是抑制细胞增殖4。在细胞周期中TGF21抑制细胞从G1期进入S期和G2期进入M期,其机制主要是诱导细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin2dependentkinases,CDK)抑制剂的产生,从而抑制CDK活化,使细胞正常周期受阻5。有研究表明,TGF21可诱导增强Kipp15INK4B、p16、p21waf1/Cip1、

15、p27kip1基因的表达;下调c2myc、cyclineA、cyclineD1、cyclineE、cdk2、cdk4和cdc25A基因的表达6,阻止细胞进入S期和M期。因此,TGF21是诱导耐受、下调宿主免疫应答的一种重要细胞因子。GFP产生荧光无需任何底物或辅助因子,并可耐受光漂白及甲醛固定。较传统的报告基因如b2半乳糖苷酶(Lacz)等有明显的优越性7。在器官移植领域中利用报告基因可动态观察不同来源的细胞(供者、受者或第三方)动力学和周期变化,细胞功能的改变。因此,构建同时带TGF21和eGFP基因的真核表达载体可同时起治疗(干预)和标记的功能。重组质粒表达融合蛋白,既避免了动物和细胞实验

16、过程不同质粒反复转导的麻烦和不便,又满足了研究的需求和方便。在构建重组质粒时,我们充分利用定向克隆的优势,在分析TGF21全长序列和eGFP载体图谱的基础上,在PCR引物上分别引入BamH(G2GATCC)和HinD(A2AGCTT)酶切位点。该两种内切酶酶切产生不同的3凸出末端,使目的基因和载体实现定向连接克隆,这种方法的优点有:外源DNA只以一个方向插入至重组质粒中,减少了正、反向连接的筛选问题;由于载体的两个突出末端不互补,因而载体片段不能环化,假阳性重组克隆少,多数为含目的基因的克隆转化菌;目的基因和载体连接处的限制性酶切位点常得以保留,便于进一步鉴定8。此外,在连接时,我们按TGF2

17、1与载体eGFP摩尔数101的比例进行连接,进一步减少载体自身环化的可能。构建的重组质粒经酶切鉴定和序列分析,证实TGF21序列和方向的正确,为下一步TGF21在器官移植中的治疗作用和对细胞影响的研究奠定了基础。参考文献:1QinL,ChavinKD,DingYetal.Genetransferfortransplantation:prolongationofallograftsurvivalwithtransforminggrowthfactor21J.16AnnSurg,1994,220(4):5082519.2医学研究生学报2005年1月第18卷cellcyclearrestJ.Gene

18、sDev,1994,8(1):9222.6DerynckR,JarrettJA,ChenEYetal.Humantransforminggrowthfactor2betacomplementaryDNAsequenceandexpressioninnormalandtransformedcellsJ.Nature,1985,316:7012705.RavitzMJ,WennerCE.Cyclin2dependentkinaseregulationduringG1phaseandcellcycleregulationbyTGF2b1J.AdvCancerRes,1997,71:1652207.3

19、4BarnardJA,LyonsRM,MosesHL.ThecellbiologyoftransforminggrowthfactorJ.BiochemBiophysActa,1990,1032(1):79287.7MisteliT,SpectorDL.ApplicationofthegreenfluorescentproteinincellbiologyandbiotechnologyJ.NatBiotechnol,1997,15(10):9612964.SpornMB,RobertsAB.Transforminggrowthfactor2beta:Recentprogressandnewc

20、hallengesJ.JCellBiol,1992,119(5):101721021.8黄培堂,王嘉玺,米厚础等译.JoeS,DavidR编.分子克隆试验指南M.第三版.北京:科学出版社,2002.8.5PolyakK,KatoJY,SolomonMJetal.p27Kip1,acyclin2Cdkin2hibitor,linkstransforminggrowthfactor2betaandcontactinhibitionto(责任编辑:鲁立;英文编辑:吴世宽)(上接第12页)法采用引入限制性内切酶位点或SOE、SDL拼接,不仅操作繁杂,而且有时还会影响解读三联密码的正确性。我们以非分泌型

21、内皮抑素质粒为模板,合成含信号肽的加长肽链(96bp)作为上游引物,用PCR的方法构建人分泌型内皮抑素质粒,所获645bp的内皮抑素基因片段,经与GenBank中人胶原cDNA和内皮抑素基因比较,基因序列基本一致。所克隆的内皮抑素基因序列的第537位氨基酸编码碱基由图3内皮抑素基因测序结果Figure3SequencingofsecretivehumanendostatingeneG突变为A,但编码的氨基酸都是精氨酸,属于沉默方框内为突变碱基突变型,不影响后续表达。本研究为应用人内皮抑素基因治疗肿瘤奠定了初步实验基础。参考文献:3讨论1OReillyMS,BoehmT,ShingYetal.E

22、ndostatin:AnendogenousinhabitorofangiogenesisandtumorgrowthJ.Cell,1997,88(2):2772285.肿瘤的生长和转移依赖于新生血管形成,抑制血管生成治疗可能是限制肿瘤生长和防止转移的有效策略,已成为近年来肿瘤治疗的研究热点。内皮抑素是一种强力内源性血管生成抑制因子,但内皮抑素蛋白本身不具有直接抑制肿瘤细胞生长的作用,它的靶细胞是血管内皮细胞,需要在表达后分泌至细胞外而发挥其抗血管生成活性。这就要求在内皮抑素蛋白的N末端连接一个分泌信号肽,作用是介导分泌蛋白到达细胞外,且不影响分泌蛋白的活性。国外进行表达所采用的分泌信号包括:与蛋白同源的分泌信号;与宿主表达细胞同源的分泌信号;机体内高效表达的分泌蛋白的分泌信号,如血清清蛋白和IgG的分泌信号5。本