妊娠滋养细胞疾病的实验研究进展

1、妊娠滋养细胞疾病的实验研究进展 妊娠滋养细胞疾病（gestational trophoblast disease，gtd）是一组严重危害育龄妇女健康的妇科疾病，其包括葡萄胎（hydatidiform mole，hm）、侵蚀性葡萄胎（invasive hydatidiform mole，ihm）、绒癌（choriocarcinoma，cca）和一类极为少见的胎盘部位滋养细胞肿瘤（placenta site trophoblastic tumor，pstt）。滋养细胞肿瘤（gestational trophoblastic tumor，gtt）系指gtd中除hm以外的全部病变1。我国是此类疾病的高

2、发国度之一。多年来学者们对该病从不同层面进行了多角度、大规模的研究。现将gtd实验研究的进展做一综述。 1 人绒毛膜促性腺激素与gtd 人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gondtrophin，hcg）是一种糖蛋白激素，也是目前公认的妊娠滋养细胞疾病（gtd）最重要的肿瘤标志物。其相关分子组成了hcg分子家族2。 业已证实3：正常妊娠或患gtd时，血液和尿中可出现多种形式的hcg及其降解代谢产物，合体滋养细胞可直接分泌非缺刻hcg（整分子hcg）、非缺刻游离hcg（f-hcg）和大分子游离亚单位。整分子hcg分泌后被与滋养细胞相关性巨噬细胞分泌的缺刻酶分解成缺刻hcg（nic

3、ked hcg，hcgn，指在p47与p48之间缺少肽键）由于hcgn不稳定，很快就被分解成为缺刻游离hcg和游离亚单位。缺刻游离hcg最终在肾脏被代谢为核心片段（hcgcf）。另外，非缺刻游离还可以由滋养细胞缓慢分泌或由非缺刻hcg代谢而来。在妊娠及gtd患者的血清中除了hcgcf的浓度极低外，其他各种分子类型的hcg在血中都有一定浓度。正常妊娠时血f-hcg的水平很低，约占hcg浓度的0.5%0.9%，患gtd时，由于非缺刻hcg的降解增强会导致f-hcg的比例异常升高，据报道其水平较正常妊娠时增加4100倍。因此，当血中测到高浓度f-hcg时则高度提示有滋养细胞疾病的存在。此外，f-hc

4、g还可用于葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒癌的鉴别。研究表明，f-hcg/总hcg的比值与gtd的类型有强相关性，主要与滋养细胞分化有关，其比值在葡萄胎最低，在绒癌最高。有研究证实4：在15个包括绒癌的肿瘤细胞系体外培养液中检测到核心片段（hcgcf）证明其可直接由肿瘤细胞产生。在葡萄胎清宫术后监测患者血中hcgcf的浓度能够早期预测恶性滋养细胞疾病的发生。 高糖基化hcg是hcg的一个相关分子，由未分化或低分化的细胞滋养层细胞分泌产生。与规则hcg相比，高糖基化hcg亚基上修饰的糖基比例显著增多，糖基分化质量更大，结构更为复杂。在妊娠初期、妊娠滋养细胞疾病中，细胞滋养层细胞是主要的滋养层细胞，相应的

5、高糖基化hcg水平分泌增多，揭示高糖基化hcg水平与早期妊娠的发展、滋养细胞疾病的发生发展有密切联系。高糖基化hcg具有特殊的侵袭性，在异位妊娠、down综合征、先兆子痫中也有异常分泌。 国内外关于hcg的测定方法很多，近年来主要为免疫测定方法，包括放射免疫测定法、免疫放射测定法和酶联免疫测定法。随着实验医学的进步，自动化和超速梯度离心法等技术的发展普及，用单克隆抗体进行免疫荧光标记的分光光度测定法已逐渐得到普及。这不仅使测定方法的灵敏度有了大幅度的提高，而且也大大提高了检测的特异性。目前的技术已可以测定hcg的不同亚单位。晚近研究发现：高糖化hcg（hyper-glycosylated hc

6、g）在gtt患者中含量极高5，它是绒癌细胞分泌的主要相关分子，其分子含有两个o键连接的寡糖侧链及1个大的n键连接的寡糖侧链，故又被称为侵蚀性滋养细胞抗原（invasive trophoblast antigen，ita）其对gtt的诊断具有独特的价值。另外，在唐氏妊娠（down pregnancy）时，ita的含量也有所增高，而正常妊娠时其血清含量则很低。因此，ita可作为鉴别正常与异常妊娠的重要指标，尤其对gtd的诊断具有独特的参考价值6。 2 端粒酶与gtd 端粒是位于染色体末端的一段富含c的重复dna序列，它在维持染色体稳定、调节细胞衰老和死亡中期重要的作用。正常情况下人类细胞中测不到端

7、粒酶（telomerase）的活性。在妊娠滋养细胞增殖和生长过程中，具有不同程度的端粒酶活性表达，研究证实在滋养细胞肿瘤的发生、发展过程中端粒酶起到重要的作用7。amezcua等8系统研究了端粒酶反转录酶（htert）的表达与持续性滋养细胞疾病的相关性。结果发现在持续性滋养细胞疾病患者中均可测出端粒酶活性及htert的表达，而在非持续性的葡萄胎患者中，htert表达率仅为54%。htert的表达与持续性滋养细胞疾病明显相关。此外，葡萄胎患者在清宫术后，如果葡萄胎组织不表达htert，则该患者100%不会发展成为持续性滋养细胞疾病。结果说明，检测葡萄胎患者葡萄胎组织中htert的表达，在判定患者

8、能否在清宫术后自发性消退方面有潜在的临床价值。研究表明9：在侵蚀性葡萄胎及绒癌组织中端粒酶的活性显著高于正常绒毛及葡萄胎组织从而被认为是葡萄胎早期诊断的重要生物学参数。 3 金属蛋白酶及其抑制物与gtd 金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，mmp）及其抑制物（tissue inhibitor of metalloproteinase，timp）对肿瘤的发生及转移起到重要的作用10。在滋养细胞转变为侵蚀性葡萄胎，进而转变为绒癌的过程中，必须多次溶解血管内皮基膜，mmp能降解基膜的iv型胶原，促进恶变及转移的发生。正常情况下mmp以酶原形式与timp结合，timp活性受到

9、抑制，故mmp的过度表达可作为预测葡萄胎恶变及早期诊断的重要指标之一。vegh研究发现：与正常胎盘及葡萄胎妊娠相比，绒癌细胞mmp-1及mmp-2表达明显增强，而timp的表达明显减弱。李志英等用反转录多聚酶链反应（rt-pcr）技术检测到22例正常早孕绒毛及37例葡萄胎组织中mmp-9、mmp-2、timp-1 mrna的表达量，结果显示：mmp-9/timp-1比值在发生恶变的葡萄胎组织中明显高于未发生恶变的葡萄胎组织，认为mmp-9、timp-1表达量的比值可作为葡萄胎恶变的一项监测指标11。 4 gtd的分子生物学研究进展 随着对人类疾病病因和发病机制研究的不断深入，学者们越来越认识到

10、绝大多数疾病，甚至所有疾病的发生发展都与患者的遗传背景或其改变有关，只有从基因水平去研究疾病，才能找到致病的根本原因，也才能对疾病进行最有效的防治。分子生物学技术的迅速发展，为gtd的研究奠定了坚实的基础。 4.1 葡萄胎的dna检测技术 pcr、流式细胞术、dna指纹图，southern blot northern blot、fish等新兴分子生物学技术在医学领域的应用，使gtd的研究已由细胞水平深入到分子水平12。遗传学研究证实13：葡萄胎作为一种病理生殖现象在遗传构成上有不同于其他肿瘤的特点;完全性葡萄胎（chm）其染色体dna完全来自于父源而无母源成分，是由于卵子发育异常所导致的染色体

11、丢失或失活所形成的“空卵”与一个正常精子（23x）受精后，核内dna复制加倍而成，或是染色体正常卵与双精子受精所形成的;前者称为纯合子（homozygte）葡萄胎，染色体核型为46，xx;后者称为杂合子（heterozygote）葡萄胎，染色体核型为46xy或46，xx；有学者认为：杂合子葡萄胎易发展为持续性葡萄胎或发生恶变14，另一类葡萄胎即部分性葡萄胎（phm）则含有父母双方的dna成分，其中父源dna为母源的2倍，认为是由于染色体正常的卵子与双精子受精所致，为三倍体，大多数核型为69，xxy或69，xxx。鼠配子移植试验成功地揭示了葡萄胎发生的机制15：将父源或母源早期生殖细胞核移植至不

12、含卵原核的卵细胞内，当受精卵染色体全部来源于母方时，胚鼠可发育成25个中胚叶节阶段，但无滋养细胞生长。而当受精卵染色体全部来源于父方时，其滋养细胞增生活跃。研究证实：父源性基因成分对控制滋养细胞增生是十分重要的，完全性葡萄胎与部分性葡萄胎均可表现为过多的父源性染色体，以致促使滋养细胞的超常增生。 20世纪90年代后期，更为精细的第二代微卫星dna分析技术问世，该技术可对微卫星dna序列进行检测、分析。能够迅速、准确地判定葡萄胎的来源16，短串联重复序列（short tandom repeat，str）亦称微卫星dna（microsatellite dna），其广泛分布于人类整个基因组中，约占1

13、0%左右。其基本构成单位-核心序列16bp，呈串联重复排列而成。按核心序列碱基数不同可分别称为单、二、三、四、五、六-核苷酸。其中以（ca/gt）n简称（ca）n重复序列最多，平均每660bp的dna就存在一个（ca）n，重复次数约1516次。这类基因顺序多位于基因非编码区以及染色体的近端粒区，其高度多态性主要来源于串联重复的数目不同。与其他dna多态标记一样，微卫星dna也呈孟德尔共显性方式遗传。 迄今，此类技术已广泛应用于肿瘤分子遗传学研究领域，有学者报道17应用pcr-微卫星多态分析方法鉴定葡萄胎dna的来源，探讨其遗传构成及其与gtd发生、发展之间的关系。 4.2 基因芯片技术 基因芯

14、片（gene chip）又称dna芯片或cdna微阵列（cdna microarry）技术，它是一项划时代意义的生物技术，它综合了分子生物学、免疫学、生物物理化学、微电子技术等学科的最新技术，具有对生物分子快速处理的能力。其具备了信息量大、处理速度快、所需样本量小、污染少等优点。迄今，此项技术已在妇科肿瘤的研究中得到应用18。 国内学者19应用基因芯片技术，发现复制因子c（replication factor c，rfc）在葡萄胎组织和绒癌中表达水平显著高于正常胎盘组织和绒毛细胞。结合免疫组化sp法检测正常绒毛、葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒癌组织中rfc2和pcna（增殖细胞核抗原）蛋白的表达情况

15、结果：葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒癌组织中rfc2和pcna蛋白表达水平显著高于正常绒毛，葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒癌组织中rfc2的表达水平差异无显著性。pcna与rfc2的表达呈正相关，rfc和pcna的过度表达可能与滋养细胞肿瘤的生物学行为有关。 5 gtd与分子免疫学研究 人体的免疫系统是由中枢淋巴器官、外周淋巴器官、免疫细胞和免疫分子组成。免疫应答过程依赖于免疫系统中细胞间的相互作用。其包括细胞间直接接触和通过释放细胞因子或其他介质的相互作用。 t淋巴细胞亚群中的cd3+代表全部t淋巴细胞;cd4+则代表辅助性t细胞亚群（ts），它能诱导b细胞产生抗体、协助细胞毒性t细胞（cytotoxi

16、c t cell，ctl）和巨噬细胞发挥免疫功能;cd8+代表细胞毒性t细胞和抑制性t细胞（th），在机体抗肿瘤免疫中发挥重要的作用。cd4+/cd8+比值在一定程度上可以间接反映机体细胞免疫的状态20。近年来免疫与滋养细胞肿瘤的关系已受到人们的关注。 滋养细胞能分泌多种细胞因子，分子水平的研究结果表明：滋养细胞具有广泛的免疫调节作用21。 细胞因子（cytokine，ck）泛指由任何细胞（包括肿瘤细胞）产生和分泌的能调节细胞生长分化，调节免疫功能的小分子多肽的统称。细胞因子基因可通过激活免疫细胞、诱导细胞因子，以调节增强机体固有的免疫功能和抗病能力，并具有一定程度的直接抑制肿瘤的效应。在妊娠

17、情况下，胎盘滋养细胞可分泌多种细胞因子，如il-1、il-6、il-10、tnf-、vegf、egfr等。 综上所述，经过学者们多年的不懈努力。gtd的研究已取得了可喜的进展，肿瘤标志物在gtd的发生发展、诊断、治疗与随访监测中占有十分重要的地位。这些标志物有选择性地联合检测并结合临床、病理、影像学检查，可帮助临床医师提高对滋养细胞肿瘤诊断的准确性与正确选择合理治疗方案，从而进一步提高滋养细胞肿瘤的治疗效果。 参考文献 1 zimmermann d，baier j，alexande h，et al.expression of beta hcg and alpha cg mrna and hcg

18、 hormone in human decidual tissue in patients during pregnancy.mol hum reprod，2005，9（2）：81-89. 2 amezcua ca，bahador a，naiclu ym，et al.expression of human telomerase revese transcriptase，the catalytic subunit of telomerase，is associated with the development of persitent disease in complete hydatidifo

19、rm moles.am j obstet gyneconl，2004，184（7）：1441-1446. 3 lehner r，bobak jkim nw，et al.lacalization of telomerase htert protein and survivin in placenta：relation to placental development and hydatidiform mole.obstet genecol，2001，97（6）：965-970. 4 roh cr，oh wj，yoon bk，et al.up regulation of martrix metal

20、loproteinase-9 in human myometrium during labour：a cytokine mediated process in uttering smooth muscle cell.mol hum reprod，2004，6（1）：96-102. 5 xu p，wang y，bai s，et al.effects of matrix protein on the expression of matrix metalloproteinase-2，-9，and -14 and tissue inhibitors of metalloproteinases in h

21、uman cytotrophoblast cells during the first trimester.biol reprod，2001，65 （1）：240-246. 6 lai cy，chan ky，khoo us，et al.analysis of gestational trophoblastic disease by genotyping and chromosome in situ hybridization.mod pathol，2004，17（1）：40-48. 7 rustin gj.trophoblastic disease.in：shaw rw，soutter wp，

22、stanton sl.gynaecology，2nd ed.london：churchill livingstone，1997，605-614. 8 cheung an，khoo us，lai cy，et al.metastatic trophoblastic disease after an initial diagnosis of partial hydatidiform mole：genotyping and chromosome in situ hybridization analysis.cancer，2004，100（7）：1411-1417. 9 frank w，ling por

23、tri ck-duff.obstetrics & gynecology principales for practice.mcgraw hill，2001，1315-1317. 10 bell ka，van deerlin v，addya k，et al.molecular genetic testing from paraffinembedded tissue distinguishes non molar hydropic abortion from hydatidiform mole.mol diagn，1999，4（1）：11-18. 11 郝冬梅，张宁，鲁海鸥，等.应用微卫星多态性鉴

24、定葡萄胎基因来源.中国优生与遗传杂志，2003，10（3）：22. 12 lobenhofer ek，bushel pr，afshari ca，et al.progress in the application of dna microarrays.envion health perspect，2003，109：881-891. 13 byster km，boles al，brannian jd，et al.dna microarray analysis of gene expression markers of endometriosis.fertil steril，2002，77：38-42. 14 陈慰峰.医学免疫学，第2版.北京：人民卫生出版社，2005，100-101. 15 刘艳.妇科恶