分子生物学-聚合酶链反应(PCR)

1、2021年8月11日星期三1 Polymerase chain reaction 2021年8月11日星期三2 聚合酶 链反应（polymerase chain reaction），简称PCR技术，是近年来 发展起来的一种选择性体外扩增DNA 或RNA片段的方法。 PCR特点：操作简单；扩增速度快， 可在数小时内使DNA或RNA片段放大 百万倍。 PCR应用：PCR技术已渗透到分子 生物学的各处领域，在分子克隆、遗传 病的基因诊断、法医学等方面得到了广 泛应用。 2021年8月11日星期三3 PCR的基本原理 细胞中的DNA复制是一个复杂 的过程。参与复制的因素有多种。 PCR是在试管中进行的

2、DNA复制反应 （在体外模拟DNA复制反应），基本 原理与细胞内DNA复制相似，但反应 体系相对较简单。 2021年8月11日星期三4 2021年8月11日星期三5 PCR PCR 循环循环 第一步第一步 加热变性加热变性 靶序列 靶序列 2021年8月11日星期三6 PCR PCR 循环循环- - 第二步第二步 引物与靶序列退火引物与靶序列退火 靶序列 靶序列 Primer 1 Primer 2 Biotin Biotin 5 3 5 5 3 5 3 3 2021年8月11日星期三7 PCR PCR 循环循环 - - 第三步第三步 - - 引物延伸引物延伸 靶序列 靶序列 Primer 1

3、Primer 2 Biotin Biotin 5 3 5 5 3 5 3 3 Taq DNA Polymerase 2021年8月11日星期三8 第第1 1个个 PCR PCR 循环完成后循环完成后 得到两个拷贝的靶序列得到两个拷贝的靶序列 靶序列 靶序列 Biotin Biotin 2021年8月11日星期三9 3030次循环后靶序列扩增的数量次循环后靶序列扩增的数量 No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target 12 24 38 416 532 664 201,048,576 301,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2

4、 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon 2021年8月11日星期三10 2021年8月11日星期三11 PCR扩增过程图示扩增过程图示 2021年8月11日星期三12 典型PCR反应体系 复制模板 耐热DNA聚合酶 引物 缓冲体系 底物 2021年8月11日星期三13 DNA的合成，无论是在 体内，还是在体外，都是在 DNA聚合酶的作用下，在模 板的指导下合成的。在PCR 反应

5、中的模板，指的是待扩 增的DNA片段。 2021年8月11日星期三14 模板DNA：模板可以是基因组DNA、质粒 DNA、扩增后的DNA或cDNA等，RNA的扩 增需要首先反转录成cDNA后才能进行正常 PCR循环。含有靶序列的DNA可以单链或双 链形式加入PCR混合液。通常小片段模板 DNA的PCR效率要高于大分子DNA，因此 PCR反应前用机械剪切或用稀有限制酶酶解 基因组DNA，以提高产量。PCR反应中模板 加入量一般为102105拷贝。1g人基因组 DNA相当于3105个单拷贝的靶分子；10ng 酵母DNA相当于3105 靶分子；1ng大肠杆 菌DNA相当于3105 靶分子。 2021

6、年8月11日星期三15 耐热DNA聚合酶包括 TaqDNA聚 合酶、TthDNA聚合酶、VENTDNA聚 合酶和SacDNA聚合酶。其中TaqDNA 聚合酶应用最广泛。 TaqDNA聚合酶 在92.5、95 和97.5 时半衰期分 别为40分钟、30分钟和56分钟，故 PCR反应中变性温度不宜高于95 。 Taq DNA聚合酶最适温度是72 ，较 高温度下的DNA合成错误率较低。因 此，一次加酶可满足PCR反应全过程的 需要，使PCR走向自动化。 2021年8月11日星期三16 DNA聚合酶只能从3OH延长 DNA，而不能从头合成DNA，必须有 一个引物引发DNA的合成。因此，选 择合适的引物

7、是PCR成功的关键。 引物设计的基本要求（原则）： （1）引物长度一般为1530个核苷酸。 引物过短会影响PCR的特异性，引物过 长会提高相应的退火温度并使延伸温度 超过TaqDNA聚合酶的最适温度，也会 影响产物生成。 2021年8月11日星期三17 （2）引物中的碱基组成尽可能随机分布， 避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。尤 其是引物的3端不应有连续3个G和C。 使引物在模板的G+C富集序列区错误配 对。G+C含量在引物碱基中一般占 40%60%。设计引物时要考虑3端和 5端具有相似的Tm值，按引物的碱基 组成计算Tm值的公式为： Tm值=4（G+C）+2（A+T） 2021年8月11日星期

8、三18 （3）引物自身不应存在互补序列以 避免折叠成发夹结构。按经验，引物 自身存在的连续互补序列，一般不超 过3bp。 （4）两个引物之间不应存在互补序 列，尤其应避免3端的互补重叠。 （5）引物与非特异扩增区的序列的 同源性不要超过70%，引物3末端 连续8个碱基在待扩增区以外不能有 完全互补序列，否则易导致非特异性 扩增。 2021年8月11日星期三19 （6）引物3端碱基是引发延伸的起 点，因此一定要与模板DNA配对。引 物3端最佳碱基选择是G和C。因为 它们形成的碱基配对比较稳定。 （7）引物浓度，引物的浓度一般为 0.10.5mol/L，引物浓度偏高会引 起错配和非特异性产物扩增。

9、 2021年8月11日星期三20 引物3端错配对扩增产物的影 响是有一定规律的。在标准反应体系 中用2U TaqDNA聚合酶和 200mol/LdNTP,以质粒（103个拷 贝）为模板，按95 ，25秒；55 ， 25秒；72 ，1分钟的循环参数扩增 HIV-1 gag区时，引物3端错配对扩 增效率的影响为： 2021年8月11日星期三21 引物3端错配对扩增效率的影响 5 2021年8月11日星期三22 PCR反应的缓冲体系：PCR的缓冲液一般 制成10，含有：500mmol/LKCl; 100mmol/LTris-HCl(pH8.3);15mmol/L MgCl2;0.1%明胶。 使用时稀

10、释10倍。其中Tris-HCl可维持 反应体系的pH， KCl有利于引物的复性， 但浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性， 明胶可保护酶不变性失活，Taq酶需要Mg2+， 它会影响反应的特异性和扩增DNA的产率， 因此要将Mg 2+浓度调至最佳。 2021年8月11日星期三23 延伸温度与时间： Taq DNA聚合酶的生物学活性：聚合酶的生物学活性： 7080 150核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 70 60核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 55 24核苷酸核苷酸/S/酶分子酶分子 高于高于90时，时，DNA合成几乎不能进行合成几乎不能进行 2021年8月11日星期三24 延伸温度与时间： 延

11、伸温度：一般选择在延伸温度：一般选择在70707575之间之间 常用温度为常用温度为7272 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb1Kb以内的以内的DNADNA片段，延伸时间片段，延伸时间1min1min（足够）（足够） 3 34kb4kb的靶序列需的靶序列需3 34min4min 扩增扩增10Kb10Kb需延伸至需延伸至15min15min 延伸进间过长会导致非特异性扩增延伸进间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长

12、些 2021年8月11日星期三25 底物：dNTP常用的浓度为 20200mol/L，而且4种dNTP的终浓 度相等。 dNTP浓度过高虽可加快反应 速度，但会增加碱基的错误掺入率，适 当的低浓度会提高反应的精确度。另外， dNTP是磷酸根的来源，会与Mg2+结合， 也应注意协调Mg2+浓度和dNTP浓度之 间的关系。 2021年8月11日星期三26 PCR温度循环参数： PCR反应中，变性温度一般为9095 。 变性所需的时间取决于DNA的复杂性，多 用94 30秒对模板DNA进行变性，过高的 温度及过长的时间会降低Taq酶的活性。引 物的退火温度通过Tm=4（G+C）+2 （A+T）计算得

13、到，一般5580 30秒。 延伸温度选在7075 之间，此时Taq酶 的活性最高。延伸反应的时间根据扩增片 段的长度而定，一般1kb以内延伸一分钟， 更长的片段需相应延长时间。PCR的循环次 数取决于模板DNA的浓度一般2030次。 2021年8月11日星期三27 PCR实验中应注意的事项： 由于PCR反应具有极强的扩增能力和检 测的灵敏性，微量的样品污染便有可能导致 假阳性结果的出现。为此在实验操作中应谨 防污染的发生，并设置严格的对照，以提高 PCR结果的正确性。常采用的措施有（1） 隔离不同操作区，包括样品制备区；PCR操 作区；反应产物分析区等；（2）对于所用 试剂必须分装，以减少重复

14、取样所致的污染； （3）采用一次性吸头和加样器进行PCR取 样和加样操作，样品制备应严格按无菌操作 原则进行。 2021年8月11日星期三28 为防止PCR过程中出现假阳性，应设 置以下几个对照： （1）阳性对照：阳性DNA模板参与的 PCR反应； （2）阴性对照：阴性DNA模板参与 的PCR反应； （3）试剂对照：不含任何DNA模板， 但具有所有反应试剂的PCR反应。 2021年8月11日星期三29 PCR循环次数与产物的积累： 从变性、退火到延伸一次称为一个 循环，每循环一次产物增加一倍，即以 指数增长。理论上讲，循环次数越多， 产物积累越多。但PCR反应是在酶的作 用下完成的，随着产物的

15、增加，引物和 底物的消耗，使酶促反应越来越慢，达 到所谓的平台期。 2021年8月11日星期三30 PCR 技术的主要类型 筑巢PCR（nested-primer PCR） 共享引物PCR(shared primer PCR) 多重PCR（multiple PCR） 不对称PCR（asymmetric PCR） 锚定PCR（anchored PCR） 反向PCR（inverted PCR） 彩色PCR（color complementation assay） 原位PCR（in situ PCR） 定量PCR（quantified PCR） 差异显示PCR（differential displa

16、y PCR） 重组PCR（recombinant PCR） P C R 技 术 的 类 型 2021年8月11日星期三31 筑巢PCR用两对引物进行扩增。第一对引 物（外引物），扩增含目的基因的大片段，再 用第二对引物（内引物）以扩增的大片段为模 板进行扩增的方式，称筑巢PCR。 进行筑巢PCR时，外引物设计得比内引物 长一些，且用量较少，采用较高退火温度使内 引物不能与模板结合，故只有外引物扩增。待 外引物用尽后，降低退火温度即可直接进行内 引物的扩增。 筑 巢 PCR 特点：筑巢PCR扩增时，对目的DNA的特异性 高且适合于极少量模板的扩增。 2021年8月11日星期三32 53 35 5

17、3 35 53 35 35 35 35 35 53 53 53 53 53 53 53 53 35 35 35 35 2021年8月11日星期三33 共 享 引 物 PCR 共享引物 PCR 利用3条引 物扩增两种不同的 DNA 序列， 其中一条引物与两种待扩增序 列都互补，与另两条引物共同 组成两对引物。这种PCR方法 常用于细菌学鉴定，确定同一 种属细菌的不同种类。 2021年8月11日星期三34 多 重 PCR 多重PCR是在一次反应中加入多对 引物，同时扩增一份模板样品中不同序 列的PCR过程。扩增时，不同引物扩增 模板的不同片段，得到的产物为模板不 同部位、不同长短的混合片段。因此，

18、 多重PCR适用于基因片段缺失、突变的 检测。PCR后，进行电泳图谱分析，即 可找出缺失或突变的片段。back 2021年8月11日星期三35 不 对 称 PCR 不对称PCR是一种快速制备单 链DNA的技术。目前DNA测序时， DNA样品常用这种方法制备。 不对称扩增时，两条引物链的 比例相着较大，当较少的引物用尽 后，再进行扩增时，所得到的扩增 产物，全部为单链DNA产物。 2021年8月11日星期三36 back 2021年8月11日星期三37 锚 定 PCR 一般的PCR反应，必须知道模板两侧的序 列，以便设计引物。但在许多情况下，对模 板两侧的序列并不清楚。对这样的模板进行 扩增时，

19、可用锚定PCR技术。这一技术经常 用于未知cDNA的制备或低丰度cDNA文库的 构建，而不适合于基因级DNA的扩增。其原 理为，在一通用引物反转录产生的第一条 cDNA3加上同聚物尾（polyG），再用锚 定引物（polyC）和通用引物进行cDNA的扩 增。 2021年8月11日星期三38 back 2021年8月11日星期三39 反 向 PCR 模板上某一序列是已知的，但我 们想扩增其两侧的片段，这种情况 在PCR反应中也会遇到，反向PCR 就可以解决这一问题。其方法是， 用合适的限制酶对基因组DNA进行 消化，切除多余DNA后以已知序列 DNA片段为核心进行环化，然后再 对其进行扩增。 2

20、021年8月11日星期三40 back 2021年8月11日星期三41 彩 色 PCR 在进行PCR反应时，将各种 荧光物质对引物5端进行标记， 扩增后的产物带有不同色彩的荧 光染料，在激发灯的照射下可以 发出不同的色彩。本法更适合于 多重PCR对DNA突变或缺失，以 及遗传性疾病的基因基因诊断 2021年8月11日星期三42 原 位 PCR 原位PCR是近年来发展起来的一种 新型PCR技术，是PCR技术和常规的原 位杂交技术的结合，通过PCR技术对靶 序列在染色体上或组织细胞内进行原位 扩增，使其拷贝数大增，然后通过原位 杂交方法检测，从而对靶核酸进行定性 定位定量分析。原位PCR具有PCR

21、的快 速、灵敏、特异性强和原位杂交的定位 精确的特点。 2021年8月11日星期三43 原 位 PCR 原位PCR的流程大致为： （1）染色体、细胞及组织切片样品的制备。 此阶段中固定很重要，10%福尔马林、4%的 多聚甲醛溶液和酒精为常用固定剂； （2）PCR前处理：包括石蜡切片、去石蜡、 染色体变性和细胞穿透； （3）PCR扩增； （4）原位杂交及检测。 2021年8月11日星期三44 原 位 PCR 原位PCR按检测方法不同分为直接原 位PCR和间接原位 PCR，间接原位PCR 是在 PCR结束后，利用探针来探测专一 性扩增序列， 特异性较高； 直接原位 PCR是在 P C R中直接掺入

22、标记核苷酸， PCR 结束后不必进行原位杂交而直接检 测。该方法具有快速、简便的特点，但 专一性往往不够，容易产生假象，尤其 在组织切片上进行原位PCR。 2021年8月11日星期三45 定 量 PCR 是利用PCR定量检测标本中靶基因 的拷贝数的技术，这在研究基因的扩增 等方面具有重要意义。该法是将目的基 因和一个单拷贝的参照基因置于同一个 试管中进行PCR扩增，电泳分离扩增产 物后呈两条区带。比较两条区带的丰度 或在引物5端标记上放射性核素后， 通过检测两条区带放射性强度即可测出 目的基因的拷贝数。 2021年8月11日星期三46 定 量 PCR 定量方法有几种，最直接的是测定 PCR产物

23、中的标记核苷酸或引物量，但 使用标记核苷酸会造成凝胶电泳时高背 景，给测定带来困难。而标记引物法会 产生引物二聚体和非特异性扩增，直接 测定有时会产生假阳性结果。目前常用 的是杂交技术，其中最常用的是同位素 标记探针对PCR产物进行Southern杂交， 然后对其放射活性进行测定。 2021年8月11日星期三47 PCR反应比较灵敏，不少因素都会 对结果产生影响。因此，在定量PCR 时，要设内参照。参照基因与待测基 因在同一反应试管内进行PCR扩增， 目的基因和内参照基因的PCR产物在 凝胶电泳上分开，起到校正作用。 内参照有两种：一种是内源性的， 此基因在许多细胞中都表达，且水平 较恒定；另

24、一种是外源性的，是人工 合成的RNA或DNA，正常情况下不存 在于待测样品中。 2021年8月11日星期三48 差 异 显 示 PCR 高等生物一般具有105个基因，但每个 细胞或个体仅表达其中15%的基因，即约 15000种mRNA，不同细胞间基因表达的差 异决定了生命活动的多样性，如发育和分化、 内环境稳定、细胞周期调节、衰老和死亡等。 正常的代谢过程或病理变化，不管是由单基 因控制还是由多基因体系控制，本质上都是 基因表达改变所致。因此，比较研究细胞间 基因表达的差异为我们揭示生命活动的规律 提供了依据。 2021年8月11日星期三49 差异显示PCR就是一种筛选和克隆受发 育、突变各种

25、因素影响下差异表达基因的方法。 首先将所要比较的两种mRNA样品逆转录生成 cDNA第一链，然后利用3锚定引物和5随 机引物进行PCR反应。 一个理想的显示技术应具备两个最基本的 条件： （1）重复性好； （2）便于分离与鉴定。 2021年8月11日星期三50 为了体现上述两个基本条件，合成两组引物， 通过随机组合，使15000种mRNA均有扩增机会，并 显示出清楚的电泳带。利用真核生物mRNA都有3 端的poly(A)，而在poly(A)前面的两个碱基只有倒数 第二位可为A，即：AAAAAAAAAAAAAAAAAA 的特点，把 mRNA3端引物设计成T12MN（M）不 能为T，共有12种引物

26、，分别对总RNA进行反转录， 把mRNA分成12等份，每份将获得1/12的cDNA亚群。 再用随机引物对cDNA亚群进行PCR扩增，得到能在 测序胶上分辨的条带，电泳后可以发现细胞群体中 有差异的cDNA片段，这此有差异的片段就是差异表 达基因的cDNA。 2021年8月11日星期三51 完 整 工 作 程 序 2021年8月11日星期三52 重 组 PCR 通过设计两对部分重叠引物，将两 个基因分别进行PCR扩增。混合两种 PCR扩增产物，经变性和复性，两组 PCR产物通过互补序列发生粘连，其中 一条重组杂合链可在PCR条件下发生延 伸反应产生睛个包含两个不同基因的重 组基因 用重组PCR技

27、术进行基因融合可组 建天然基因、合成基因及突变基因等。 2021年8月11日星期三53 重 组 PCR 方 法 示 意 图 5 2021年8月11日星期三54 PCR 扩增产物的分析 凝胶电泳分析法：PCR产物可通过 琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳 检测，后者灵敏度远高于前者，但 配制方法复杂，故常用前者。在配 制琼脂糖时加入0.5g/ml的溴化乙 锭（EB）或电泳后凝胶用同样浓度 的 EB 染色 20min，去离子水漂洗 两次，每次15min，于UV灯下观察 结果。 2021年8月11日星期三55 PCR扩增产物的电泳分析 琼脂糖凝胶电泳 常用于临床检测（定性） 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离效果

28、比琼脂糖好，条带比较集中 可用于科研及检测分析 2021年8月11日星期三56 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常 用的分离纯化和鉴定核酸的方法 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物 根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和 低熔点琼脂糖 低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在37 下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段 的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等 2021年8月11日星期三57 凝胶浓度选择 琼脂糖浓度琼脂糖浓度(%)线型线型DNA分子的分离范围分子的分离范围(Kb) 0.3560 0.6120 0.70.810 0.90.57 1.20.96 1.50.

29、23 12.00.12 琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围 2021年8月11日星期三58 电泳缓冲液 常用三种缓冲液 Tris-硼酸（TBE） Tris-乙酸（TAE） Tris-磷酸（TPE） TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好， 但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高， 容易使DNA沉淀 TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而 推荐选用TAE。缓冲液中的 EDTA 可螯合二 价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止 PCR扩增产物降解 2021年8月11日星期三59 10TBE缓冲液的配制 配方 Tris 108克 EDTA 9.3克 硼酸 55克 H2O至 1000ml pH应

30、为8.08.2 临用时用水稀至0.5TBE（20倍稀释） 2021年8月11日星期三60 核酸电泳的指示剂 指示剂： 溴酚兰 二甲苯青 溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色 电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性DNA 片段 琼脂糖凝琼脂糖凝 胶浓度胶浓度 0.6%1%1.4%2% 迁移率迁移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb 2021年8月11日星期三61 核酸电泳的指示剂 二甲苯青：水溶液呈兰色， 电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大 致相当 琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度 1%1.4% 迁移率迁移率 2Kb1.6Kb 2021年8月11日星期三62 载样缓冲液 指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖 40

31、0组成载样缓冲液 作用： 增加样品密度，使其比重增加，以 确保DNA均匀沉入加样孔内 在电泳中形成肉眼可见的指 示带，可预测核酸电泳的速度和位置 使样品呈色，使加样操作更方便 2021年8月11日星期三63 核酸电泳的染色剂 最常用的染色剂 溴化乙锭 银染色 2021年8月11日星期三64 核酸电泳的染色剂 溴化乙锭（ethidium bromide，EB） 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱 基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光 可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB， 有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中 染色1015min 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳

32、带，其 DNA量一般5ng 溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不 清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察 2021年8月11日星期三65 核酸电泳的染色剂 银染色：银染色液中的银离子(Ag+)可与核 酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色 黑褐色 主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于 琼脂糖凝胶染色 灵敏度比EB高200倍，但银染色后，DNA不 宜回收 2021年8月11日星期三66 电泳 电泳装置 电泳仪 电泳槽 灌胶模具等 2021年8月11日星期三67 电泳槽电泳槽 水平平板水平平板 垂直平板垂直平板 2021年8月11日星期三6

33、8 2021年8月11日星期三69 2021年8月11日星期三70 2021年8月11日星期三71 电泳方法 用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在 水平桌面上，并架好梳子 根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼 脂糖凝胶，一般 200400 bp 的DNA片段 （可配制1.21.7%） 2021年8月11日星期三72 电泳方法 配制琼脂糖凝胶及倒胶 0.5TBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中， 称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微 波炉内加热熔化，冷却至60(需要时可加 入EB)，倒入电泳槽中，待凝固 向电泳槽中倒入0.5 TBE，其量以没过胶 面2mm为宜，小心移去梳子（如样品孔内 有气泡，

34、应除去） 2021年8月11日星期三73 2021年8月11日星期三74 电泳方法 上样与通电 在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混 匀后，加入样品孔内 接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切 记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔 的一端为负），电压为1 5V/cm（长度以 两个电极之间的距离计算） 根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳， 一般 200400bp 的PCR产物50V电压，电泳 2040min 2021年8月11日星期三75 电泳方法 结果观察 紫外仪上观察电泳带及其位置 并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小 2021年8月11日星期三76 聚丙烯酰胺凝胶电泳 适

35、宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的 DNA片段和DNA序列分析 其装载的样品量大，回收DNA纯度高，长 度仅相差0.2%（即500bp中的1bp）的核苷酸 分子即能分离 2021年8月11日星期三77 聚丙烯酰胺凝胶 由丙烯酰胺单体，在催化剂TEMED（N，N， N，N一四甲基乙二胺）和过硫酸铵的作用 下，丙烯酰胺聚合形成长链，聚丙烯酰胺 链在交联剂，N，N一亚甲双丙烯酰胺参与 下，聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成 凝胶 聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺 的浓度决定的 2021年8月11日星期三78 不同浓度丙烯酰胺和DNA有效分离范围 丙烯酰胺丙烯酰胺 （%） 有效分离范围有效分离范

36、围 （bp） 溴酚兰溴酚兰*二甲苯青二甲苯青* 3.51002000100460 5.08050065260 8.06040045160 12.0402003070 15.0251501560 20.0101001245 2021年8月11日星期三79 材料 电泳仪器： 电泳仪 垂直电泳槽及其附件. 30%丙烯酰胺 丙烯酰胺，29克 N，N一亚甲基双丙烯酰胺，1克 H2O，加至100ml 装于棕色瓶内，4可保存二个月 2021年8月11日星期三80 材料 10%过硫酸铵 过硫酰铵，1克，加水至 10 ml 4可保存一周，-20可保存一个月 1TBE电泳缓冲液 TEMED（四甲基乙烯基二胺） 2

37、021年8月11日星期三81 聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 配胶：根据分离DNA片段的大小及需凝胶 的容积，配制聚丙烯酰胺凝胶 按要求装配好垂直电泳板，两块玻璃板的两 侧及底部用1%的琼脂糖封边，防止封闭不 严而使聚丙烯酰胺液漏出 将装好的玻璃电泳板倾斜成4560角 按表3配制所需%浓度凝胶的毫升数 加入TEMED后，立即混匀，缓缓倒入两玻 璃板间的胶床中，直到液体接近溢出时为止 2021年8月11日星期三82 聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 立即插入适当的梳子，密切注意防止梳齿 下产生气泡，用一有力 的夹将梳子夹在一边的玻璃板上，然后将 玻璃板斜靠在物体上，使成10角，可减 少液体泄漏的机会 室温

38、聚合一小时后，将玻璃板插入电泳槽 中，上紧，倒入0.1TBE缓冲液 2021年8月11日星期三83 聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 小心取出梳子，立即用缓冲液冲洗加样孔， 因为梳子取出后，梳子上吸附的及凝胶顶部 未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合，产 生不规则的表面，将导致以后DNA电泳带型 不规则 将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后，加 到样品孔内，加样时不要产生气泡 2021年8月11日星期三84 聚丙烯酰胺凝胶的制备与电泳 接好电极，电压为1-8V/cm，进行电泳 电泳毕，切断电源，取出胶床板，小心移去 一块玻璃板，让凝胶吸附在另一块玻璃板上， 浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶液中，15

39、 30min后取出水洗，紫外仪下观察结果 聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出10ng以上量 的DNA条带（要求更高的灵敏度，可用银 染） 2021年8月11日星期三85 2021年8月11日星期三86 2021年8月11日星期三87 酶切分析 根据PCR产物中限制性内切酶的位点， 用相应的酶进行酶切 酶切产物电泳分离后，获得符合理论的 片段 此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基 因分型，还能进行变异性研究 2021年8月11日星期三88 分子杂交 检测PCR产物特异性的有力证据 检测PCR 产物碱基突变的有效方法 主要的杂交 Southern印迹杂交 斑点杂交 2021年8月11日星期三89 South

40、ern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链 并作标记（探针） 与 PCR 产物杂交 此法既可作特异性鉴定，又可以提高 检测 PCR产物的灵敏度，还可知其分 子量及条带形状，主要用于科研。 2021年8月11日星期三90 2021年8月11日星期三91 2021年8月11日星期三92 2021年8月11日星期三93 斑点杂交： 将PCR 产物点在硝酸纤维素膜或尼龙 膜薄膜上 寡核苷酸探针杂交 观察有无着色斑点 主要用于 PCR产物特异性鉴定及变异 分析 2021年8月11日星期三94 2021年8月11日星期三95 2021年8月11日星期三96 2021年8月11日星期三97 2021

41、年8月11日星期三98 PCR 扩增产物的分析 斑点杂交分析法：将PCR扩增产物固定于 硝酸纤维素滤膜上，再用放射性或非放射 性标记物标记的与产物部分或全长核苷酸 序列的探针进行杂交。本法检测灵敏度高 且有助于检测突变DNA的突变类型，常用 于人类遗传病诊断和某些基因的分析。常 规使用时，用非放射性标记的寡核苷酸探 针分析PCR产物，更加安全。 2021年8月11日星期三99 PCR 扩增产物的分析 微孔板杂交法： 夹心杂交法：将捕获探针固定于微孔板 上后，与PCR扩增产物杂交，然后再用 标记的检测探针与产物的另一区域杂交， 漂洗后观察结果； 直接将特异探针固定于微孔板上，然后 用标记的PCR产物与其进行杂交后观察 结果。 2021年8月11日星期三100 PCR 扩增产物的分析 微孔板杂交的基本过程包括： DNA固定、探针的杂交和酶联显 色。关键在于DNA的固定。盐浓 度合适时DNA一端被固定在微孔 板上，盐浓度过高或过低都可使 DNA平躺固定于孔内而影响杂交。 要用一系列盐浓度进行摸索以选 择最佳盐浓度。 2021年8月11日星期三101 PCR 扩增产物的分析 试剂： 固定液：1