基因工程复习资料

1、第一章绪论1. 基因工程（genetic engineering）按照人们预先设计的蓝图，将一种生物的遗传物质绕过有性生殖导入另一种生物中去，使其获得新的遗传性状，形成新的生物类型的基因操作（gen etic ma ni pulation）。2. 基因工程诞生的基础理论上的三大发现 ：DNA是遗传物质、DNA双螺旋模型和半保留复制机理、遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定。技术上的三大发明：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的发现与DNA片段的连接、基因工程载体的研究和应用3. 基因工程研究的主要内容基础研究：基础研究、克隆载体研究、受体系统的研究、目的基因的研究、生物基因组

2、学的研究、应用研究4. 基因工程的基本操作程序分离获得目的基因限制性核酸内切酶将切割源DNA和载体DNA连接酶将外源 DNA和载体连接，组成重组 DNA分子。将重组DNA分子引入受体细胞带有重组体的细胞培养扩增，获得大量的细胞繁殖群体筛选和鉴定转化细胞进一步研究分析，实现功能蛋白的表达第二章工具酶根据工具酶催化的反应类型分为四大类：核酸酶，用于切割或降解核酸分子：连接酶，可以把核酸分子连接起来：聚合酶，用于核酸分子的扩增或拷贝：修饰酶，能够给核酸分子添增或除去核甘酸或某些化学基团。常用基因工程工具酶：限制性内切酶、甲基化酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、磷酸激酶和磷酸酶 、核酸酶、

3、核酶。一、限制性内切酶1. R-M系统：细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制一修饰系统（R-MRestriction-modification system）。细菌R-M系统的限制酶可以降解 DNA,为避免自身 DNA的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身 DNA,未被修饰的外来 DNA则会被降解。2. 限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链 DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。 有3种限制性核酸内切酶，主要应用限制性核酸内切酶n：是具有单一功能的酶，无甲基化作用，辅助因子为Mg+,识别特异性序列，在识别序列内或附近特异切割。3限制

4、性核酸内切酶的切割特点 在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。识别序列有连续的（如 GATC和间断的（如GANTC两种，它们都呈回文结构 2个单链断裂部位在 DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的DNA片段，具有互补的单链延伸末端。三种酶切末端：平齐末端、5粘性末端（如 EcoR I）、3粘性末端（如 Pst I）同裂酶：来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列。产生同样的切割，形成同样的末端。同尾酶：来源不同，识别的核苷酸靶序列也不相同，但切割后DNA分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切酶。4. 限制性核酸内切酶的活性影响因素a底物DNA :

5、DNA纯度、DNA浓度（DNA过大，抑制酶活，影响酶分子扩散 ）、识别位点及邻近位点特异性序列、DNA二级/三级结构（超螺旋 DNA比线状DNA需酶多）、提取时混入杂质可改变识别特异性b反应系统因素：缓冲液（无菌、无污染）、金属离子（Mg2+）、牛血清蛋白（BSA是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量BSA会引起电泳拖尾。）c星活性（可造成位点切割机率不等，降解不完全）5. 限制性核酸内切酶的应用： 重组DNA前的切割、构建新质粒、构建物理图谱 、DNA分子杂交、用限制性内切酶消化受体DNA、制备DNA探针、亚克隆以用作序列分析、基因定位，DNA同源性研究6. 甲基化酶分两类

6、：维持性甲基化酶：用于在新合成的DNA链上进行甲基化的酶，甲基化位置与模板链上的相同。构建性甲基化酶：用于在非甲基化的DNA链上进行甲基化的酶。作用：封闭DNA链中的某些识别位点，保护多余的限制性酶切位点。构建新的酶切位点7. 核酸酶S1核酸酶：降解单链核酸。用于把具粘性末端的DNA变为平齐末端的 DNA。在DNA部分变性条件下，能在富含AT区切断DNA。切除单链中的突出末端和双链中的发夹结构8. 核酶：具有酶活性的 RNA片段，限制性内切酶二、DNA连接酶（ligase）能够催化DNA中相邻的3 -羟基和5 -磷酸基末端之间形成 3, 5-磷酸二酯键的酶机理：有ATP（或NAD）提供AMP形

7、成酶-AMP复合物，同时释放出焦磷酸基团或烟酰胺单核甘酸（NMN；激活的AMP吉合在DNA链5端的磷酸基团上，产生含高能磷酸键的焦磷酸脂键； 与相邻DNA链3端羟基相连，形成磷酸二 脂键，并释放出 AMPDNA连接酶所连接的是 DNA分子上相邻核苷酸之间的切口，能将两条独立的DNA片段连接起来，无法连接缺少核苷酸的裂口和单链DNAT4DNA连接酶：可连接带匹配粘性末端的 DNA分子，也可使平端的双链 DNA分子相互连接。以 ATP作为辅助因子 大肠杆菌DNA连接酶：只能连接带匹配粘末端的DNA分子和带有切口的双链 DNA分子。以NAD作为辅助因子三、DNA 聚合酶（DNA polymerase

8、 ）指在DNA （或RNA）模板指导下，以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP为底物，在引物 3 - OH末端聚合DNA链的 一类酶。分类：依赖于 DNA的 DNA聚合酶，包括聚合酶I、Klenow、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶；依赖于RNA的 DNA聚合酶，逆转录酶。特点：需模板（DNA或RNA）;需引物； 具有三种酶活性，即 5 3聚合酶活性；5 3 外切酶活性和3 t 5 外切外切酶活性。1. DNA杂交探针的制备双链的DNA分子（b）DNA酶I处理使双链的 DNA分子的一条链带有 3 -OH末端的单链缺口（c）pol I的5 - 3 核酸外切酶活性从 5 -P移去一

9、个核苷酸（d）pol I（ 5 -3 聚合酶活性）将 32P标记的核苷酸参入取代被移去的核苷酸（e）重复（c）（d）的步骤，缺口沿 5 -3 方向移动，形成 32P标记的核苷酸合成的 DNA链探针：用来探知被测物存在的小DNA或RNA叫做探针。标记物：探针上结合有易被检测的化合物称为标记物。分子杂交：探 DNA或 RNA与被测物的互补结合叫做分子杂交（molecular hybridization）切口平移：5 端核苷酸不断去除，而 3端核苷酸同时加入，导致断裂形成的切口沿着DNA链按合成的方向移动。2. DNA聚合酶I : 5t 3 聚合，3 t 5 和5 t 3外切活性3. Klenow

10、（E.coli DNA Polymerase I经蛋白酶水解的大片段）无引物时3 t 5外切活性，有引物时 5 t 3聚合活性用途：填补限制酶的5 -粘性末端为平齐末端 、3 -末端标记.4. T4DNA聚合酶活性：5 t 3聚合活性；3 t 5外切活性，对单链活性大于双链DNA外切酶活性比 Klenow大200倍。无引物时3 t5外切活性，有引物时 5t3聚合活性用途： 填补或标记限制酶切后产生的5 -粘性末端的3 -凹缺末端。（同Klenow ）；3 -粘性末端的标记制备 DNA探针，同Klenow 末端标记。5. T7DNA聚合酶（测序酶）活性：5 t 3聚合，持续反应时间最长， 所以合

11、成的DNA链长。故在DNA测序中很优越。3 t 5夕卜切，是DNA 聚合酶I的1000倍。用途：复制较长的模板，在测序中可读出较长的序列用填补或交换反应快速进行末端标记。与T 4 DNApol 样，平齐粘性末端。定点突变中互补链的合成。修饰的T7DNA聚合酶(测序酶)：53 聚合6. Taq DNA :聚合最适温度为 75-80 C,不具3t 5外切酶活性，聚合酶具5 t 3外切活性。用途：PCR反应。 测序，高温下进行 DNA合成可减少模板二级结构。7. 反转录酶：5 -3 聚合活性，RNAseH用途：对RNA:DNA杂交体中的RNA特异性地降解，免除了在反转录完成后再用NaOH降解RNA模

12、板的步骤。以mRNA为模板合成其互补 DNA.8. RNA 聚合酶(RNApolymerase)活性：在DNA指导下合成RNA,结合于启动子部位，转录无意义链(一)产生与有意义链相似 (以U代替模板中T)的 链。四、修饰酶1. 末端转移酶：催化dNTP掺入DNA 3 -OH末端，形成同聚物末端；反应不需模板DNA,需Co2+用途：克隆DNA片段时加上互补同聚物末端，便于与载体连接。末端标记2. 磷酸激酶和磷酸酶磷酸激酶催化5 -OH加P (标记)磷酸酶去除5 - P (防止自身环化)第三章基因工程载体载体：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能的DNA大分子称之为载体(vector )

13、。条件：(1) 能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达；(2) 具有多种限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源DNA片段插入其中；(3) 具有容易检测的筛选标记；(4) 载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝；(5) 在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。基因工程载体克隆载体(clone vector ):主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可；表达载体(expression vector ):能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制

14、子，更要有强启动子；穿梭载体(shottle vector ):这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。一、质粒载体共同组成部分：复制必须区、选择标记基因、限制性核酸内切酶的酶切位点构型：闭合环状 DNA开环DNA线形DNA电泳移率依次减少严紧型质粒：在宿主细胞中的拷贝数较少，一般只有13个。松驰型质粒：其拷贝数较多，一般 2060个，多的可达200300个。转移型，结合型粒(conjugative plasmid ):是指一些质粒在不同的菌株中可以相互转移。非转移型质粒(non-conjugative plasmid):则只能在一种寄主中生存。理想质粒载体的必备条件： 具有

15、较小的分子质量和较高的拷贝数。具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点具有两种以上的选择标记基因(四环素抗性基因 Tet r、氨苄青霉素抗性基因 Amp)缺失mob基因具有复制起始点1. 克隆质粒载体：专用于基因或DNA片段无性繁殖的质粒载体PBR322组成：来自PSCI01的四环素抗性基因 Tetr来自ColEl的衍生物pMBl的松弛复制起点 ori来自RSF2124的氨苄青霉素抗性基因 Amp。特点：具有多个单一的限制性内切酶位点。Tetr 中有 BamHI切点（GJ GATCC 和 Sal I 切点（GJ AATTC , Ampr 中有 Pst I 切点（CTGCA G）。 利用ColEl

16、的复制子，所以在细胞中是多拷贝的，可通过氯霉素使质粒拷贝数进一步扩增。筛选方法一重组克隆的“插入失活”在一个基因位点中插入外源DNA片段，从而使该基因活性丧失的现象叫插入失活。插入在Tet r中，在含有氨卞青霉素培养基上可生长，在含有四环素培养基上不生长 插入在Amp中，在含有氨卞青霉素培养基上不生长，在在含有四环素培养基可生长 而在两种抗生素培养基上都生长的是非重组型。2. pUC系列质粒载体 组成：pBR322质粒的复制起点氨苄青霉素抗性基因 Ampr大肠杆菌LacZ 基因多克隆位点鉴别方法LacZ 基因编码B -半乳糖苷酶氨基端 146个氨基酸，可以和B -半乳糖苷酶缺陷型的大肠杆菌实现

17、基因内互补，即a 互补，产生B -半乳糖苷酶能力。X-gal也是B -半乳糖苷酶的一种底物，经降解后可生成溴氯吲哚，使大肠杆菌菌落呈蓝色。当无B -半乳糖苷酶时，X-gal不被分解，菌落呈白色。当外源基因插入到 pUC质粒的LacZ基因内部，则LacZ基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的B-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。反之，非重组体为蓝色菌落。含Ampr抗性基因，可通过插入失活和颜色反应进行双重筛选。2.表达载体：专用于宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。应含有：（1）强启动子 （2）在启动子下游区和 ATG上游区有一个好的 SD序列

18、。 （3）在外源基因插入序列下游区 要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。二、噬菌体载体入噬菌体颗粒中 DNA为线状双链DNA分子，全长48502 bp，两端各有一段长度为 12个核苷酸的互补单链（粘 端）,称为cos 位点。三个片段组成：左臂（含噬菌体头、尾蛋白质编码基因）、中央片段为非必需区（外源基因插入）、右臂（调节、复制、裂解基因）入噬菌体的缺陷： 基因组太大（49kb）; 酶切点太多， 野生型只能接纳一定长度的DNA。入噬菌体的改造： 切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）;去处太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口；增加标记基因（rem

19、arke gene ）。1. 插入型载体（只有12种限制性核酸内切酶的单一切割位点）失去了非必需区仅保留了EcoR I的单一切点切点又位于报告基因上，故在切开DNA并插入外源基因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选可插入长度为10kb的外源DNA有免疫功能失活、大肠杆菌B-半乳糖苷酶失活插入型载体2. 替换型载体：在其中央部位有一个可以被外源插入的DNA分子取代的DNA片段的克隆载体选择标记：只有入DNA的长度大于野生型入噬菌体DNA长度的75%而不超过其105%时，才能被包装成噬菌体颗粒重组子被包装、非重组子不被包装入噬菌体载体是主要用于 cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆

20、。入噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能：38kb 52kb 。三、单链DNA噬菌体载体M13噬菌体载体 产生单双链DNA的机制 a以（+）链DNA为摸板，合成互补（）链，该双链称复制型DNA （ RFDNA。bRFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。c单链特异的DNA结合蛋白结合在(+)链上，从而阻断了其互补链，即(-)链的合成，这样，细胞就会不断的合成(+)链 DNA。d游离出来的(+)链DNA先与基因V的编码产物形成特异的 DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因 V的蛋白质从(+)DNA链上脱落下来，余下的 M13( +)链DNA则是从其感

21、染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被 外壳蛋白包装成病毒颗粒的。四、植物基因工程载体1. Ti质粒是农杆菌非染色体的环状双链DNA分子结构1) T DNA区(tran sferred-DNA regio ns ) : T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA,故称之为转移 DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。致瘤基因、冠瘿碱合成酶及其分解基 因(2) Vir区(virulenee region ):该区段上的基因能激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称之为毒性区。T-DNA区与Vir 区在质粒DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质粒DNA的三

22、分之一。3) Con区(regio ns en eodi ng eonjugatio ns):该区段上存在着与细菌间接合转移相关基因( tra ),调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra 基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为接合转移编码区。(4) Ori区(origin of replieation):该区段基因调控 Ti质粒的自我复制起始。“双元载体”，也称反式载体，是指由两个分别含T-DNA和Vir相容性Ti质粒构成的双质粒系统。五、动物基因工程载体SV40第四章：核酸操作的基本技术1、核酸的提取与纯化：提取的方法有很多，其中最常用的是化学试剂提取法和离心分离法。在核酸提取中，应

23、去除蛋白质和多糖等的污染， 在RNA提取中，还要严格防止 RNA酶的污染。细胞裂解1) 酶法：利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体，然后加去垢剂使原生质体裂解。 酶法裂解时要注意细胞的生长条件和生长时间，反应时尽可能满足酶的最佳反应条件。2) 机械法：压力剪切法射击破碎法固体研磨法反复冻融法RNA的分离与纯化1) 制备RNA的关键一防止内外源 RNase的作用2) 总RNA的制备2、核酸的检测与保存核酸检测常用的方法有：紫外光谱分析法荧光分析法琼脂糖凝胶电泳法核酸的保存：酸性条件下保存、碱性条件下保存低温条件下保存3、 核酸的凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 脉冲电场凝胶电泳电泳

24、的原理：将某种分子放到特定的电场中，它就会以一定的速度向适当的电极移动。某物质在电场作用下的迁移速 度叫作电泳的速率，它与电场强度成正比，与该分子所携带的净电荷数成正比，而与分子的磨擦系数成反比(分子大 小、极性、介质的粘度系数等)。染色：在凝胶电泳中，一般加入溴化乙锭(EB -ethidium bromide染色，此时，核酸分子在紫外光下发出荧光，肉眼能看到约50ng DNA所形成的条带。段链DNA琛曹1IA探甘4、核酸分子杂交1) 探针的制备： 探针(probe ):用来探知被测物存在的小分子DNA或 RNA 标记物：探针上结合的易被检测的化合物。分子杂交：探针DNA或 RNA与被测物的互

25、补结合叫分子杂交。2) 核酸杂交：原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或 RNA 当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。DNA片段转移并结合在适当的(1) 、Southern DNA印迹转移技术： 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中：滤膜上，然后通过同标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段（2）、Northern RNA 印迹杂交：将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行 核酸杂交的一种实验方法（3）、斑点印迹杂交：是在Southern印迹转移技术的基础上发展而成的快速检测特异核酸分子的核酸杂交技术 适

26、用于核酸样品的定量检测，而不是定性检测基因组DNADNA限制片段KlBrS&JK 的卑昕常*MS(a)(b)疲M板(d)硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的基因DNA片段扫杆汕f *UN A（C）(e)X光底片菌落杂交第五章聚合酶链式反应式1、聚合酶链式反应扩增原理（1）、PCR用于在体外酶促扩增特定 DNA片段的快速方法（2）、原理：PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成类似于DNA的体内复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 模板DNA变性：模板DNA经94C左右加热一定时间后，双链DNA模板或经PCR扩增形成的双链 DNA解离成为单链。 模板DNA与引物的退火（复性）：

27、模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55C左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合。 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下， 以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的单链。变性-退火-延伸三步骤的重复循环，就可获得更多的“模板互补链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。多次循环后目的基因扩增放大几百万倍。2、聚合酶链式反应体系（一）PCR反应体系：参与 PCR反应的主要成份：模板、引物、dNTP Taq DNA聚合酶和缓冲液等。（1） 、模板：包括基因组 DNA RNA质粒DNA线粒体DNA等，模板D

28、NA需较高的浓度 RNA作为模板时，须先将 RNA 逆转录为cDNA再以cDNA作为扩增的模板（2） 、弓I物：引物决定PCRT增产物的特异性和长度，是化学合成的寡核苷酸片段（3） 、脱氧核苷三磷酸（dNTF）:是dATP dCTP dGTP和dTTP4种脱氧核苷三磷酸的混合物（4）、DNA聚合酶：比较常用的酶有：大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段），具5 宀3 DNA聚合酶活性，3 宀5 外切酶活性Taq DNA聚合酶：有很高的耐热稳定性。功能： 具5 宀3 DNA聚合酶活性，5 宀3外切酶活性；特点：高度耐热，最佳温度75 C 80C;在序列分析和PCR中应用广泛.T4DNA聚

29、合酶 功能：A、具5-凸端补平效果 B、53 外切酶活性C 3 t 5 外切酶活性 D、用与制备探针和加减法 DNA序列分析Taq酶的作用：模板指导下，以dNTP为原料，在引物3 -OH末端加上脱氧单核苷酸，形成3 , 5 -磷酸二酯键，使DNA链沿5t 3 方向延伸，催化 DNA合成。（5） 、镁离子浓度:Taq酶的活性只与游离的 Mg2+浓度有关,但PCR反应体系中dNTR引物、模板 DNA及 鳌合剂的存在均可与 Mg2+吉合而降低游离Mg2啲浓度从而影响酶的活性。（6） 、其它反应因素：pH 盐基质（二）PCR勺反应条件：反应温度（变性、退火、延伸）反应时间（变性、退火、延伸） 循环次数

30、（PCR效率及产物量）温度：变性温度：94 97 C退火温度：低于引物 Tm 5 C左右，温度过高：降低扩增效率；温度过低：增加非特异性扩增延伸温度：72度，此时Taq酶具有较高的酶促活性时间：第一次变性应给予足够时间（5 7分钟）每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为 30秒 1分钟，时间过长易导致非特异性扩增 循环次数：重复次数一般设为 2535个循环（三）引物设计的一般原则（1） 引物长度应为1530个核苷酸，Tm可按下列简单公式计算：Tm=（G+C x 4 + （A+T）x 2（2）引物中碱基的分布应当是随机的，避免出现一连串的单一碱基或产生二级结构。（3）G+C碱基的含量在4

31、5%55 %左右。（4） 两个引物在3端均必须与模板互补，5端可以不互补。（5） 引物自身连续互补碱基小于4个。（6） 引物之间连续互补碱基亦应小于4。3、聚合酶链式反应技术类型一、已知DNA序列的聚合酶链式反应扩增（一）巢式PCR巢式PCR是为了增加扩增的灵敏度，对已知序列设计出第一对引物，扩增25个循环。然后根据序列设计出第二对引物，它和已扩增出序列内部两条链序列互补，继续再扩增25个循环。（二）热巢式PCR是巢式PCR的改进技术。（三）半巢式PCR为了节省材料，往往在设计巢式引物时，利用第一对引物中的一个引物，再从靶序列内部设计出另一个引物，效果与巢式 PCR相同。（四）不对称PCR不对

32、称PCR多用于序列分析。（五）等位特异性 PCR等位特异性PCR即AS-PCR又称扩增受阻突变体系是为检测点突变而设计的。（六）PCR单链构象多态1、 原理和方法：PCR-单链构象多态（single strand conformtion polymorphism,SSCP）2、特点：PCR-单链构象多态（PCR-SSCP）的优点是简单、快速、灵敏度高，可同时处理多个样本。（七）竞争引物PCR竞争引物PCRCOP-PCR针对靶DNA一个测点突变设计出两个等位特异性寡核苷酸（allele specificoligonucleotide ,ASO）, 一个为正常引物，另一个为突变引物。（八）降落PC

33、R 降落（TD） PCR代表了一种完全不同的 PCR优化方法，它不是用许多反应管和每管用不同的试剂浓 度和（或）循环参数，而是一个反应管或一小组反应管，在适合于扩增目的产物而的不到人为产物或引物二聚体的循环条件下反应。二、逆转录聚合酶链式反应先用逆转录酶作用于 mRNA以寡聚dT为引物合成cDNA第一链，然后用已知一对引物，扩增嵌合分子，这种方法称为逆转录（reverse transcription,RT） PCR 即 RT-PCR逆转录反应：用于该反应的引物可以是随即六聚体核苷酸，也可以是oligo（dT ）n 。三、已知cDNA一端序列获得全长 cDNA的聚合酶链式反应（一）快速扩增cDN

34、A末端技术PCR用于扩增代表 mRNA专录物某单一位点与 3 或5 末端之间的部分 cDNA称为快速扩增 cDNA末端技术（rapid anplification cDNA end,RACE ）。（二）新 RACE5 RACE是通过反转录酶将目的mRNA整地变成第一链 cDNA因为过早终止的第一链cDNA其有效性 像全长cDNA样，可用末端转移酶同样有效地加尾。四、已知侧翼序列聚合酶链式反应扩增（一）染色体步移-反向PCR已知侧翼序列可以扩增靶序列，称为染色体步移-反向PCR（inverse PCR ）。PCR通常用于扩增位于两寡核苷酸引物之间的DNA区段，但是经特殊设计的 PCR也可以扩增那

35、些位于已知序列外侧的序列，这就是反向PCR（二）锅饼PCR五、 未知序列聚合酶链式反应扩增：1、岛屿获救PCR的原理六、定量聚合酶链式反应（一）竞争性聚合酶链式反应用于定量测定mRNA（二）荧光定量聚合酶链式反应七、免疫相关聚合酶链式反应（一）免疫聚合酶链式反应（immune PCR，免疫PCR （二）酶联免疫吸附分析-聚合酶链式反应（ELISA-PCR）八、聚合酶链式反应技术衍生的分子标记4、聚合酶链式反映技术应用一、核酸的基础研究二、序列分析三、检测基因表达四、从cDNA库中放大特定序列五、研究已知片段邻近基因或未知DNA片段六、进化分析七、医学应用八、分析生物学证据九、性别控制 十、转基

36、因检测第六章DNA文库的构建和目的基因的筛选外源基因：插入到载体内的那个特定的片段基因。目的基因：那些已被或者准备要分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段。基因文库（gene library） 又称DNA文库，是指某个生物的基因组 DNA或 cDNA片段与适当的载体在体外重组后，转化宿 主细胞，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的阳性菌落（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的集合即为该生物的基因文库。基因文库由外源 DNA片段、载体和宿主组成。构建基因文库的基本程序：1）提取研究对象基因组 DNA制备合适大小的 DNA片段，或提取组织或器官的mRNA并反转录成cDNA 2） DNA片段或cDN

37、A片段与经特殊处理的载体连接形成重组DNA 3）重组DNA专化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；4）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。一、基因组DNA文库的构建载体可以分为： 质粒文库、噬菌体文库、粘粒文库、人工染色体文库（细菌人工染色体文库、酵母人工染色体文库）。构建的程序：载体DNA的制备；高纯度大相对分子质量基因组DNA的提取和大片段的制备；高纯度大相对分子质量基因组DNA的部分酶切与脉冲电泳分级分离；载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；重组克隆的挑选和保存。1. 入噬菌体载体文库（922kb）:先以限制性内切酶酶切基因组DNA和入噬菌体，切除入噬菌体DNA的非必需区，目的基因与入噬菌体载

38、体连接，再经过体外包装重组入噬菌体颗粒，感染大肠杆菌，通过噬菌体空斑筛选。2. 粘粒文库（3346kb）:粘粒组成：噬菌体 DNA包装序列（cos）、复制原点、药物抗性基因和多克隆位点。DNA插入片段的两端分别与一个粘粒相连，其它构建过程与入噬菌体文库相似。重组的的粘粒可以通过体外包装以噬菌体的形式感染大肠杆菌，也可以用标准的质粒转化方法直接导入大肠杆菌中进 行增殖。以抗生素培养基、噬菌斑选择重组子。3. 酵母人工染色体文库（100200kb）:用两种限制性内切酶酶切酵母菌DNA为2个末端片段，与目的基因片段连接组成完整的YAC载体导入酵母细胞中。用不含色氨酸的培养基选择YAC重组子。4. 基

39、因组DNA文库克隆子的保存与筛选：保存：影印膜滤保存法、文库在液体培养基中扩增保存、保存单个克隆子于含有甘油的培养基中筛选：表型筛选法：表达性状易于鉴别，如互补筛选抗性筛选法：如二氢叶酸还原酶可以使三甲苄二氨嘧啶降解，而该化学物可抑制大肠杆菌生长分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛选免疫筛选法：利用多肽等作为抗原进行原位杂交筛选PCR筛选法：根据保守序列合成引物，扩增特异性片段二、cDNA文库构建构建的步骤：细胞总RNA勺提取和mRNA勺分离；第一条cDNA合成；第二条cDNA合成；双链cDNA克隆进质粒或噬菌 体载体并导入宿主中繁殖；鉴定和保存。1细胞总RNA的提取和mRNA勺分离纤维素柱层

40、析法： 纤维素上的poly(dT)与mRNA勺poly(A)尾结合。慈珠分离法： 慈珠上的oligo(dT) 与mRNA勺poly(A)尾结合2第一链cDNA的合成：oligo(dT)弓I导的DNA合成法：利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入 12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组 成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。缺陷：因为逆转录酶无法到达 mRNA分子的5末端，必须从 3末端开始合成 cDNA对于大分子量的较长的mRNA分子而言，特别麻烦。随机引物引导的 cDNA合成法(randomly primed cDNA synthesis):根据许多可能的

41、序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物)，作为合成第一链cDNA的引物。在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从 mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3-末端的oligo(dT)引物一处开始。3第二链cDNA的合成将上一步形成的 mRNA-cD N杂合双链变成互补双链 cDNA的过程。1) 自身引导合成法：用加热或碱处理 mRNA-cDN度性，降解RNA获得的单链cDNA3端会形成发夹结构的能力，以此作为第二链合成的引物，在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下，合成 cDNA的第二链，再用 S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构。缺点： 在以S1核酸酶切割

42、cDNA的发夹状结构时，会导致对应于mRNA 5端的地方的序列出现缺失和重排。S1核酸酶的纯度不够时，会偶尔破坏合成的双链cDNA分子。2) 置换合成法：以第一链合成产物 cDNA mRNA杂交体作为切口平移的模板， RNAB H在杂交体的mRNA链上造成切口 和缺口，产生一系列 RNA引物，在大肠杆菌 DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链。T4噬菌体DNA聚合酶填补平 口末端。获得的双链cDNA 5端也会有几对碱基缺失优点：a)合成cDNA的效率高b)直接利用第一链的反应产物，不需纯化c )避免使用S1核酸酶来切割双链 cDNA3) 引导合成法(PCR :以cDNA第一链为模版，设计并

43、合成一组引物，通过PCR扩增获得的双链cDNA能保留完整的5 端序列4) 引物-衔接头法51 M结构Hl单iii引厠-制搂买 丄 引専eDNAfl -逍件威rtlRN*aaaaaaaaaaaaA aW*vt r i tttttttt r r qRIMA酶U水擀并川木福犠移檢将Fl躍圧 加到 eDNASftjjj.的对 Sr仃 JiqCAGCTGAGG 5，5 rGGACSTCCaACG QGGGGGGGG宰C/T O 農“七 Tajc C C QCCCCC C由单確引物-街按买引目 MA曲二泄的台成丼加 入含血陸所需俞隈制酶 切点的1_ inkerTJ CAGGTGftGU卽适、齐限制WHXJ

44、割观磁 cDhlAjt-连雀到 菽怵_Ltj_c*gqtpjjTCG ACfQ),GfCJn4双链eDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖cDNA末端的处理：添加特异性核酸接头以形成适合于克隆的黏性末端末端转移酶一可以向 eDNA末端加上与克隆载体末端互补的尾部5. 双链eDNA的克隆：双链平头的 eDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：1平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收2平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段3加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收 三、基因文库的筛选与鉴定重组体(转化子)：就是掺入或导

45、入外源 DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。筛选1表型筛选法(1) 抗药性筛选：这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。(2) 插入失活筛选法(3) 显色反应选择法(a -互补法)2.PCR筛选法：禾U用合适的引物，以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR通过对PCR产物的电泳分析，确定目的基因是否插入到载体中。3菌落原位杂交法(右图)4免疫筛选法基因文库的鉴定1限制性核酸内切酶分析：当载体与外源基因进行连接时，都需要对其进行酶切，而且这些内切酶都是已知的，因此可以从初步筛选出来的阳性重组菌中提取质粒DNA然后用已知的内切酶进行酶切，酶切进行琼脂糖凝胶电

46、泳，如果出现与预知的大小一 致的电泳片段，就证明已经有目的基因插入到载体中。2 Southern Blotting :将DNA的限制性核酸内切酶的酶切片段从琼脂糖凝胶上转 移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上；用各种标记的 DNA探针同固定在膜上的 DNA片段杂交，经放射自显影或其它显色方法确定出与探针互补的电泳带。3 DNA序列测定目的基因与载体的连接：一、粘末端第七章DNA体外重组与基因转移 DNA片段的连接（一）具有相同粘末端的 DNA分子之间的连接使用碱性磷酸酶处理载体 DNA,去掉其5 末端的磷酸基，以防质粒DNA的自身环化。（二）具有不同粘性末端的DNA分子之间的连接用两种不同的限制性内切酶

47、对载体和外源DNA进行切割后，在它们两端会产生非互补的突出端，经DNA连接酶连接后即产生定向重组体。二、平末端DNA片段的连接1、直接用T4连接酶连接2、同聚物加尾法3、衔接物连接法：衔接物是指用化学方法合成的一段由1012个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段4、DNA接头连接法：接头的一端是齐平的，而另一端是某种内切酶的粘性末端，先利用齐平末端连接方法将它与平 端的外源DNA连接起来，造成人工粘性末端，即可再与之互补的粘性末端的载体DNA相连接。三、载体与DNA片段酶切位点不匹配的连接所谓载体与DNA片段酶切位点不匹配，指载体与待克隆的DNA片段上的酶切位点不

48、相同，因而用一种或两种酶切制造不出可互补的粘性末端。1、按照平末端连接方法加上接头。2、将凹端变为平端1）使用Klenow 酶在4种dNTP存在下，将3凹端完全补平。2） 用S1核酸酶去除3突出末端产生平端 DNA分子。3、使用大肠杆菌 DNA聚合酶I Klenow片段部分补平3凹端转变成粘端。四、cDNA与载体的连接基因转移：向原核细胞的基因导入可采用化学转化法和电击转化法。真核细胞的基因转移有借助于载体的基因转移和 不需载体的基因转移，前者主要是靠动植物病毒的感染来完成；后者有磷酸钙沉淀法、脂质体介导法、血影细胞介导 法、电穿孔转移法等。第八章 重组DNA分子的筛选与鉴定一、遗传检测法：（

49、一）根据载体表型特征选择重组体分子1、 抗药性标记插入失活筛选法：例：pBR322如果外源基因插入到tetr 基因内部，tetr抗性消失，表型为不抗四环素（tets ）、而仍抗氨苄青霉素（ampr）,这样 的转化细胞在含有 amp的培养基仍可生长，但在含有四环素的培养基上不能再生长；反之，如果ampr基因由于外源基因插入其内部而失活，带有重组DNA分子的转化细胞在含有 tet的培养基平板上生长，在含有amp的培养基不能生长。2、a互补：例；pUC质粒在LacZ 的大肠杆菌中，在平板培养中，菌落是白色的。若在该细胞中引入pUC质粒，其上有LacZ，质粒和大肠杆菌DNA可实现a互补，菌落呈蓝色。如

50、果在质粒的多克隆位点的某个酶切点上克隆了外源基因，则LacZ 基因受到破坏，便不能再和缺陷型受体菌中生成有活性的B -半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。JU NaDH优苗库裂烬（二）根据插入序列的表型特征选择重组体二、物理检测法 ：1、凝胶电泳检测法 2、R-环法三、核酸杂交检测法1. 菌落印迹原位杂交 2.斑点印迹杂交3.Southern印迹杂交小楼口訝几站合 舟瑟上四、免疫化学检测法 免疫化学检测法是利用抗体与抗原结合的高度特异性来鉴别基因的。如果 某个重组克隆中的外源基因能够表达，在这个克隆中就存在着这个基因的 特定蛋白，即可用特异性抗体来检测。常用的有标记抗体测定法和免疫沉 淀测定法两种。

51、五、DNA蛋白质筛选法六、转译筛选法第九章基因表达基因表达是 指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。宿主细胞分为两大类：第一类为原核细胞： 常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；第二类为真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。1. 真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件：载体能够独立复制。载体本身是一个复制子，具有复制起点。应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的mRNA较为稳定。所产生

52、的mRNA、须具有翻译的起始信号 AUG和SD序列，以便转录后顺利翻译。一、大肠杆菌中的基因表达大肠杆菌表达载体的组成：选择标记基因、载体的复制起点、供外源基因正确插入的多克隆位点、启动子、转录终止子、翻译起始序列、翻译增强子、翻译终止子等。1. 启动子1）Lac启动子：包括启动子、活化蛋白（CAP结合位点、操作子及lacZ。 ry w 1X1口鹄丙1 11 . J. | 1 180IO4SW 3S780咖擁刑砲竝凶细的给拘特捉城姒甲络柚税型野生型Lac启动子要启动转录条件：有活化蛋白及CAMP等正调控因子和乳糖或 IPTG等解除负调控的物质同时存在LacUV5仅有乳糖或IPTG存在就能启动转

53、录。2） Trp启动子：包括启动子、衰减子、操纵子及trp R的部分结构基因。由阻遏蛋白和衰减子调控。trp R基因产生的阻遏蛋白只有与色氨酸结合时才能转化为活性蛋白与操纵子结合阻止转录起始。当色氨酸浓度高时，在衰减子的作用下，操纵子DNA可以形成类似终止子的茎环结构。可以通过除去色氨酸或增加IAA。3）Tac启动子：Lac启动子和Trp启动子的杂合启动子。4） Pl启动子：受cI所编码的阻遏蛋白的调控，阻遏蛋白与R.启动子结合，阻止基因的转录。cI编码阻遏蛋白受温度控制，当在2830C下，cI所编码的阻遏蛋白具有活性；当温度升高到42 C时，阻遏蛋白失活。2. 转录终止子：转录终止，增强 m

54、RNA分子的稳定性。3. 翻译起始序列： 决定mRNA的翻译起始效率。增强方法：在核糖体结合位点（ PBS的序列结构中，增加腺嘌呤和 胸腺嘧啶脱氧核苷残基含量的比例，诱发特异碱基发生点突变。使用翻译偶联系统进行克隆基因表达等。4. 翻译增强子：增强异源基因表达的特殊序列元件，如大肠杆菌mRNA分子5-UTR中富含U的区段。5. 翻译终止子：UAA6常用的表达载体pBV220系统：来源于pUC8多克隆位点核糖体 rrnB基因终止信号pBR322第42253735位 pUC18第 2066680位 入噬菌体clts857抑制子基因及 PR启动子 pRC23的PL启动子及SD序列2） 融合表达质粒 pBG-2：含有启动子Lac和操纵子Lac、S-D序列、lac I阻遏蛋白基因3） 分融合表现型蛋白载体 Pkk223-3 :启动子由Trp启动子的-35区、LacUV5启动子的-10区、操纵子及S-D序列组成。7. 外源蛋白表达部位1）在胞内直接表达重组蛋白（包涵体：胞内不溶性蛋白聚集成的晶体）2 ）重组蛋白分泌到周质3）重组蛋白分泌到胞外培养基中4 ）以融合形式表达重组蛋白8. 影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素外源基因的拷贝数 外源基因的表达效率：启动子的强弱 核糖体接合位点的有效性SD序列和起始密码ATG的间距密码子组成 表达