分子信标技术

1、分子信标技术分子信标技术 o 分子信标简介分子信标简介 o 分子信标的结构分子信标的结构 o 分子信标的工作原理分子信标的工作原理 o 分子信标的应用分子信标的应用 o 前景与展望前景与展望 分子信标简介分子信标简介 u TyagiTyagi和和KrammerKrammer于于19961996年首次建立，目的是在液年首次建立，目的是在液 相中定量测定靶标序列。相中定量测定靶标序列。 o 基于荧光共振能量转移（基于荧光共振能量转移（FRETFRET）设计的一种新型）设计的一种新型 荧光标记核酸探针；荧光标记核酸探针； o 特殊的发夹结构使得其具有背景信号低、灵敏度特殊的发夹结构使得其具有背景信号

2、低、灵敏度 高、特异性识别性强的特点；高、特异性识别性强的特点； o 广泛应用于分子生物学、生物技术、广泛应用于分子生物学、生物技术、生化分析，生化分析， 生物医学研究和临床诊断生物医学研究和临床诊断 。 分子信标的结构分子信标的结构 经典分子信标结构包括：经典分子信标结构包括： 1 1、环状区环状区（长度（长度15153030个碱基的序列，个碱基的序列， 能与目标分子特异结合）；能与目标分子特异结合）； 2 2、信标茎杆区信标茎杆区（长度为（长度为5 58 8个碱基的互个碱基的互 补序列，使得形成发夹结构）；补序列，使得形成发夹结构）； 3 3、5 5端荧光基团端荧光基团（徳克萨斯红、荧光素

3、（徳克萨斯红、荧光素 等染料）；等染料）； 4 4、3 3端猝灭基团端猝灭基团（DABCYL DABCYL ）。）。 首例分子信标结构示意图首例分子信标结构示意图 环状区环状区 茎杆区茎杆区 荧光基团荧光基团 猝灭基团猝灭基团 分子信标工作原理分子信标工作原理 无靶标存在下，茎环结构使得荧光基团和猝灭基团相互靠近，发无靶标存在下，茎环结构使得荧光基团和猝灭基团相互靠近，发 生生FRETFRET，荧光猝灭，荧光背景极低。，荧光猝灭，荧光背景极低。 加入靶序列后，分子信标与完全互补靶序列形成刚性并且更加稳加入靶序列后，分子信标与完全互补靶序列形成刚性并且更加稳 定的双链杂交体，使得荧光基团和猝灭基

4、团距离增大，阻止了定的双链杂交体，使得荧光基团和猝灭基团距离增大，阻止了FRETFRET的的 发生，荧光恢复。发生，荧光恢复。 影响分子信标的因素影响分子信标的因素 荧光荧光猝灭基团间的距离的影响：猝灭基团间的距离的影响： 环境环境pHpH值的影响：值的影响：pHpH过高时，茎干区碱基对之过高时，茎干区碱基对之 间的稳定结合被破坏，分子信标变性，荧光基间的稳定结合被破坏，分子信标变性，荧光基 团与猝灭基团分开产生荧光。团与猝灭基团分开产生荧光。 E E：FRETFRET效率效率 R R：荧光给体与受体之间的距离：荧光给体与受体之间的距离 影响分子信标的因素影响分子信标的因素 1 1、序列长度（

5、环状序列比茎杆序列长两倍以上，、序列长度（环状序列比茎杆序列长两倍以上， 茎杆序列不能过长或过短）茎杆序列不能过长或过短） 2 2、茎杆序列中、茎杆序列中G G和和C C的含量不能太高的含量不能太高 3 3、5 5- -端的第一个碱基最好不要选择端的第一个碱基最好不要选择G G 4 4、由于被测对象、由于被测对象DNADNA或或RNARNA是大分子，存在扭曲现是大分子，存在扭曲现 象，因此要选择被测对象的外围碱基序列，即容象，因此要选择被测对象的外围碱基序列，即容 易接近的那段序列来设计信标。易接近的那段序列来设计信标。 分子信标设计原理分子信标设计原理 荧光猝灭依赖的是能量共振转移，而转移的

6、效率与荧荧光猝灭依赖的是能量共振转移，而转移的效率与荧 光基团发射光谱同猝灭基团激发光谱的完全重叠有关。为光基团发射光谱同猝灭基团激发光谱的完全重叠有关。为 了荧光能有效猝灭，荧光基团的发射光谱应完全覆盖猝灭了荧光能有效猝灭，荧光基团的发射光谱应完全覆盖猝灭 基团激发光谱。符合此要求且较常用的荧光剂基团激发光谱。符合此要求且较常用的荧光剂- -淬灭剂有：淬灭剂有： 1 1、EDANSEDANS（5- (2-5- (2-氨乙基氨基奈氨乙基氨基奈-1-1-磺酸磺酸) )和和DABCYLDABCYL （4-(4-4-(4-二甲基氨基叠氮苯二甲基氨基叠氮苯) )； 2 2、苯甲酸、苯甲酸6-6-荧光素

7、和荧光素和DABCYLDABCYL ； 3 3、荧光素和罗丹明、荧光素和芘丁酸、荧光素和罗丹明、荧光素和芘丁酸 、香豆素和乙锭、香豆素和乙锭 荧光素和伊红荧光素和伊红 、一些铽螯合物和四甲罗丹明等。、一些铽螯合物和四甲罗丹明等。 分子信标技术常用的荧光剂分子信标技术常用的荧光剂- -淬灭剂淬灭剂 波长转移分子信标波长转移分子信标 优点：优点： 如果对不同分子信标探针修饰以具有不同特征发射如果对不同分子信标探针修饰以具有不同特征发射 波长的荧光发射基团，就可在同一激发光下，通过检测这波长的荧光发射基团，就可在同一激发光下，通过检测这 些特征波长的荧光强度，些特征波长的荧光强度， 实现在同一体系中

8、的多基因分析。实现在同一体系中的多基因分析。 波长转移分子信标波长转移分子信标 表面固定分子信标表面固定分子信标 量子点分子信标量子点分子信标 分子信标的应用分子信标的应用 核酸的检测分析核酸的检测分析 1.1.实时定量实时定量PCRPCR测定靶标浓度测定靶标浓度 2.2.活体内核酸的动态检测活体内核酸的动态检测 3.3.同时检测多个靶核苷酸同时检测多个靶核苷酸 4.4.检测双链检测双链DNADNA 分子信标的应用分子信标的应用 研究研究DNADNA蛋白质的相互作用蛋白质的相互作用 用于核酸酶的研究用于核酸酶的研究 用于研究用于研究DNADNA蛋白质的相互作用蛋白质的相互作用 用作生物芯片和生

9、物传感器用作生物芯片和生物传感器 应用应用1 1、实时定量、实时定量PCRPCR测定靶标浓度测定靶标浓度 将分子信标简单地密封在将分子信标简单地密封在PCR PCR 管中，在每个循环的退火阶段分子信标与管中，在每个循环的退火阶段分子信标与 扩增产物结合产生荧光，未结合的分子信标不发荧光，这样荧光信号随扩增产物结合产生荧光，未结合的分子信标不发荧光，这样荧光信号随 着反应循环的增加而增强，从而反映出着反应循环的增加而增强，从而反映出PCR PCR 过程中扩增产物浓度的增加。过程中扩增产物浓度的增加。 由于加有分子信标的由于加有分子信标的PCR PCR 管在整个反应中是密封的，因此可避免传统管在整

10、个反应中是密封的，因此可避免传统PCRPCR 后扩增产物凝胶电泳过程带来的污染，简化检测手段，检测灵敏度高。后扩增产物凝胶电泳过程带来的污染，简化检测手段，检测灵敏度高。 应用应用2 2、活体内核酸的动态检测、活体内核酸的动态检测 Perlette Perlette 利用微注射法在袋鼠肾细胞质中引入分子信标，对单个活细胞中利用微注射法在袋鼠肾细胞质中引入分子信标，对单个活细胞中 的的RNA RNA 进行了检测，并利用进行了检测，并利用ICCD ICCD 成像系统得到了一系列反应分子信标与成像系统得到了一系列反应分子信标与RNA RNA 结合的荧光图像。结果表明，利用分子信标可以有效地实时检测活

11、细胞中的结合的荧光图像。结果表明，利用分子信标可以有效地实时检测活细胞中的 RNA RNA 及研究及研究RNA/ DNA RNA/ DNA 的杂交过程。的杂交过程。 分子信标的应用分子信标的应用-双链双链DNADNA检测检测 Human osteosarcoma cell nucleus (U2OS cell line) vitally injected with a Cy3-labelled probe specific for chromosomal telomeric repeat sequenes. Note that some spots are relatively large s

12、uggesting association or clustering of multiple telomeres. 分子信标的应用分子信标的应用 WhitcombeWhitcombe设计的一种将设计的一种将 引物与分子信标相结引物与分子信标相结 合的蝎状引物荧光探针。合的蝎状引物荧光探针。 在该探针中在该探针中, ,引物与引物与 分子信标之间有一间隔臂分子信标之间有一间隔臂, , 使反应不能往分子使反应不能往分子 信标方向延伸。在信标方向延伸。在 过程中过程中, ,非特异扩增产物不非特异扩增产物不 会产生荧光信号会产生荧光信号, ,而当特异而当特异 性扩增产物生成时性扩增产物生成时, ,分子

13、信分子信 标将立即与其进行分子内标将立即与其进行分子内 杂交杂交, ,同时发出荧光信号。同时发出荧光信号。 分子信标的应用分子信标的应用 应用应用3 3、同时检测多个靶核苷酸、同时检测多个靶核苷酸 通过选择不同的荧光分子通过选择不同的荧光分子- -猝灭分子对，可以猝灭分子对，可以 设计出不同荧光的多个分子信标设计出不同荧光的多个分子信标( (又称多色分子标又称多色分子标) )， 每个分子信标与其各自的靶标序列杂交后，每个分子信标与其各自的靶标序列杂交后， 荧光荧光 检测系统可以检测到不同颜色的荧光，检测系统可以检测到不同颜色的荧光， 这样多色这样多色 分子信标可对多个靶核苷酸同时定量测定。另外

14、，分子信标可对多个靶核苷酸同时定量测定。另外， 波长转移分子信标同样可以用于核酸的多组分同时波长转移分子信标同样可以用于核酸的多组分同时 定量测定。定量测定。 应用应用4 4、用于核酸酶的研究、用于核酸酶的研究 应用应用4 4、用于核酸酶的研究、用于核酸酶的研究 应用应用5 5、用于研究、用于研究DNA-DNA-蛋白质的相互作用蛋白质的相互作用 DNA DNA 和蛋白质的相互作用的研究是目前分子生物学和和蛋白质的相互作用的研究是目前分子生物学和 生物技术研究中非常重要并迅速发展的领域。将分子信标生物技术研究中非常重要并迅速发展的领域。将分子信标 用于用于DNA -DNA -蛋白质相互作用的研究

15、，蛋白质相互作用的研究， 发挥了其简单、灵敏发挥了其简单、灵敏 等特点，等特点， 又实现了对体系的实时监测，又实现了对体系的实时监测， 甚至可以用于活甚至可以用于活 体细胞的动态研究。体细胞的动态研究。 Fang Fang 等以等以SSBSSB、组蛋白、牛血清蛋白为对象研究了、组蛋白、牛血清蛋白为对象研究了3 3 者对分子信标的不同影响。结果表明，分子信标能够很好者对分子信标的不同影响。结果表明，分子信标能够很好 地区分这地区分这3 3 种类型的种类型的DNA DNA 结合蛋白结合蛋白; ;分子信标与分子信标与SSB SSB 具有具有 很高的亲和力，其结合引起的荧光上升与完全互补的靶相很高的亲

16、和力，其结合引起的荧光上升与完全互补的靶相 近。并且他们进一步研究了近。并且他们进一步研究了SSB SSB 与分子信标的结合动力学，与分子信标的结合动力学， 得出其结合常数与已经报道的结合常数相符。得出其结合常数与已经报道的结合常数相符。 Working mechanism of the fluorophorequencher-labeled MAB. The MAB exists at equilibrium between a nonstructured random coil and a compact intramolecular quadruplex. Addition of thr

17、ombin (gray ellipse) shifts the equilibriumin favor of the quadruplex structure, which draws the fluorophore (F) and quencher (Q) closer, leading to fluorescence quenching. The working mechanism of the donoracceptor-labeled MAB is similar to the quench-type MAB. The arrows of the backbone of the oligonucleotidesindicate the 53 polarity of DNA. 分子信标的应用分子信标