第四章 酶法分析

1、第四章第四章 酶分析酶分析法法 酶分析法：酶分析法： 酶活力测定（酶研究的一部分）酶活力测定（酶研究的一部分） 酶法分析（酶作为分析的工具）酶法分析（酶作为分析的工具） 前者的目的在于检知样品中某种酶前者的目的在于检知样品中某种酶 的含量或活性，后者则主要用于测定与的含量或活性，后者则主要用于测定与 生物学有关的样品中酶以外其它物质的生物学有关的样品中酶以外其它物质的 含量含量。两者检测对象不同，但原理基本两者检测对象不同，但原理基本 一致：酶的专一性、高效性，通过酶反一致：酶的专一性、高效性，通过酶反 应速度测定物质的变化进行定量分析。应速度测定物质的变化进行定量分析。 酶分析酶分析 （En

2、zyme AssayEnzyme Assay） 以酶为分析对象，目的是检测食品、药物以酶为分析对象，目的是检测食品、药物 体液等生物样品中酶的含量或活性；体液等生物样品中酶的含量或活性； 如：如：血液中谷丙转氨酶、淀粉酶等测定；血液中谷丙转氨酶、淀粉酶等测定； 葡萄糖氧化酶生产发酵液中葡萄糖氧化酶活葡萄糖氧化酶生产发酵液中葡萄糖氧化酶活 力测定等；力测定等； 酶法分析酶法分析（ENZYME ANALYSISENZYME ANALYSIS） 酶法分析酶法分析是一种以酶为分析工具（分析试是一种以酶为分析工具（分析试 剂）的分析法，分析的对象可以是底物、辅酶、剂）的分析法，分析的对象可以是底物、辅酶

3、、 活化剂、酶抑制剂。主要用于测定与生物样品活化剂、酶抑制剂。主要用于测定与生物样品 有关的样品中酶以外其他物质的含量。有关的样品中酶以外其他物质的含量。 常用于食品、药物、体液等样品中成分含常用于食品、药物、体液等样品中成分含 量检测如血糖、胆固醇等测定。量检测如血糖、胆固醇等测定。 第一节、酶活力的测定第一节、酶活力的测定 一、酶活力测定（一）基本定义一、酶活力测定（一）基本定义 二、二、 酶活力酶活力 （一）（一） 酶活力酶活力 酶活力酶活力activity： 酶催化一定化学反应酶催化一定化学反应 的能力。用酶催化的反应速度来表示酶的能力。用酶催化的反应速度来表示酶 活力，即用单位时间内

4、，单位体积中底活力，即用单位时间内，单位体积中底 物的减少量或产物增加量来表示。物的减少量或产物增加量来表示。 转换频率：转换频率：单位时间转化的底物分子数。单位时间转化的底物分子数。 Kcat,单位单位1/s （二）酶活力单位及比活力（二）酶活力单位及比活力 酶活力单位酶活力单位U（active unit）：是根据）：是根据 某种酶在最适条件下，单位时间内被酶某种酶在最适条件下，单位时间内被酶 作用的底物的减少量或产物的生成量来作用的底物的减少量或产物的生成量来 规定的，表示酶活力高低。规定的，表示酶活力高低。 IU：umol/min Kat：mol/s 1 Kat=6107 IU 酶的比活

5、力酶的比活力 指每指每mg酶蛋白（或每酶蛋白（或每mg 蛋白氨）所含的酶活力单位数即：比活蛋白氨）所含的酶活力单位数即：比活 力力=活力单位数活力单位数/酶蛋白（氮）酶蛋白（氮）mg 表示酶制剂的纯度，比活力愈高，酶愈纯。表示酶制剂的纯度，比活力愈高，酶愈纯。 （二）测定方式有二（二）测定方式有二： v1. 测定一定时间内的化学反应的量测定一定时间内的化学反应的量 通常测定在一定时间内最适于酶的条件下通常测定在一定时间内最适于酶的条件下 酶促反应产物的生成量。酶促反应产物的生成量。 如蛋白酶的活力，可据酶催化酪蛋白水解如蛋白酶的活力，可据酶催化酪蛋白水解 生成的酪氨酸与酚试剂作用蓝色反应，再用

6、生成的酪氨酸与酚试剂作用蓝色反应，再用 比色法测定之。比色法测定之。 v2. 测定完成一定量反应所需的时间，测定酶测定完成一定量反应所需的时间，测定酶 所催化的一定量底物的减少或一定量产物的所催化的一定量底物的减少或一定量产物的 生成所需的时间，酶活力与之成反比。生成所需的时间，酶活力与之成反比。 测酶活力就是测酶活力就是在确定的最适反应条件下在确定的最适反应条件下 测定酶促反应速度，测定酶促反应速度， 酶促反应速度取决于那些因素酶促反应速度取决于那些因素 ？ 速度方程速度方程 测定酶活力的基本要求：测定酶活力的基本要求： 1 1、要使反应系统中要使反应系统中除除待测酶浓度待测酶浓度是影响反应

7、速度是影响反应速度 的的唯一限制性因素唯一限制性因素（反应速度定量酶活力）；（反应速度定量酶活力）； 2 2、其余一切均应最适合于酶发挥作用（表现最大、其余一切均应最适合于酶发挥作用（表现最大 能力）；能力）； 所以，要建立一个酶活力测定方法，要针对以下所以，要建立一个酶活力测定方法，要针对以下 几方面做工作：几方面做工作： 底物？底物？ pHpH？ 温度？温度？ 样品？样品？ 二、测定中应注意的问题二、测定中应注意的问题 1.初速度初速度 底物浓度对酶速的影响底物浓度对酶速的影响 浓度选择：浓度选择： a a） s=100Kms=100Km； b b） 有时不宜采用高底物浓度（有有时不宜采用

8、高底物浓度（有 毒性、价高、溶解度小、抑制毒性、价高、溶解度小、抑制 酶反应等酶反应等) )则根据具体条件，通则根据具体条件，通 过实验选一适当浓度。过实验选一适当浓度。 作用于待测酶产物的其它酶；作用于待测酶产物的其它酶； （如腈水合酶与酰胺酶）（如腈水合酶与酰胺酶） 其它因素。其它因素。 空白是指待测酶反应以外的其它反应（杂酶、空白是指待测酶反应以外的其它反应（杂酶、 自发反应）引起的变化量自发反应）引起的变化量 空白值可通过不加底物、不加酶、或两者都加空白值可通过不加底物、不加酶、或两者都加 而预先使酶失效而测定而预先使酶失效而测定 例如：例如： GPT GPT 测定中测定中 先不加底物

9、；先不加底物； 酸性磷酸酯酶中酸性磷酸酯酶中 先不加酶；先不加酶； 对照是指用标准酶（或纯酶）测得的结果，对照是指用标准酶（或纯酶）测得的结果， 与样品酶对照来定量。与样品酶对照来定量。 三三 酶活力的测定方法酶活力的测定方法 （一）（一）终止法终止法 是使酶促反应进行一定时间后，是使酶促反应进行一定时间后， 终止其反应，再用化学或物理方法终止其反应，再用化学或物理方法 测定产物或底物变化的量。测定产物或底物变化的量。 三三 酶活力的测定方法酶活力的测定方法 （二）（二）动力学法动力学法 是连续测定酶反应过程中底物、是连续测定酶反应过程中底物、 产物或辅酶的变化量，可以直接测产物或辅酶的变化量

10、，可以直接测 定酶促反应的初速度。定酶促反应的初速度。 三三 酶活力的测定方法酶活力的测定方法 （三）三）酶偶联法酶偶联法 指选择另一种酶与酶发生偶联反应，指选择另一种酶与酶发生偶联反应， 即第一种酶即第一种酶E1所催化的产物作为所催化的产物作为E2的底的底 物，通过测定第二个酶促反应产物的量物，通过测定第二个酶促反应产物的量 变化来测的活力，此法适用于活力不高变化来测的活力，此法适用于活力不高 或所催化产物不便测定的一些酶活力测或所催化产物不便测定的一些酶活力测 定。定。 A B C E1E2 被测反应的产物是某脱氢酶的底物被测反应的产物是某脱氢酶的底物, ,即即B B 是脱氢酶是脱氢酶E2

11、E2的底物的底物, ,测定系统中加入足量的测定系统中加入足量的 脱氢酶脱氢酶E2E2和和NADHNADH, ,使反应进行到使反应进行到C C, ,然后通过然后通过 NADHNADH的特征变化而测知。的特征变化而测知。 G + ATP G-6-P + ADP HK 被测反应：被测反应： 偶联指示反偶联指示反 应：应：G-6-P + NADP NADPH + 6-PGCOOH （关键是工具酶的专一、高纯、且过量，以保证被测反应的关键是工具酶的专一、高纯、且过量，以保证被测反应的v v是总反是总反 应系统中的限速因子，测得的指示反应速度应系统中的限速因子，测得的指示反应速度 和和E1E1浓度间呈线性

12、关系）浓度间呈线性关系） G6PDH 举例：举例：-淀粉酶活力测定淀粉酶活力测定 1.标准碘液法标准碘液法 原理：淀粉对碘呈蓝黑色的特异性逐渐消失，原理：淀粉对碘呈蓝黑色的特异性逐渐消失， 消失的速率与酶活性有关。消失的速率与酶活性有关。 方法：终止法方法：终止法 稀盐酸稀盐酸 测吸光度测吸光度 2.DNS法法 -淀粉酶可随机地作用于淀粉中的淀粉酶可随机地作用于淀粉中的-1,4-糖苷糖苷 键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精 等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又等还原糖，同时使淀粉的粘度降低，因此又 称为液化酶。称为液化酶。 方法：终止法方法：终止法

13、热变性热变性 测吸光度测吸光度 第二节第二节 酶法分析酶法分析 在进行酶法分析时，先要根据分析在进行酶法分析时，先要根据分析 对象选择适它的对象选择适它的“工具酶工具酶”，然后再通，然后再通 过酶反应的测定，并借助相应的校正曲过酶反应的测定，并借助相应的校正曲 线来检知它们的浓度或含量。在上述几线来检知它们的浓度或含量。在上述几 种检测对象中，除了底物可以采用总变种检测对象中，除了底物可以采用总变 量分析法（终点法）外，其它都只能用量分析法（终点法）外，其它都只能用 动力学分析法。动力学分析法。 条件：条件： 和酶活力测定的基本相同，但其所用和酶活力测定的基本相同，但其所用 的酶量必须一定，除

14、了相应的被测因素的酶量必须一定，除了相应的被测因素 的浓度应控制在限速水平以外，其它反的浓度应控制在限速水平以外，其它反 应成份均须保证处于恒定和最适。应成份均须保证处于恒定和最适。 应用时应考虑两个问题，即工具酶的用应用时应考虑两个问题，即工具酶的用 量与反应的平衡点。量与反应的平衡点。 终点法要操作中应注意：终点法要操作中应注意： (1)(1)被测的底物浓度必须十分小，并控制反被测的底物浓度必须十分小，并控制反 应于应于1 1级反应水平。因为这样可以使反应迅速级反应水平。因为这样可以使反应迅速 达到平衡点防止过多的产物生成，避免逆反达到平衡点防止过多的产物生成，避免逆反 应；减少工具酶的用

15、员。应；减少工具酶的用员。 (2)(2)其它因素应尽量处于最适水平，双底物其它因素应尽量处于最适水平，双底物 反应的另一底物应具有足够高的浓度。反应的另一底物应具有足够高的浓度。 (3)(3)酶的用量要高，以保证反应较快地达到酶的用量要高，以保证反应较快地达到 终点。终点。 （三）、酶法分析包括两个步骤：（三）、酶法分析包括两个步骤： 1.酶反应酶反应 在适宜的条件下进行催化反应在适宜的条件下进行催化反应 2.检测检测 测定反应前后物质的变化情况，可以测测定反应前后物质的变化情况，可以测 定底物的减少、产物的增加或辅酶的变定底物的减少、产物的增加或辅酶的变 化化 （四）酶法分析分类（四）酶法分

16、析分类 1.单酶反应定量单酶反应定量 使用单一酶与底物反应，然后测出物质使用单一酶与底物反应，然后测出物质 前后变化，确定底物的量。前后变化，确定底物的量。 2.偶联酶反应定量偶联酶反应定量 利用两种或以上酶的联合作用，使底物通过利用两种或以上酶的联合作用，使底物通过 两步或多步反应，转化为易于检测的产物，两步或多步反应，转化为易于检测的产物， 从而测定被测物质的量。从而测定被测物质的量。 单酶反应的底物或产物不便用常规方法单酶反应的底物或产物不便用常规方法 检测时。检测时。 三、酶标免疫分析法三、酶标免疫分析法 Enzyme Immunoassay (EIA) 在在7070年代初，从年代初，

17、从放射放射免疫免疫分析分析发展发展起起 来的来的一种称为一种称为“酶标免疫酶标免疫”的分析方法，的分析方法， 它是它是将免疫学的专一性和酶的高效催化能将免疫学的专一性和酶的高效催化能 力有机地结合在一起力有机地结合在一起，建立的一种高度特建立的一种高度特 异、灵敏的分析方法。异、灵敏的分析方法。 放射免疫分析放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)(Radioimmunoassay,RIA)是用放射是用放射 性同位素标记抗原性同位素标记抗原AgAg* *，该抗原与未标记抗原该抗原与未标记抗原AgAg竞竞 争结合抗体争结合抗体(Ab)(Ab)结合位点时的能力相同，所以反应结合位点

18、时的能力相同，所以反应 生成的生成的AgAg* *-Ab-Ab复合物与复合物与AgAg的量呈负相关。的量呈负相关。AgAg* *-Ab-Ab的的 生成量可通过测定其放射活性得到，然后根据已知生成量可通过测定其放射活性得到，然后根据已知 浓度抗原的标准曲线就可以计算出浓度抗原的标准曲线就可以计算出样品中抗原浓度，样品中抗原浓度， 这种分析方法称为放射免疫分析。这种分析方法称为放射免疫分析。 优点：优点： n不需要特殊复杂的设备和仪器不需要特殊复杂的设备和仪器 n灵敏度高灵敏度高 n重复性好重复性好 n对健康无害对健康无害 应用前景应用前景 n食品卫生食品卫生 n环境污染生化环境污染生化 指标指标

19、 n临床医学临床医学 “瘦肉精瘦肉精”快速检测新技术快速检测新技术 竞争酶标免疫法竞争酶标免疫法 “ “瘦肉精瘦肉精”（学名盐酸克伦特罗）为一种人工合成的（学名盐酸克伦特罗）为一种人工合成的 作用于作用于肾上腺受体的兴奋剂，常用来防治哮喘、肺气肾上腺受体的兴奋剂，常用来防治哮喘、肺气 肿等肺部疾病，当其应用剂量达到治疗量的肿等肺部疾病，当其应用剂量达到治疗量的5 51010倍时，倍时， 可使肌肉合成增加，脂肪沉积减少，因此将其俗称为可使肌肉合成增加，脂肪沉积减少，因此将其俗称为“瘦瘦 肉精肉精”。 n当人们食用含有残留的肉品（特别是内脏）后常当人们食用含有残留的肉品（特别是内脏）后常 造成心动

20、过速，低血钾，低磷酸盐血症，肌肉震造成心动过速，低血钾，低磷酸盐血症，肌肉震 颤，头晕，口干，失眠甚至瘫痪等中毒症状，重颤，头晕，口干，失眠甚至瘫痪等中毒症状，重 则引起人的死亡。则引起人的死亡。 n色谱分析法一直是用作检测色谱分析法一直是用作检测“瘦肉精瘦肉精”的方法，的方法， 但是昂贵的设备及复杂的前处理工作不适用于基但是昂贵的设备及复杂的前处理工作不适用于基 层的快速检测，而采用竞争酶标免疫检测试剂盒层的快速检测，而采用竞争酶标免疫检测试剂盒 则可经济、快速地检测（则可经济、快速地检测（100100个样品个样品3 3个小时）。个小时）。 海洋污染生化指标研究海洋污染生化指标研究 金属硫蛋

21、白酶免疫法金属硫蛋白酶免疫法 n原理：原理： 金属硫蛋白是一种能被重金属诱导的富含半金属硫蛋白是一种能被重金属诱导的富含半 胱氨酸的低分子量蛋白质。当环境存在着诸如胱氨酸的低分子量蛋白质。当环境存在着诸如 汞、银、铅、镉等重金属时，便能诱导生物体汞、银、铅、镉等重金属时，便能诱导生物体 内金属硫蛋白的合成，且在一定浓度范围内成内金属硫蛋白的合成，且在一定浓度范围内成 正比。因此，海洋生物体内的金属硫蛋白可作正比。因此，海洋生物体内的金属硫蛋白可作 为重金属污染的指标来研究。为重金属污染的指标来研究。 试验内容：试验内容： 筛选了对镉敏感的底栖鱼类筛选了对镉敏感的底栖鱼类, ,并确定了镉诱导并确

22、定了镉诱导 鱼金属硫蛋白的最适诱导条件。鱼金属硫蛋白的最适诱导条件。 从镉诱导的鱼肝脏分离纯化金属硫蛋白并对某从镉诱导的鱼肝脏分离纯化金属硫蛋白并对某 些性质（氨基酸组成、分子量、等电点等）进些性质（氨基酸组成、分子量、等电点等）进 行研究。行研究。 纯化的金属硫蛋白对兔进行免疫，兔抗血清纯纯化的金属硫蛋白对兔进行免疫，兔抗血清纯 化后并标记辣根过氧化酶，化后并标记辣根过氧化酶，ELISA法测定金属法测定金属 硫蛋白。硫蛋白。 非典型肺炎非典型肺炎ELISAELISA检测检测技术技术 n酶联免疫吸附分析酶联免疫吸附分析 的特点是特异性强、的特点是特异性强、 反应灵敏、检出率反应灵敏、检出率 高

23、，是世界卫生组高，是世界卫生组 织织(WHO)(WHO)推荐的病推荐的病 原抗体临床检测的原抗体临床检测的 主要方法。主要方法。 检测方法：检测方法： n当人体被当人体被“非典非典”病毒感染并产生抗体之后，即用病人的病毒感染并产生抗体之后，即用病人的 血清血清( (抗体抗体) )与检测试剂进行反应，呈阳性反应的说明受试与检测试剂进行反应，呈阳性反应的说明受试 者已受病毒感染。者已受病毒感染。 n但对于发病早期还未产生抗体的病人，阴性结果也不能说但对于发病早期还未产生抗体的病人，阴性结果也不能说 明受试者未受病毒感染。明受试者未受病毒感染。仍需进行跟踪检测，如果超过仍需进行跟踪检测，如果超过 “非典非典”潜伏期之后仍没有检测出抗体则可排除患病的可潜伏期之后仍没有检测出抗体则可排除患病的可 能。能。 所以，在所以，在ELISAELISA法中，有法中，有IgMIgM，IgGIgG两种抗体产生的患者即两种抗体产生的患者即 可确定为可确定为“非典非典”感染者。而对阴性结果仍需进行跟踪检感染者。而对阴性结果仍需进行跟踪检 测。测。 n在对在对SARSSARS这种高传染性疾病的斗争中，这种高传染性疾病的斗争中， ELISAELISA能够能够 作出快速的检测，尽量缩短具传染性的