核酸分离纯化剖析PPT学习教案

1、会计学1 核酸分离纯化剖析核酸分离纯化剖析 概 述 第1页/共42页 第2页/共42页 造成的机械剪切力等条件都能明显造成的机械剪切力等条件都能明显 破坏大分子量的线性破坏大分子量的线性DNADNA分子，对分子，对 于分子量小的环状质粒于分子量小的环状质粒DNADNA及及RNARNA分分 子，威胁相对小一些；另外如高温子，威胁相对小一些；另外如高温 加热，除高温本身对核酸分子中的加热，除高温本身对核酸分子中的 化学键的破坏作用外，还可能因煮化学键的破坏作用外，还可能因煮 沸带来液体剪切力，因此核酸提取沸带来液体剪切力，因此核酸提取 常常在常常在0 044的条件下进行。的条件下进行。 （一）保持

2、核酸分子一级结构的完整性 第3页/共42页 （一）保持核酸分子一级结构的完整性 第4页/共42页 变性蛋白结合成带负电荷的复合物，变性蛋白结合成带负电荷的复合物， 该复合物在高盐溶液中沉淀。该复合物在高盐溶液中沉淀。 （一）保持核酸分子一级结构的完整性 第5页/共42页 （一）保持核酸分子一级结构的完整性 第6页/共42页 使用注意： DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋 白质变性的浓度大1001000倍。 容易降解，保存在4或液氮中； 提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37 2 h。 剧毒。 （一）保持核酸分子一级结构的完整性 第7页/共42页 （一）保持核酸分子一级结

3、构的完整性 第8页/共42页 第9页/共42页 破碎组织细胞 提取 纯化 I.材料与方法的选择 II.破碎细胞或包膜核酸的释放 III.核酸分离、纯化 IV.核酸的浓缩、沉淀、洗涤,并去除杂质 V.核酸的鉴定与保存 二、分离提取核酸的主要步骤 第10页/共42页 p 整性、产量、纯度和浓度符合实验整性、产量、纯度和浓度符合实验 要求。要求。 （一）材料与方法的选择 第11页/共42页 p 整性、产量、纯度和浓度符合实验整性、产量、纯度和浓度符合实验 要求。要求。 （一）材料与方法的选择 第12页/共42页 （二）细胞的破碎核酸的释放 第13页/共42页 （二）细胞的破碎核酸的释放 第14页/共

4、42页 注意： 1.细胞破碎方法中机械剪切法不能用于基因组DNA的 提取； 2.非机械法常用化学试剂或酶细胞溶解法。 （二）细胞的破碎核酸的释放 第15页/共42页 细胞裂解物是含核酸分子的复杂混合物，核酸分子 本身可能仍与蛋白质结合在一起。 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸 与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分 开，同时避免核酸降解。 （三）核酸的分离纯化 第16页/共42页 （三）核酸的分离纯化 第17页/共42页 mol/Lmol/L氯化钠中溶解度仍有相当大氯化钠中溶解度仍有相当大 的溶解度。调节氯化钠浓度，可的溶解度。调

5、节氯化钠浓度，可 使使RNARNA核蛋白和核蛋白和DNADNA核蛋白分步提核蛋白分步提 取开来。取开来。 核酸核酸- -蛋白质加入蛋白质加入NaClNaCl后，破坏静后，破坏静 电吸力，使氢键破坏，核蛋白解电吸力，使氢键破坏，核蛋白解 聚；聚； 核酸分离纯化的基本方法 第18页/共42页 核酸分离纯化的基本方法 第19页/共42页 醋酸钠，形成核酸盐，核酸盐可 被一些有机溶剂沉淀，离心得到 的核酸可以用70%乙醇洗涤以除去 多余的盐分，即可获得一定纯度 的核酸。 核酸分离纯化的基本方法 第20页/共42页 在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需 要振摇，为防止起泡和促使水相 与有机相的分离，再加上一定

6、量 的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25： 24：1）。 核酸分离纯化的基本方法 第21页/共42页 二酯键。 (2(2）安全操作）安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的 灼伤，操作时应戴手套。 使用酚时应注意使用酚时应注意 核酸分离纯化的基本方法 第22页/共42页 （四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤 第23页/共42页 淀的盐，需用淀的盐，需用70%70%75%75%的乙醇的乙醇洗洗 涤涤去除。去除。 （四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤 当核酸溶液的pH值大于4时，核酸 分子呈多聚阴离子状态，它与一 价或二价阳离子形成的盐在许多 有机溶剂中不溶解，也不会被有 机溶剂变性。 DNA不溶于乙醇等有机溶剂， 因此

7、可以通过乙醇沉淀来纯 化和浓缩DNA。 第24页/共42页 （四）核酸的浓缩、沉淀与洗涤 第25页/共42页 1.核酸的鉴定 浓度鉴定 纯度鉴定 完整性鉴定 （五）核酸的鉴定与保存 第26页/共42页 p结论：结论：在波长在波长260nm260nm紫外光下紫外光下， 1OD1OD值的吸光度相当于双链值的吸光度相当于双链DNADNA浓浓 度为度为50g/ml50g/ml；单链；单链DNADNA为为37 37 g/mlg/ml；RNARNA为为40 ug/ml40 ug/ml。 浓度鉴定 （五）核酸的鉴定与保存 第27页/共42页 第28页/共42页 标准对照，可比较出被测标准对照，可比较出被测D

8、NADNA溶溶 液浓度。液浓度。 注意：注意：此法的比较主要基于目测，此法的比较主要基于目测， 是估计水平。是估计水平。 （五）核酸的鉴定与保存 EB与DNA的结合 浓度鉴定 第29页/共42页 纯度鉴定 （五）核酸的鉴定与保存 第30页/共42页 纯度鉴定 （五）核酸的鉴定与保存 判断核酸样品的纯度： DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 比值降低：蛋白质污染（280）、酚污染（270） 比值升高：DNA变性、RNA污染 混合污染：比值正常 第31页/共42页 （五）核酸的鉴定与保存 纯度鉴定 第32页/共42页 n 泳图呈拖尾状

9、。泳图呈拖尾状。 完整性鉴定 （五）核酸的鉴定与保存 第33页/共42页 DNA的降解 （五）核酸的鉴定与保存 第34页/共42页 （五）核酸的鉴定与保存 完整性鉴定 第35页/共42页 （五）核酸的鉴定与保存 第36页/共42页 核酸保存的主要条件是温度和介质 温度： 4样品经常使用 -70是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20保存,避免反复冻融 保存介质： 灭菌水 TE缓冲溶液(最常用)： 10mmol/LTris-ClpH8.0 1mmol/LEDTApH8.0 （五）核酸的鉴定与保存 2. 核酸的保存DNA的保存 第37页/共42页 （五）核酸的鉴定与保存 2. 核酸的保存DNA的保存 第38页/共42页 RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸灭菌 水中，-70保存 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; 在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷 复