液相色谱：5-色谱定性和定量

1、高效液相色谱-定性和定量 色谱定性定量 色谱分析的目的 (1)对未知组分进行定性分析 (2) 对已知组分进行定量分析 根据色谱图上某个色谱峰的保留时间和该 色谱峰在检测器上的响应强度，对该谱峰 初步定性和定量分析 定性分析 定性分析 1、利用保留值定性-最基本的方法； 基本依据是两个相同的物质在相同的 色谱条件下应该有相同的保留值；但相反 结论却不成立，即相同色谱条件下，具有 相同保留值的两个物质不一定是同一个物 质，尚需其他一些辅助技术来确认。 2、利用两谱联用定性； 3、其他方法定性 定性分析保留值定性 （1）已知物保留值直接对照法定性 未知峰保留值(保留时间或保留体积)与 某标准物完全相

2、同，可初步确定为同一物 质；改变色谱柱或流动相组成，二者保留 值仍完全相同，则可认定为同一物质 优点：简单 缺点：适用范围窄；必须有标准物质 定性分析保留值定性 定性分析保留值定性 （2） 利用文献保留值数据进行比对定性 文献报道的保留值数据只能作为定性参 考。因为仪器 、色谱柱、试剂等条件不一 致，很难重现到文献报到的数据。可以根 据文献数据和对照品先初步定性，再用已 知标准物进行定性 定性分析保留值定性 （3） 利用已知物增加峰高法定性 将已知标准物质加到待测样品，若某一峰 增高，且改变色谱柱或流动相组成后仍能使 该峰增高，则可基本认定该峰与已知标准物 为同一物质 定性分析保留值定性 （4

3、 ）用三维图谱检测器定性 如果HPLC仪配备有三维图谱检测器， 除比较未知组分与已知标准物保留时间外 ，还可比较两峰的立体结构。 二极管阵列检测器可同时比较保留时间 和紫外光谱图。如果两项均一样，则可基 本上确定为同一物质；如果保留时间一样 ，而紫外图谱有较大差别，则判定两者不 是同一物质 定性分析两谱联用定性 如果标准物质缺乏或难以获得；或由于结构 、理化性质相似，很多物质具有十分接近，甚至 相同的保留值，则保留值定性准确度存在疑问。 红外光谱、紫外光谱、核磁共振波谱和质谱 对有机化合物有很强的定性能力，可用于定性。 目前HPLC-MS和HPLC-NMR 已作为液相色谱的常 规检测器使用，技

4、术也十分成熟。 定性分析两谱联用定性 （1 ）色谱-质谱联用（HPLC-MS） 质谱属于液相色谱的广适性检测器 普通高效液相系统只能对已知化合物（有标准 品的化合物）通过峰位保留值定性，对未知化 合物无能为力。高效液相色谱质谱联用可对 未知化合物做多级质谱分析，通过多级质谱碎 片推测未知化合物结构，进而准确定性 定性分析两谱联用定性 1983年开发串联质谱技术问世，发展十分迅 速，已被作为成熟技术，广泛用于许多领域，特 别是药学领域，并发挥了巨大作用. 中药及植物药化学成分的快速筛选； 中药品种、道地药材的鉴别； 中药质量标准研究； 药代动力学和药物代谢产物研究； 非法掺假； 刑事侦察；兴奋剂

5、筛查；环境保护 定性分析两谱联用定性 （2） 色谱-核磁共振联用（HPLC-NMR） NMR 是迄今为止功能强大的结构研究手段 ，可彻底解决多数有机物的化学结构问题，且对 所有含检测核的化合物均有响应，具有极大的通 用性。 与HPLC 联用要求有良好的色谱分离，但对 色谱条件要求不高，普通色谱柱即可适于药物杂 质鉴定、药物体内外代谢产物的结构鉴定、天然 产物化学筛选等 定性分析其他方法 （1 ）收集洗脱物后进行定性分析 收集色谱分离后的每一个分离组分，对所得组分 分别进行仪器、化学分析或其他物理参数（如熔 点、沸点、折光、旋光等）测定 定性分析其他方法 收集组分时应注意 某些情形，如色谱分析，

6、宜采用非破坏性检测 器，电化学检测器不可；如使用破坏性检测器， 则须在检测器前分流，使分离后的一小部分组分 进入检测器 尽量考虑前后组分的影响，特别是分离不完全的 组分 只收集峰顶附近组分，以消除定性时相邻组分的 干扰 注意流动相中溶剂杂质的影响 注意色谱分离后组分被检测和被收集间的时差 定性分析其他方法 （2）化学衍生法定性 利用样品中某些化合物与特征试剂柱前或柱 后存在的化学反应生成相应衍生物进行定性。 适于官能团定性。 定量分析 定量分析 常用定量分析方法 归一化法 标准曲线法 内标法 标准加入法 按测量参数分为峰面积法和峰高法 定量分析 色谱定量分析，峰高法或峰面积法的选 择主要取决于

7、检测器线性范围内，峰高和 峰面积的准确性和重复性 归一化法最好选择峰面积法 标准曲线、内标和标准加入三种定量方 法可选择峰高法和峰面积法 归一化法 所有出峰组分之和按100%计算的定量方法， 称为归一化法。 （1）前提条件是样品中所有组分均能流出色谱 柱，并在检测器上都能产生信号。 （2）组分i 的质量分数可按下式计算： 式中Ai为组分i 的峰面积， fi为i 组分的质量 校正因子。当fi为摩尔校正因子或体积校正因子时 ，所得结果分别为 i 组分的摩尔百分含量或体积 百分数 归一化法 特点： 1 各组分须全部流出，并在检测器产生信号 2 与进样量无关 3 不需标样 4 简单 外标法（标准曲线法

8、、单点校正法） 首先用欲测组分的标准品绘制标准工作曲线。具体 作法是：用标准品配制成不同浓度的标准系列，在与欲 测组分相同的色谱条件下，等体积准确量进样，测量各 峰的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对样品浓度绘制标 准工作曲线，此标准工作曲线应是通过原点的直线。若 标准工作曲线不通过原点，说明测定方法存在系统误 差。标准工作曲线的斜率即为绝对校正因子。 当欲测组分含量变化不大，并已知这一组分的大概含 量时，也可以不必绘制标准工作曲线，而用单点校正 法，即直接比较法定量。单点校正法实际上是利用原点 作为标准工作曲线上的另一个点。因此，当方法存在系 统误差时（即标准工作曲线不通过原点），单点校正法 的

9、误差较大。 外标法（标准曲线法、单点校正法） 标准曲线法的优点：检测比较准确，绘制好 标准工作曲线后计算时可直接从标准工作曲线上 读出含量。 标准曲线法的缺点：每批样品分析时都需要 做标准曲线，因为色谱条件（检测器的响应性 能，柱温度，流动相流速及组成，进样量，柱效 等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。另 外，进样量要求要十分准确，要严格控制在与标 准物相同的操作条件下进行，否则造成分析误 差，得不到准确的测量结果。 定量分析-标准曲线法 内标法 选择适宜的物质作为欲测组分的参比物，定 量加到样品中去，依据欲测组分和参比物在检测 器上的响应值（峰面积或峰高）之比和参比物加 入的量进行定量分

10、析的方法称为内标法。 内标法的关键是选择合适的内标物。内标物 应是原样品中不存在的纯物质，该物质的性质应 尽可能与欲测组分相近，不与被测样品起化学反 应，同时要能完全溶于被测样品中。内标物的峰 应尽可能接近欲测组分的峰，或位于几个欲测组 分的峰中间，但必须与样品中的所有峰不重叠， 即完全分开。 内标法 内标法的优点：进样量的变化，色谱条件的 微小变化对内标法定量结果的影响不大，特别是 在样品前处理（如浓缩、萃取，衍生化等）前加 入内标物，然后再进行前处理时，可部分补偿欲 测组分在样品前处理时的损失。若要获得很高精 度的结果时，可以加入数种内标物，以提高定量 分析的精度。 内标法 内标法的缺点：

11、选择合适的内标物比较困 难，内标物的称量要准确，操作较麻烦。使用内 标法定量时要测量欲测组分和内标物的两个峰的 峰面积（或峰高），根据误差抵消原理，由于进 样量的变化和色谱条件变化引起的误差，内标法 比标准曲线法要小很多，所以总的来说，内标法 定量比标准曲线法定量的准确度和精密度都要 好。 定量分析-内标法 定量分析-内标法 标准加入法 也称叠加对比法，实际上是一种特殊的内标法 是在选择不到合适内标时，以待测组分的纯物 质为内标，加入到待测样品中 然后在相同色谱条件下，根据待测组分加入纯 物质前后所测待测组分的峰面积，计算含量 标准加入法 优点： 不需另外的内标 不需精确进样 操作简单 缺点：

12、 须保证加入待测组分前后色谱条件完全一致 总 结 1. 当一个方法能够满足测试要求的时候，无论内 标外标，都是可行的，当然有一个分析成本和分 析时间的问题，内标的成本和控制溶液、样品溶 液的配制当然要比外标要高和麻烦一些。而有些 时候，可能受实验室现有仪器和附属设备的影 响，达不到一定的要求，而还必须进行定量分 析，有时外标的结果可能就要差一些，这时，你 可能就要考虑用内标法了，可以排除手动进样的 误差、分流歧视的影响、包括一些未知因素平行 误差的影响，这时内标可能就显示出它的优势来 了。 2、当做方法验证的时候，当同一样品配制6个样 品溶液用外标法进行定量的时候，RSD都满足 1.5%的要求时，也分为两种情况，小于1%和大 于1%小于1.5%。如果RSD的结果小于1%，那这 个方法就没有什么可以怀疑的了；如果RSD的结 果大于1%而在1.5%略低一些的范围活动时，这 个方法的可行性就将受到质疑，毕竟这是方法验 证，你就要考虑上面1中所提到的影响因素的影 响了，如果排除掉以上的影响因素，RSD还是在 1.5%附近，就要尝试内标了，如果内标结果的 RSD