细胞工程课件：第六章 体细胞杂交4

1、第六章第六章 细胞融合细胞融合 第六章体细胞杂交2 主要内容主要内容 1 1、细胞融合的概念、意义、细胞融合的概念、意义 2 2、细胞融合的方法和基本程序、细胞融合的方法和基本程序 4 4、融合杂种细胞的选择与鉴定、融合杂种细胞的选择与鉴定 5 5、植物细胞融合和体细胞杂交、植物细胞融合和体细胞杂交 第六章体细胞杂交3 植物细胞植物细胞 动物细胞动物细胞 第六章体细胞杂交4 1 1、细胞融合细胞融合（cell fusion）概念：概念： 细胞融合是细胞融合是20世纪世纪60年代发展起来的一项细胞工程技术年代发展起来的一项细胞工程技术 也称体细胞杂交也称体细胞杂交（somatic hybridi

2、zation） 、原生质体、原生质体 融合融合，是指将不同来源的原生质体相融合并使之分化再，是指将不同来源的原生质体相融合并使之分化再 生生,形成新物种或新品种的技术。形成新物种或新品种的技术。 一、体细胞杂交的概念、意义一、体细胞杂交的概念、意义 第六章体细胞杂交5 第六章体细胞杂交6 1 1）有性杂交变无性杂交）有性杂交变无性杂交, ,加快育种速度加快育种速度 2 2）打破远缘杂交的不亲和性）打破远缘杂交的不亲和性 3 3）创造新细胞质杂种）创造新细胞质杂种 4 4）单克隆抗体制备）单克隆抗体制备 第六章体细胞杂交7 第六章体细胞杂交8 3、细胞融合的一些基本概念、细胞融合的一些基本概念

3、u同核体（同核体（homokaryon）：）： 基因型相同的细胞融合成的杂交细胞；基因型相同的细胞融合成的杂交细胞； u异核体（异核体（heterokaryon）：）： 来自不同基因型的杂交细胞来自不同基因型的杂交细胞 l自发融合：自发融合： 异种细胞在培养时异种细胞在培养时2个靠在一起的细个靠在一起的细 胞自发合并；胞自发合并； l诱发融合：诱发融合： 异种间的细胞必须经诱导剂处理才异种间的细胞必须经诱导剂处理才 能融合。能融合。 第六章体细胞杂交9 4、细胞融合的发展历史、细胞融合的发展历史 l1858年，菲尔绍夫报道了正常组织、发炎组织及肿瘤组年，菲尔绍夫报道了正常组织、发炎组织及肿瘤组

4、 织中出现多核细胞情况；织中出现多核细胞情况； l 1875年，兰格第一个观察到脊椎动物年，兰格第一个观察到脊椎动物(蛙类蛙类)的血液细胞的血液细胞 合并现象；合并现象； l 1962年，日本冈田善雄发现年，日本冈田善雄发现HVJ病毒能引起艾氏腹水肿病毒能引起艾氏腹水肿 瘤细胞融合成多核的现象；瘤细胞融合成多核的现象； l 1965年，英国海利斯进一步证实灭活的病毒可诱发动物年，英国海利斯进一步证实灭活的病毒可诱发动物 细胞融合；细胞融合； l 70年代年代,华裔加籍科学家高国楠发现聚乙二醇华裔加籍科学家高国楠发现聚乙二醇PEG能促使能促使 植物原生质体的融合；植物原生质体的融合； l 从这开

5、始从这开始,始于动物的细胞融合也扩展到植物和微生物细始于动物的细胞融合也扩展到植物和微生物细 胞胞. 第六章体细胞杂交10 二、体细胞杂交的原理与方法 1、原理（以植物细胞为例）、原理（以植物细胞为例） 去除细胞壁以获得大量的原生质体去除细胞壁以获得大量的原生质体 诱导细胞融合形成杂种细胞诱导细胞融合形成杂种细胞 细胞相互靠近细胞相互靠近 形成细胞桥形成细胞桥 最关键的一步最关键的一步 胞质渗透胞质渗透 细胞核融合细胞核融合 筛选筛选,培养培养,促进细胞分裂促进细胞分裂,分化分化, 从细胞团从细胞团,愈伤组织到最后成株愈伤组织到最后成株 细胞融 合经历 步骤 第六章体细胞杂交11 细胞融合经历

6、的步骤细胞融合经历的步骤 原生质体或细胞互相靠近原生质体或细胞互相靠近 细胞桥形成细胞桥形成 胞质渗透胞质渗透 细胞核融合细胞核融合 第六章体细胞杂交12 2、方法、方法 生物法生物法仙台病毒法仙台病毒法 化学法化学法PEG等等 物理法物理法电融合法电融合法 第六章体细胞杂交13 1）生物法）生物法仙台病毒法仙台病毒法 原理：病毒被膜具有凝聚细胞的能力，原理：病毒被膜具有凝聚细胞的能力， 它一边黏连一个细胞的表面，另一边黏连它一边黏连一个细胞的表面，另一边黏连 另一个细胞的表面，从而使两个细胞在病另一个细胞的表面，从而使两个细胞在病 毒的作用下靠近发生凝结，诱导细胞的融毒的作用下靠近发生凝结，

7、诱导细胞的融 合。合。 第六章体细胞杂交14 病毒促使细胞融合的主要步骤：病毒促使细胞融合的主要步骤： 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此 靠近；靠近； 通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个 细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透； 两个原生质体的细胞核互相融合，融为一体；两个原生质体的细胞核互相融合，融为一体； 进入正常的细胞分裂。进入正常的细胞分裂。 第六章体细胞杂交15 2）、化学法）、化学法 主要包括：主要包括： n盐类融合法（盐类融合法（NaNO3） n高高Ca2+和高和高pH值

8、诱导法值诱导法 n聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）融合法）融合法 nPEG与高与高Ca2+和高和高pH值结合融合法值结合融合法 第六章体细胞杂交16 、盐类融合法（盐类融合法（NaNO3）的原理：）的原理： 盐（如盐（如NaNO3） ）能中和原生质体表面的 能中和原生质体表面的 电荷，促进原生质体的聚集，诱导细胞的电荷，促进原生质体的聚集，诱导细胞的 融合。融合。 l盐类融合剂种类盐类融合剂种类 l硝酸盐类：硝酸盐类：NaNO3、KNO3、Ca(NO3) 2 l氯化物类：氯化物类：NaCl、CaCl 2 、Mg Cl 2 、 BaCl 2 l葡聚糖硫酸盐类：葡聚糖硫酸钾、葡聚糖硫葡聚糖硫酸盐类：葡

9、聚糖硫酸钾、葡聚糖硫 酸钠酸钠 第六章体细胞杂交17 盐类融合的优缺点盐类融合的优缺点 优点：盐类融合剂对原生质体的活优点：盐类融合剂对原生质体的活 力力破坏力小破坏力小； 缺点：缺点：融合频率低融合频率低，对液泡化发达，对液泡化发达 的原生质体不易诱发融合。的原生质体不易诱发融合。 第六章体细胞杂交18 、高Ca2+和高pH值融合 、Ca2+浓度 0.05 mol/L 、pH 9.5-10.5 第六章体细胞杂交19 具体做法具体做法(以烟草为例以烟草为例) a. 取分离、纯化好的两种亲本原生质体以取分离、纯化好的两种亲本原生质体以1:1的的 比例混合比例混合; b. 加入加入0.05mol/

10、LCaCl2.2H2O和和0.4mol/L甘露甘露 醇醇; c. 再用甘氨酸钠缓冲再用甘氨酸钠缓冲pH值到值到10.5，成为融合液，成为融合液， 同时在同时在37下保温下保温0.5h; d. 用用0.4mol/L甘露醇洗净高甘露醇洗净高CaCl2和高和高pH值；值； 两种原生质体的融合率达到两种原生质体的融合率达到10%。 Polyethylene Polyethylene glycol(PEG)glycol(PEG)是一种多聚化合物是一种多聚化合物, , 分子式分子式H(OHCHH(OHCH2 2-CH2)-CH2)n nOH, OH, 平均相平均相 对分子量对分子量200-20000200

11、-20000之间之间。 第六章体细胞杂交20 第六章体细胞杂交21 PEG的作用机理：的作用机理： PEG分子具有轻微的分子具有轻微的负极性负极性，与具有正极，与具有正极 性基团的物质形成氢键，在原生质体之间形性基团的物质形成氢键，在原生质体之间形 成成分子桥分子桥，使原生质体发生粘连进而促使原，使原生质体发生粘连进而促使原 生质体的融合；生质体的融合； PEG能增加能增加类脂膜类脂膜的流动性的流动性，也使原生质，也使原生质 体的核、细胞器发生融合成为可能。体的核、细胞器发生融合成为可能。 第六章体细胞杂交22 细胞融合示意图细胞融合示意图 第六章体细胞杂交23 细胞融合操作流程图细胞融合操作

12、流程图 第六章体细胞杂交24 具体过程：具体过程： 收集原生质体；收集原生质体； 用用PEG处理处理40-50 min； 用培养液缓慢稀释用培养液缓慢稀释PEG最后洗去最后洗去 PEG； 细胞选择与培养细胞选择与培养 第六章体细胞杂交25 PEG诱导融合的优点与缺点诱导融合的优点与缺点 优点：优点： 融合成本低，勿需特殊设备；融合成本低，勿需特殊设备； 融合子产生的融合子产生的异核率较高异核率较高； 融合过程不受物种限制。融合过程不受物种限制。 缺点：缺点： 融合过程繁琐；融合过程繁琐； PEG可能对细胞有毒害。可能对细胞有毒害。 第六章体细胞杂交26 PEG与高与高Ca2+和高和高pH值结合

13、融合法值结合融合法 先用先用PEG处理处理30min；（；（PEG是相邻原生是相邻原生 质体表面间的分子桥）；质体表面间的分子桥）； 然后用高然后用高Ca2+和高和高pH值液，稀释值液，稀释PEG； （引起原生质体表面电荷的紊乱和再分布，（引起原生质体表面电荷的紊乱和再分布， 从而促进了融合）；从而促进了融合）； 再用培养液洗去高再用培养液洗去高Ca2+和高和高pH值。值。 第六章体细胞杂交27 3）物理法）物理法电融合法电融合法 原理：原理： 改变原生质体质膜改变原生质体质膜表面的电荷表面的电荷和和 氧化还原电位氧化还原电位发生改变，使异种原生发生改变，使异种原生 质体粘合并质体粘合并发生质

14、膜瞬间破裂发生质膜瞬间破裂，进而，进而 质膜开始连接，直到闭和成完整的膜质膜开始连接，直到闭和成完整的膜 形成融合体。形成融合体。 第六章体细胞杂交28 电融合操作基本过程电融合操作基本过程 1.1.将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室，微将制备好的亲本原生质体均匀混合放入融合小室，微 电极型只有一个小室，平行电极型有电极型只有一个小室，平行电极型有4 4个小室，两电个小室，两电 极间隔极间隔3mm3mm，整个装置放在一个培养皿中，整个装置放在一个培养皿中 2.2.微电极型微电极型：用：用5-125-12微安的微安的脉冲电流间断刺激脉冲电流间断刺激1-51-5毫秒，毫秒， 原生质体在几秒

15、到几十秒钟的时间内会发生暂时性的原生质体在几秒到几十秒钟的时间内会发生暂时性的 收缩，两层膜之间形成小孔，连接成桥，形成一个个收缩，两层膜之间形成小孔，连接成桥，形成一个个 泡囊，经点连接到面连接，最后形成融合体泡囊，经点连接到面连接，最后形成融合体, ,整个过整个过 程约程约10-3010-30分分 或或3 3 平行多电极融合装置法平行多电极融合装置法：经过：经过1 1兆赫如兆赫如150V/cm150V/cm交流交流 电场发生双向电脉冲，原生质体在电场力的作用下，电场发生双向电脉冲，原生质体在电场力的作用下， 极化产生偶极子，原生质体紧密极化产生偶极子，原生质体紧密排开成串珠状排开成串珠状。

16、在适。在适 当时间和强度的当时间和强度的直流直流电脉冲电脉冲(50ms,1.2-2KV/cm)(50ms,1.2-2KV/cm)作用作用 下，质膜发生被击穿，进一步形成融合体下，质膜发生被击穿，进一步形成融合体 第六章体细胞杂交29 细胞电融合过程细胞电融合过程 第六章体细胞杂交30 融合过程：融合过程： l细胞膜的接触：电场通电后，电流即通细胞膜的接触：电场通电后，电流即通 过原生质体而不是通过溶液，使原生质过原生质体而不是通过溶液，使原生质 体体极化而产生偶极子极化而产生偶极子，从而使原生质体，从而使原生质体 紧密接触排列成串；紧密接触排列成串； l膜的击穿：高频直流脉冲使原生质膜击膜的击

17、穿：高频直流脉冲使原生质膜击 穿，导致两个紧密接触的细胞融合在一穿，导致两个紧密接触的细胞融合在一 起。起。 第六章体细胞杂交31 电融合优点：电融合优点： l一、是不存在对细胞的毒害问题；一、是不存在对细胞的毒害问题； l二、是二、是融合效率高融合效率高，重复性强重复性强； l三、是融合技术三、是融合技术装置精巧，装置精巧，操作简便。操作简便。 l四、是可在显微镜下观察或录像融合过程，四、是可在显微镜下观察或录像融合过程， 免去免去PEG诱导后的洗涤过程，诱导过程诱导后的洗涤过程，诱导过程 可控性强。可控性强。 第六章体细胞杂交32 3 3、原生质体融合类型、原生质体融合类型 对称融合对称融

18、合（symmetric fusion）：）： 即两个完整的细胞原生质体融合。即两个完整的细胞原生质体融合。 非对称融合非对称融合（asymmetric fusion）：）： 利用物理或化学方法使某亲本的利用物理或化学方法使某亲本的核或核或 细胞质失活细胞质失活后再进行融合后再进行融合。 第六章体细胞杂交33 核或细胞质失活的方法：核或细胞质失活的方法： 物理方法物理方法： 常采用射线处理常采用射线处理，如，如X射线、射线、射线等，射线等， 使细胞核失活；使细胞核失活； 化学处理化学处理： 核失活核失活碘乙酰胺、碘乙酸；碘乙酰胺、碘乙酸； 细胞质失活细胞质失活罗丹明（能抑制线粒体罗丹明（能抑制线

19、粒体 的氧化磷酸化过程）。的氧化磷酸化过程）。 第六章体细胞杂交34 4 4、影响原生质体融合的因素：、影响原生质体融合的因素： 首先，原生质体质量；首先，原生质体质量； 其次，融合方法：其次，融合方法： PEG诱导法诱导法：PEG规格、纯度，作用时间规格、纯度，作用时间 电诱导法电诱导法：原生质体密度、交流电压：原生质体密度、交流电压 、交变、交变 电场的振幅频率、交变电场的处理时间、直流高电场的振幅频率、交变电场的处理时间、直流高 频电压、脉冲宽度、脉冲次数。频电压、脉冲宽度、脉冲次数。 第六章体细胞杂交35 三、杂种细胞的发育、选择与鉴定三、杂种细胞的发育、选择与鉴定 1 1、杂种细胞的

20、发育动态：、杂种细胞的发育动态： 核质重组核质重组 细胞器重组细胞器重组 部分核物质或细胞器丢失部分核物质或细胞器丢失 核分裂的非同步性核分裂的非同步性 第六章体细胞杂交36 2 2、体细胞杂种的特点：、体细胞杂种的特点： 形态上的趋中性形态上的趋中性 变异幅度大变异幅度大 非整倍性非整倍性 双亲性状的共显性双亲性状的共显性 偏亲现象偏亲现象 3 3、杂种细胞的选择系统：、杂种细胞的选择系统： 外观选择外观选择 互补选择互补选择 荧光标记选择荧光标记选择 其它方法其它方法 第六章体细胞杂交37 外观选择外观选择 根据融合后异核体和亲本原生质体的形态特征根据融合后异核体和亲本原生质体的形态特征

21、之区别；之区别； 利用亲本原生质体大小、颜色、漂浮密度及电利用亲本原生质体大小、颜色、漂浮密度及电 脉差异率等差异选择杂种。脉差异率等差异选择杂种。 第六章体细胞杂交38 互补选择（互补选择（遗传或抗性）遗传或抗性） 例如：选择一个叶绿体缺失突变体，这一突例如：选择一个叶绿体缺失突变体，这一突 变体在限定培养基上，能分裂、分化形成植株。变体在限定培养基上，能分裂、分化形成植株。 具有正常叶绿素的植株，在上述限定培养基上，具有正常叶绿素的植株，在上述限定培养基上， 则不能分裂形成大细胞团（愈伤组织）；则不能分裂形成大细胞团（愈伤组织）； 其他方法：其他方法： 如采用显微操作技术也能把单个异核体分

22、离如采用显微操作技术也能把单个异核体分离 出来进行培养。出来进行培养。 第六章体细胞杂交39 4 4、体细胞杂种的鉴定体细胞杂种的鉴定 ? ? 形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察进 行鉴定。行鉴定。 细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定 （如核型）。（如核型）。 生化鉴定：同功酶鉴定。生化鉴定：同功酶鉴定。 分子鉴定：分子鉴定：RFLP鉴定、鉴定、RAPD标记鉴定。标记鉴定。 第六章体细胞杂交40 第六章体细胞杂交41 5 5、体细胞杂种的应用、体细胞杂种的应用： 1 1、植物育种中的核质替换、植物育种中的核质替换 2、细胞质

23、杂种的获得、细胞质杂种的获得 3、远缘杂交创造新物种、远缘杂交创造新物种 4、细胞器的互作研究、细胞器的互作研究 第六章体细胞杂交42 6 6、体细胞杂交面临的困难：、体细胞杂交面临的困难： 融合特性的高效性；融合特性的高效性； 杂种细胞的培养和选择；杂种细胞的培养和选择； 杂种的遗传稳定性控制。杂种的遗传稳定性控制。 第六章体细胞杂交43 1、定义：、定义： 离体条件下离体条件下 用人工的方法把用人工的方法把 不同的细胞通过不同的细胞通过 无性方式融合成无性方式融合成 一个杂合细胞的一个杂合细胞的 技术技术 第六章体细胞杂交44 植物细胞杂交的几个重要进展植物细胞杂交的几个重要进展 l 19

24、601960年，年，KockingKocking用用酶法制备高等植物原生质体酶法制备高等植物原生质体首次首次 获得成功；获得成功； l 19701970年，年，PowerPower首次用首次用硝酸钠为诱导剂硝酸钠为诱导剂进行了较大规进行了较大规 模的原生质体诱导融合；模的原生质体诱导融合； l 19721972年，年，CarlsonCarlson首次获得粉蓝首次获得粉蓝烟草烟草和郎氏烟草的细和郎氏烟草的细 胞杂种，这也是第一个植物细胞杂种；胞杂种，这也是第一个植物细胞杂种； l 19741974年，年，KaoKao将将聚乙二醇诱导融合法聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞应用于植物细胞 融合并建立

25、了相应的融合技术；融合并建立了相应的融合技术； l 19781978年，年，MelchersMelchers获得了第一个属间细胞杂种（番获得了第一个属间细胞杂种（番 茄马铃薯）；茄马铃薯）； l 19811981年，年，ZimmermanZimmerman发明了发明了电融合仪电融合仪，并首次提出了，并首次提出了 电融合概念；电融合概念； l 19871987年，年，SchweigerSchweiger建立了单对原生质体电融合技术建立了单对原生质体电融合技术 程序程序 第六章体细胞杂交45 2、植物细胞融合的程序 植物原生质体分离植物原生质体分离 原生质体纯化原生质体纯化 原生质体融合原生质体融

26、合 细胞杂种的选择细胞杂种的选择 愈伤组织形成器官分化植株再生愈伤组织形成器官分化植株再生 杂种植物鉴定杂种植物鉴定 3 3、植物细胞杂种的选择和鉴定 M1 1）融合体的类型）融合体的类型 M2 2）细胞杂种选择的方法）细胞杂种选择的方法 M3 3）细胞杂种的鉴定）细胞杂种的鉴定 第六章体细胞杂交46 异体融合异体融合：发生在双亲原生质体之间：发生在双亲原生质体之间 第六章体细胞杂交47 自体融合自体融合：发生在亲本原生质体自身：发生在亲本原生质体自身 第六章体细胞杂交48 异体融合： 谐和谐和的细胞杂种：具有双亲全套染色体组的异源的细胞杂种：具有双亲全套染色体组的异源 两倍体；两倍体； 部分谐和部分谐和的细胞杂种：双亲的染色体经逐步排斥，的细胞杂种：双亲的染色体经逐步排斥， 便发生少数染色体