医学免疫学：免疫学检测

1、 免疫学检测免疫学检测 1. 1. 抗原抗体结合特点及影响因素抗原抗体结合特点及影响因素 2. 2. 抗原抗体检测抗原抗体检测 3. 3. 免疫细胞功能检测免疫细胞功能检测 2 1. 1.抗原抗体结合特点及影响因素抗原抗体结合特点及影响因素 特异性特异性 可逆性可逆性 两个阶段两个阶段：不可见（特异性结合）：不可见（特异性结合） 可见（易受影响）可见（易受影响） 适宜适宜的抗原抗体浓度和比例的抗原抗体浓度和比例 3 电解质电解质：生理盐水或含盐缓冲液：生理盐水或含盐缓冲液 温度温度：37 酸碱度酸碱度：PH 68 4 抗原抗原 ( (亲水胶体亲水胶体) ) 抗体抗体 ( (亲水胶体亲水胶体)

2、) 抗原抗体复合物抗原抗体复合物 ( (疏水胶体疏水胶体) ) 电解质电解质 可见反应可见反应 + + 1. 1.抗原抗体结合特点及影响因素抗原抗体结合特点及影响因素 抗原或抗体检测抗原或抗体检测 检测原理：抗原和抗体检测原理：抗原和抗体特异性特异性结合结合 抗原表位与抗原表位与HVR(CDR)HVR(CDR)结合结合 非共价键结合，多种结合力非共价键结合，多种结合力 5 2. 2. 抗原抗体检测抗原抗体检测 亲和力亲和力(affinity)(affinity)：指抗体分子上一个抗原结合：指抗体分子上一个抗原结合 位点与相应抗原表位之间结合的强度，它是位点与相应抗原表位之间结合的强度，它是 抗

3、原抗体间固有的结合力抗原抗体间固有的结合力 亲合力亲合力(avidity)(avidity)：一个抗体：一个抗体分子分子与与整整个个抗原抗原之之 间结合的强度，与抗体结合价、抗原表位数间结合的强度，与抗体结合价、抗原表位数 目等相关目等相关 6 2. 2. 抗原抗体检测抗原抗体检测 2. 2. 抗原抗体检测抗原抗体检测 已知抗原检测抗体已知抗原检测抗体 已知抗体检测抗原已知抗体检测抗原 大分子物质大分子物质 a) a)凝集反应凝集反应 b)b)沉淀反应沉淀反应 c) c)标记技术标记技术 7 a) a) 凝集反应凝集反应 (agglutination reactions)(agglutinat

4、ion reactions) 颗粒性抗原颗粒性抗原( (如细菌、红细胞或表面带有抗如细菌、红细胞或表面带有抗 原的乳胶颗粒原的乳胶颗粒) )与相应抗体结合，在一定条与相应抗体结合，在一定条 件下，出现肉眼可见的凝集物件下，出现肉眼可见的凝集物 定性或半定量定性或半定量 分类：直接凝集、间接凝集分类：直接凝集、间接凝集 8 9 玻片法：玻片法：定性；已知抗体检测抗原；菌种分型、定性；已知抗体检测抗原；菌种分型、 ABOABO血型血型 试管法：试管法：半定量；已知抗原检测有无抗体及抗半定量；已知抗原检测有无抗体及抗 体含量；肥大试验体含量；肥大试验 直接凝集反应直接凝集反应 10 间接凝集反应间接

5、凝集反应 将可溶性抗原吸附或耦联在与免疫无关颗粒性将可溶性抗原吸附或耦联在与免疫无关颗粒性 载体表面载体表面( (红细胞、聚苯乙烯乳胶、活性炭红细胞、聚苯乙烯乳胶、活性炭) )，再，再 与抗体进行特异性结合。与抗体进行特异性结合。 速率散射比浊法速率散射比浊法/ /免疫比浊法：定量免疫比浊法：定量 单向琼脂扩散：定量单向琼脂扩散：定量 双向琼脂扩散：定性或半定量双向琼脂扩散：定性或半定量 免疫电泳：抗原种类分析免疫电泳：抗原种类分析 b)b)沉淀反应沉淀反应(precipitation reactions)(precipitation reactions) 可溶性抗原可溶性抗原与相应抗体结合，

6、在一定条件下，与相应抗体结合，在一定条件下， 形成沉淀物的现象。形成沉淀物的现象。 11 12 速率散射比浊法速率散射比浊法/ /免疫比浊法免疫比浊法 一定量抗体中加入递增量抗原一定量抗体中加入递增量抗原 数量不等免疫复合物数量不等免疫复合物- -浊度浊度 浊度仪浊度仪 标准曲线标准曲线 定量分析定量分析 Ag 浊度浊度 13 14 15 c) c)免疫标记技术免疫标记技术 16 用酶、荧光素、放射性核素、电子致密物用酶、荧光素、放射性核素、电子致密物 质或发光剂或作为示踪剂标记抗体或抗原质或发光剂或作为示踪剂标记抗体或抗原 进行的抗原进行的抗原- -抗体反应抗体反应 高灵敏度高灵敏度 特异性

7、特异性 快速快速 定性、定量、定位定性、定量、定位 c) c)免疫标记技术免疫标记技术 酶免疫测定（酶）酶免疫测定（酶） 免疫荧光技术（荧光素）免疫荧光技术（荧光素） 放射免疫测定法（放射性核素）放射免疫测定法（放射性核素） 化学发光免疫技术（发光物质）化学发光免疫技术（发光物质） 免疫胶体金技术（胶体金颗粒）免疫胶体金技术（胶体金颗粒） 免疫印迹技术（免疫印迹技术（Western blottingWestern blotting） 17 酶免疫测定法酶免疫测定法 抗原抗体反应；酶对底物催化抗原抗体反应；酶对底物催化 酶标仪测定光密度值酶标仪测定光密度值( (OD) )，定量，定量 辣根过氧化

8、物酶辣根过氧化物酶( (HRP) )、碱性磷酸酶、碱性磷酸酶(AP)(AP) ELISAELISA：可溶性抗原或抗体：可溶性抗原或抗体 酶免疫组化：组织或细胞表面抗原酶免疫组化：组织或细胞表面抗原 18 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA)(ELISA) 19 Enzyme linked immunosoborbent assay 将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面， 使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗 涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶 作用于底物后显色来判断

9、结果。作用于底物后显色来判断结果。 20 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(ELISA)(ELISA) 21 免疫荧光技术免疫荧光技术 22 23 放射免疫测定法：放射免疫测定法：放射性核素放射性核素131 131I, I, 125 125I I标记，敏感 标记，敏感 性，激素、药物等微量物质，污染性，激素、药物等微量物质，污染 化学发光免疫分析：化学发光免疫分析：有机分子吸收化学能后发生有机分子吸收化学能后发生 能级跃迁，产生中间体，回复基态，发光。自动发能级跃迁，产生中间体，回复基态，发光。自动发 光分析仪。非放射性，高灵敏度，检测范围宽光分析仪。非放射性，高灵敏度，检测范围宽 免疫金标技

10、术：免疫金标技术：金颗粒高电子密度，金标蛋白黑金颗粒高电子密度，金标蛋白黑 褐色颗粒，肉眼红色斑点。免疫层析法和快速免疫褐色颗粒，肉眼红色斑点。免疫层析法和快速免疫 金渗滤法。金渗滤法。HBsAg, HCG,HBsAg, HCG,抗抗dsDNAdsDNA抗体抗体 蛋白印迹（蛋白印迹（Western blottingWestern blotting） 24 3. 3.免疫细胞功能检测免疫细胞功能检测 免疫细胞的分离免疫细胞的分离 PBMCPBMC分离分离 淋巴细胞亚群分离淋巴细胞亚群分离 免疫细胞功能的测定免疫细胞功能的测定 25 外周血单个核细胞外周血单个核细胞(PBMC)(PBMC) 分离分

11、离 葡聚糖葡聚糖- -泛影葡胺密度梯度离心法：泛影葡胺密度梯度离心法： 根据外周血中各种血细胞比重不同使不同密度的细胞根据外周血中各种血细胞比重不同使不同密度的细胞 呈梯度分布，从而分离出呈梯度分布，从而分离出PBMCPBMC。 离心离心 PBMCsPBMCs 26 淋巴细胞亚群分离淋巴细胞亚群分离 免疫吸附分离法（抗体包被聚苯乙烯培养板）免疫吸附分离法（抗体包被聚苯乙烯培养板） 尼龙毛分离法尼龙毛分离法 E E花环形成分离法花环形成分离法 磁珠分离法（磁珠，磁珠分离法（磁珠，MACSMACS） 荧光激活细胞分选仪分离法（荧光激活细胞分选仪分离法（FACSFACS） 抗原肽抗原肽-MHC-MH

12、C分子四聚体技术（分子四聚体技术（TetramerTetramer） 27 E E花环分离法花环分离法 28 T T B SRBC CD2 磁珠分离法磁珠分离法 MACSMACS 29 磁珠标记目的细胞磁珠标记目的细胞未标记细胞先行流出未标记细胞先行流出 移出磁场后收移出磁场后收 集目的细胞集目的细胞 CD4+T细胞细胞 分离柱分离柱 CD4-T细胞细胞 磁珠 (microbead) 流式细胞分选流式细胞分选FACFAC 30 TetramerTetramer技术分选技术分选 31 免疫细胞功能测定免疫细胞功能测定 32 细胞增殖试验细胞增殖试验 细胞毒试验细胞毒试验 吞噬功能测定吞噬功能测定

13、 细胞因子检测细胞因子检测 抗体形成细胞测定抗体形成细胞测定 皮肤试验皮肤试验 体外实验体外实验 体内实验体内实验 细胞增殖试验细胞增殖试验 33 形态计数法：淋巴细胞转化实验形态计数法：淋巴细胞转化实验 3H-TdR或 或125I-UdR掺入法掺入法 MTT比色法比色法 BrdU或或EdU掺入结合掺入结合FACS测增殖测增殖 CFSE标记测细胞分裂标记测细胞分裂 MTT比色法比色法 34 MTT，(四唑盐，商品名为噻唑蓝四唑盐，商品名为噻唑蓝)可溶性盐，可溶性盐， 掺入细胞掺入细胞 细胞增殖，细胞增殖，MTT形成紫褐颗粒形成紫褐颗粒 异丙醇溶解为蓝紫色异丙醇溶解为蓝紫色 测测OD值值 简便，

14、无污染简便，无污染 BrdUBrdU掺入结合掺入结合FACSFACS测增殖测增殖 35 BrdU(5-溴脱氧尿苷溴脱氧尿苷)可在细胞合成可在细胞合成DNA时替代胸腺时替代胸腺 嘧啶（嘧啶（T），后通过加入荧光标记的抗），后通过加入荧光标记的抗BrdU抗体，抗体， 利用流式细胞仪检测利用流式细胞仪检测BrdU掺入率，从而反映细胞增掺入率，从而反映细胞增 殖水平殖水平 CFSECFSE标记测细胞分裂标记测细胞分裂 36 3 day 6 day 2- 2-羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE(CFSE或或CFDA-SE)CFDA-SE) 可穿过细胞膜、不可逆地与胞内

15、蛋白和膜表面蛋白结合可穿过细胞膜、不可逆地与胞内蛋白和膜表面蛋白结合 的荧光染料。的荧光染料。 当细胞分裂时当细胞分裂时, , CFSECFSE标记荧光可平均分配至标记荧光可平均分配至2 2个子代细胞个子代细胞 中，因此，中，因此，CFSECFSE含量减少的细胞代表增殖的子代细胞。含量减少的细胞代表增殖的子代细胞。 细胞毒试细胞毒试 验验 37 51 51Cr Cr释放法：释放法： 计数仪计数仪 乳酸脱氢酶（乳酸脱氢酶（LDHLDH）释放法：光度计测定）释放法：光度计测定 细胞染色法：台盼蓝染色细胞染色法：台盼蓝染色 凋亡细胞检测法凋亡细胞检测法 形态学形态学 琼脂糖凝胶电泳法：梯状琼脂糖凝胶

16、电泳法：梯状DNADNA区带图谱区带图谱 FACSFACS：亚二倍体峰；亚二倍体峰；PI/Annexin-VPI/Annexin-V TUNELTUNEL法：敏感，早期凋亡法：敏感，早期凋亡 FACSFACS：多种方式检测凋亡：多种方式检测凋亡 38 DNADNA分析分析- -亚二倍体峰亚二倍体峰 细胞膜分析细胞膜分析-PS-PS外翻外翻 酶学分析酶学分析-Caspase-3-Caspase-3 细胞因子检测细胞因子检测 39 p生物学检测法生物学检测法 p免疫学检测法免疫学检测法 p分子生物学检测法分子生物学检测法 免疫学检测法免疫学检测法 40 ELISAELISA ELISPOTELISPOT ICS(Intracellular cytokine staining)ICS(Intracellular cytokine staining) CBA(CBA(Cytometric Bead Array,Cytometric Bead Array,微量样本多指微量样本多指 标流式蛋白检测技术标流式蛋白检测技术) ) 41 酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试