基因分子生物学实验：第四节 质粒载体的构建II和细胞转染

1、 RNA的提取，逆转录成的提取，逆转录成cDNA 外源基因的获得（外源基因的获得（PCR）、克隆载体和表达载体的构建和）、克隆载体和表达载体的构建和鉴定鉴定 细胞培养和表达质粒的转染细胞培养和表达质粒的转染，SDS-PAGE和和Western blot 功能实验功能实验 1：目的基因对下游靶基因：目的基因对下游靶基因mRNA水平的影响，水平的影响，RT-qPCR 2：转录调控：转录调控 萤光素酶报告基因的应用萤光素酶报告基因的应用 3：凋亡诱导剂诱导细胞凋亡：凋亡诱导剂诱导细胞凋亡 基因基因DNA的的SNP筛查筛查 一、质粒提取及鉴定 二、细胞转染 基因克隆过程 阳性克隆鉴定 1.目的基因PC

2、R扩增（菌落PCR 或菌液PCR） 2.质粒酶切鉴定 3.菌落电泳 4.DNA测序 质粒提取 碱裂解法碱裂解法 煮沸法 去污剂裂解法 其原理为：染色体DNA远远大于质粒DNA，染 色体DNA为线状分子，而质粒为共价闭合环状 分子。在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大 分子的染色体染色体DNADNA完全变性完全变性，而共价闭环质粒 DNA在将pH调至中性后即可以恢复其天然构象可以恢复其天然构象。 在高盐浓度存在的条件下，染色体DNA和蛋白 质在去污剂SDS的作用下形成沉淀形成沉淀，而质粒DNA 仍为可溶状态可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎 片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DN

3、A仍在 上清中。 溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。 Tris-Cl：维持适当的pH值。 葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。 EDTA： Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，抑制DNase 的活性，抑制微生物生长。 NaOH：使细胞膜结构发生改变，溶解细胞。基因组DNA变性。 SDS：下一步沉淀中包裹蛋白质,染色体DNA等形成的复合物。 醋酸钾：高盐环境，染色体DNA和蛋白质在SDS的作用下形成 沉淀。 醋酸：

4、中和溶液II中的碱。 实验内容：1.利用AxyPrep质粒DNA小量试剂盒提取质粒DNA 改进的SDS碱裂解法，DNA制备膜选择性地吸附DNA RNaseA Buffer S1: 细菌悬浮液，加入RNaseA后，混合均匀，4度储存。 Buffer S2：细菌裂解液。使用前检查是否出现沉淀，应于37度温浴溶解。 Buffer S3：中和液。 Buffer W1：洗涤液。 Buffer W2：去盐液。第一次使用之前加入指定体积的无水乙醇。 Eluent：洗脱液。 实验步骤 1. 取4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12,000g 离心 1min，弃尽上清。 2. 加250l BufferS1 悬

5、浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。 3. 加250l BufferS2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮 的溶液。此步骤不宜超过5min。 * BufferS2使用后立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和BufferS2中的NaOH，降低溶菌效率。 * 避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。 4. 加350l BufferS3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，14,000g离心10min。 * 避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。 5.吸取步骤4中的离心上清并转移到制备管（置于2ml离心管中），12,000g 离心1min，弃滤液。 6.将

6、制备管置回离心管，加500l BufferW1，12,000g 离心1min，弃滤液。 7.将制备管置回离心管，加700l BufferW2，12,000g离心1min，弃滤液；以同样的方法再 用700l BufferW2洗涤一次。弃滤液。 * 确认在BufferW2 中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇。 * 两次使用BufferW2冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。 8. 将制备管置回2ml离心管中，12,000g 离心1min。 9. 将制备管移入新的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加60l 去离子水，室温静置1min。 12,000g 离心1min。 * 将去离子水加热

7、至65将提高洗脱效率。 10.将收集到的DNA用分光光度计法测DNA浓度及纯度。 实验步骤 1.取4ml在LB培养基中培养过夜的菌液，12,000g 离心 1min，弃尽上清。 2.加250l BufferS1 悬浮细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。 3.加250l BufferS2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的 溶液。此步骤不宜超过5min。 * 避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。 4.加350l BufferS3，温和并充分地上下翻转混合6-8次，14,000g离心10min。 * 避免剧烈摇晃，否则将导致基因组DNA的污染。 5.吸取

8、步骤4中的离心上清并转移到制备管（置于2ml离心管中），12,000g 离心1min，弃滤液。 6.将制备管置回离心管，加500l BufferW1，12,000g 离心1min，弃滤液。 7.将制备管置回离心管，加700l BufferW2，12,000g离心1min，弃滤液；以同样的方法再用 700l BufferW2洗涤一次。弃滤液。 8.将制备管置回2ml离心管中，12,000g 离心1 min。 9.将制备管移入新的1.5ml离心管中，在制备管膜中央加60l去离子水，室温静置1min。 12,000g 离心1min。 * 将去离子水加热至65将提高洗脱效率。 10.将收集到的DNA用

9、分光光度计法测DNA浓度及纯度。 2. 质粒浓度，纯度测定分光光度计法测DNA浓度及纯度 DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处。 当OD2601时，dsDNA浓度约为50g / ml；ssDNA浓度约为37g / ml；RNA浓度约为 40g / ml；寡核苷酸浓度约为30g / ml 经验值： 纯DNA：OD260/OD2801.8(1.9,表明有RNA污染；1.6，表明有蛋白质、酚等污染） 纯RNA：1.7 OD260/OD2802.0（1.7时表明有蛋白质或酚污染；2.0时表明可能有 异硫氰酸残存） 1.ddH2O清洗点样孔，擦干（上下两面） 2.

10、点样孔滴加 2 ul ddH2O 3.开软件，选择检测项目第一项核酸，进入系统点击“OK” 4.擦干上样孔，滴加 2 ul buffer，确认右边检测样品类型DNA，点 左上角“Blank” 5.擦干上样孔，滴加 2 ul 样品，修改右边样品ID，点左上角 “Measure” 3. 酶切反应：EcoRI 酶切反应：KpnI + XhoI 说明书：酶活性定义，适用buffer，双酶切条件，酶切温 度，甲基化是否影响酶切等。 在37，反应1小时，将1微克的DNA完全分解的酶量定义为1个活 性单位，即1U。 3个白斑个白斑 10X Buffer EcoRI2 l EcoRI0.5 l plasmid

11、1g H2O补齐 total20 (l) 37 ，2小时 P53/pcDNA4.0 10X Buffer CutSmart2 l KpnI1 l XhoI1 l plasmid1g H2O补齐 total20 (l) 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 上样顺序 1234567891011 白斑1白斑2白斑3P53 pcDNA4.0Marker白斑1白斑2白斑3P53 pcDNA4.0 _ _ 提取质粒 酶切质粒 400ng左右 + 1ul loading buffer 酶切产物加入4 ul 6*loading buffer， 混匀上样12 ul 电泳100V，10-15分钟 二、细胞转染 1.目

12、的细胞：293A cells 2.表达载体：pCMV-p53-flag 3.转染方法：脂质体（VigoFect） 电穿孔，病毒感染，显微注射等。 VigoFectVigoFect转染原理及步骤转染原理及步骤 阳离子非脂性物质，可与DNA形成稳定的复合物，透过细胞膜进入细胞。 1. 准备细胞（转染时60-80%为宜）。 2. 稀释DNA：轻轻混匀 2g/孔（6孔板）, DMEM稀释至100 l。 1g/孔（24孔板）, DMEM稀释至50 l。 3. 稀释转染试剂：轻轻混匀，放置5min。 1l/孔（6孔板），DMEM稀释至100 l。 0.5l/孔（24孔板），DMEM稀释至50 l。 4.

13、DNA与转染试剂混合：稀释的转染试剂逐滴加入稀释的DNA溶液 中，轻轻混匀，室温放置15min。 5. 293A细胞换液 6. 转染工作液逐滴加入细胞培养液中，混匀，培养即可。 7. 24小时后观察细胞转染情况，48小时后收集细胞。 具体步骤 6孔板 1.pCDNA4.0 3孔 2.pCMV-p53-flag 3孔 1.准备细胞（转染时60-80%为宜）。 2.稀释DNA：稀释后轻轻混匀。 DMEM 300l + pCDNA4.0 6g (_l) DMEM 300l + pCMV-p53-flag 6g (_l) 3.稀释转染试剂：7l/管，管，1管，用管，用DMEM稀释至稀释至700l。轻轻

14、混匀，放置5min。 4.DNA与转染试剂混合：稀释的转染试剂300l/管逐滴加入稀释的DNA溶液中。 含转染试剂的含转染试剂的DMEM稀释液稀释液 300l + pCDNA4.0 6g + DMEM 300l 含转染试剂的含转染试剂的DMEM稀释液稀释液 300l + pCMV-p53-flag 6g + DMEM 300l 5.轻轻混匀，室温放置15min。 6.293A细胞换液，2ml/孔。 7.转染工作液逐滴加入细胞培养液中200l/孔，混匀，培养即可。 8.24小时后观察细胞转染情况，48小时后收集细胞。 pCDNA4.0pCDNA4.0 ( (蛋白样品蛋白样品) ) pCDNA4.

15、0pCDNA4.0 (RNA(RNA样品样品) ) pCDNA4.0pCDNA4.0 (RNA(RNA样品样品) ) pCMV-p53-flagpCMV-p53-flag ( (蛋白样品蛋白样品) ) pCMV-p53-flagpCMV-p53-flag (RNA(RNA样品样品) ) pCMV-p53-flagpCMV-p53-flag (RNA(RNA样品样品) ) 24孔板 1.pCDNA4.0+共转质粒 8孔 2.pCMV-p53-flag+共转质粒8孔 3.GFP 1孔 4.转染试剂 1孔 pCDNA4.0pCDNA4.0 pCMV-p53-flagpCMV-p53-flag pCD

16、NA4.0pCDNA4.0 pCDNA4.0pCDNA4.0 pCMV-p53-flagpCMV-p53-flagpCMV-p53-flagpCMV-p53-flag pCDNA4.0pCDNA4.0 pCMV-p53-flagpCMV-p53-flag GFP转染试剂 1.准备细胞（转染时60-80%为宜）。 2.稀释DNA：稀释后轻轻混匀。 DMEM 400l + 共转质粒共转质粒 4g （16 l ） + pCDNA4.0 4g (_l) DMEM 400l + 共转质粒共转质粒 4g （16 l ） + pCMV-p53-flag 4g (_l) DMEM 50l + GFP 1g （

17、2 l ） DMEM 50l 3.稀释转染试剂：10l/管，管，1管，用管，用DMEM稀释至稀释至1000l。轻轻混匀，放置5min。 4.DNA与转染试剂混合：逐滴加入稀释的DNA溶液中，轻轻混匀，室温放置15min。 含转染试剂的含转染试剂的DMEM稀释液稀释液400l + DMEM 400l + 共转质粒共转质粒 4g + pCDNA4.0 4g 含转染试剂的含转染试剂的DMEM稀释液稀释液400l + DMEM 400l + 共转质粒共转质粒 4g + pCMV-p53-flag 4g 含转染试剂的含转染试剂的DMEM稀释液稀释液50l + DMEM 50l + GFP 1g 含转染试剂的含转染试剂的DMEM稀释液稀释液50l + DMEM 50l 5.293A细胞换液，1ml/孔。 6.转染工作液逐滴加入细胞培养液中100l/孔，混匀，培养即可。 7.24小时后观察细胞转染情况，48小时后收集细胞。 转染后转染后4848小时后收集细胞小时后收集细胞: : RNA样品的准备: 1.吸出培养孔中的培养基,完全吸干。 2.每孔加入1ml Trizol 溶解细胞,吹吸均匀后转移至1.5mlEP管中。 3.冻存于-80冰箱，用于后续RNA的提取及PCR定量 蛋白质样品的准备: 1.吸出培养孔中