qPCR原理与分析方法

1、qPCR原理与分析方法 qPCRqPCR系统系统 从从RNA提取到荧光定量提取到荧光定量 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 内容概要内容概要 1 实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理 1 实时荧光定量实时荧光定量PCR的几种方法的几种方法 1绝对定量分析方法简介绝对定量分析方法简介 1相对定量分析方法简介相对定量分析方法简介 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 实时定量实时定量PCR技术的概念技术的概念 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每 一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标

2、准曲线 的分析对起始模板进行定量分析 与常规 PCR技术比较： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法 对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 实时荧光定量实时荧光定量PCR技术涉及的概念技术涉及的概念 扩增曲线 荧光阈值 Ct值 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集 荧光基团 荧光检测元件 扩增曲线扩增曲线 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原

3、理与分析方法 荧光信号的域值（荧光信号的域值（threshold threshold ）： 0 前15个循环信号作为荧光本底信号 （baseline），即样本的荧光背景值和阴 性对照的荧光值 0 荧光域值的缺省设置是315个循环 的荧光信号的标准偏差的10倍 0 手动 设置：原则要大于样本的荧光背 景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽 量选择进入指数期的最初阶段，并且保证 回归系数大于0.99 0 真正的信号:荧光信号超过域值 荧光域值荧光域值 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 CtCt值的定义：值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定

4、的 阈值时所经过的扩增循环次数 C(t) value Ct值值 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数 纵轴：荧光信号量纵轴：荧光信号量 CtCt值的特点：值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值极具重现性 Ct值的重现性值的重现性 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 Ct值定量数学原理值定量数学原理 理想的PCR反应 XnX0 2n * Xn：第：第n次循环后扩增产物数量次循环后扩增产物数量 X0 ：起始模板数量：起始模板数量 n：扩增循环数：扩增循环数

5、 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 Ct值定量数学原理值定量数学原理 非理想的PCR反应 XnX0 （1En）n * Xn：第：第n次循环后扩增产物数量次循环后扩增产物数量 X0 ：起始模板数量：起始模板数量 n：扩增循环数：扩增循环数 En：扩增效率：扩增效率 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 Ct值定量数学原理值定量数学原理 在扩增产物达到荧光阈值时 XCtX0 （1En）CtM （1） * XCt ：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，：荧光扩增信号达到阈值时扩增产物的量，在阈值设定以后，

6、 它是一个常数，定为它是一个常数，定为M 方程式（1）两边同取对数得： LogMLogX0 * （1En）Ct （2） 整理方程式（2）： LogX0 Log M CtLog（1En） 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 Cycle number Flourescenc Ck 104 Ck 102 Sample Cycle number Log of DNA concentration 0 模板DNA量越多，荧光达到域 值的循环数越少 0 Log浓度与循环数呈线性关系 Ct值定量数学原理值定量数学原理 LogX0 Log M CtLog（1En） 800

7、免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 . mRNA表达的研究：如细胞因子、肿瘤耐药基因表达分析 . DNA拷贝数的定量：如易位基因的检测 . 单核苷酸多态性（SNPs）分析 . 基因型分析：杂合或纯合子 . 临床检测：病毒感染的定量监测 实时荧光定量实时荧光定量PCR技术的应用技术的应用 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 内容概要内容概要 1 实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理 1 实时荧光定量实时荧光定量PCR的几种方法的几种方法 1绝对定量分析方法简介绝对定量分析方法简介 1相对定量分析方法简介相对定量分析方法简

8、介 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 非特异性荧光标记： 1.SYBR Green 特异性荧光标记： 2.TaqMan 3.Molecular Beacon 常用荧光标记方法常用荧光标记方法 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 TaqMan-水解型杂交探针水解型杂交探针 + 5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 + 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) + 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 + Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解

9、探针 TaqMan方法方法 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 TaqMan探针工作原理探针工作原理 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 + 标记荧光的发夹探针 + 环与目标序列互补 + 茎由互补配对序列组成 环 茎 荧光素 淬灭剂 分子信标分子信标(Molecular Beacon) 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 SY

10、BR Green 法法 SYBR Green 结合到DNA小沟部位示意图 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 几种方法的应用比较几种方法的应用比较 方法优点缺点适用范围 SYBR Green I 方法 适用性广 灵敏 方便 便宜 引物要求高 易出现非特异性带 适合科研中对各种目的 基因定量分析，基因表 达量的研究，转基因重 组动植物的研究 TaqMan 方法 特异性高 重复性好 价格高 只适合特定目标 病原体检测，疾病耐药 基因研究,药物疗效考核 遗传疾病的诊断 Molecular Beacon法 (分子信标) 高特异性 荧光 背景低 只适合特定目标 设

11、计困难 价格高 特定基因分析 SNP分析 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 0 起始模板的测定 0 基因型的分析 0 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规 PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一 引物、引物二聚体、变异产物、多种产物 SYBR Green 法的应用法的应用 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 Sample 25 定量的方法定量的方法 0 Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准 品可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 0 根据样品Ct值，就

12、可以计算出样品中所含的模板量 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 融解曲线融解曲线分析产物的特异性分析产物的特异性 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确 融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧 光，因此定量不准确 非特异性产物非特异性产物 融解曲线分析融解曲线分析 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项 样品制备样品制备 模板准备模板准备 引物设计引物设计 反应条件优化反应条件

13、优化 浓度确定浓度确定 技能要求技能要求 环境要求环境要求 误差控制误差控制 数据分析数据分析仪器介绍仪器介绍 RT 上机上机 反应体系优化反应体系优化 试剂选择试剂选择 分析方法分析方法 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 样品制备样品制备 模板准备模板准备 引物设计引物设计 反应条件优化反应条件优化 浓度确定浓度确定 技能要求技能要求 环境要求环境要求 误差控制误差控制 数据分析数据分析仪器介绍仪器介绍 RT 上机上机 反应体系优化反应体系优化 试剂选择试剂选择 分析方法分析方法 SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项 800免费电话：免费

14、电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 样品制备样品制备环境要求环境要求 模板准备模板准备 数据分析数据分析 RT 上机上机 浓度确定浓度确定 SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项 无RNase环境 使用无RNase耗材 专用RNase-free工具 分光光度计检测 电泳检测 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 RT 反应体系优化反应体系优化 试剂选择试剂选择 样品制备样品制备 模板准备模板准备 数据分析数据分析 上机上机 AMV M-MLV Quant Super 下游反应数确定反转录体积 选择应用引物 SYBR法实验流程及

15、注意事项法实验流程及注意事项 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 模板准备模板准备 引物设计引物设计 浓度确定浓度确定 环境要求环境要求 误差控制误差控制 RT 样品制备样品制备 数据分析数据分析 上机上机 核酸制备区 反应液制备区 制作标准曲线 设定浓度区间 评价引物 使用mix降低系统误差 设置重复（3次） 设置空白和阴性对照 GC：5060 Tm：5065 单个碱基重复4个 无二级结构 扩增长度：100200bp 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 反应体系优化反应体系优化 上机上机 反应条件优化反应条件优化

16、 RT 样品制备样品制备 模板准备模板准备 数据分析数据分析 反应体积5ul，推荐2050ul Mg2调节，酶活调节 引物浓度优化，模板量优化 退火温度优化：梯度PCR 延伸时间：产物长度决定 扩增效率：90110 重复性：std0.2 标准曲线：R0.99或R2 0.98 SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项 标准品 待测样本 阳性对照 阴性对照 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 技能要求技能要求 误差控制误差控制 仪器介绍仪器介绍 上机上机 试剂选择试剂选择RT 样品制备样品制备 模板准备模板准备 数据分析数据分析 自配 realmas

17、termix RCHO-Lightcycler series ROTOGEN-RG series BIO-RAD Opticon series ABI-7series BioerLinegene series 分装控制 内参控制 机器校正控制 SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 数据分析数据分析仪器介绍仪器介绍分析方法分析方法 上机上机 RT 样品制备样品制备 模板准备模板准备 相对定量：2Ct法 绝对定量：标准曲线法 SYBR法实验流程及注意事项法实验流程及注意事项 800免费电话：免费电话：800-8

18、10-2177 qPCR原理与分析方法 内容概要内容概要 1 实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理 1 实时荧光定量实时荧光定量PCR的几种方法的几种方法 1绝对定量分析方法简介绝对定量分析方法简介 1相对定量分析方法简介相对定量分析方法简介 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 绝对定量简介绝对定量简介 标准样品的制备标准样品的制备 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 绝对定量简介绝对定量简介 拷贝数的计算 待测样本浓度（ng/ul）OD26040稀释倍数 样本分子量=碱基数324 待测样本拷贝数（copies/

19、ul）=待测样本浓度/样本分子量61014 倍比梯度稀释方法： 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 扩增效率（E）：扩增效率与标准曲线的斜率相关：E=101/斜率，理论的扩增效率理 论值应该为2，即每 一个循环的PCR产物都翻倍，那么2101/斜率，优化的标准曲线 斜率应该为3.32 E用每个循环扩增模板百分比表示即：E（E1）100 例如E1.95，那么E（

20、1.951）100，即每次循环有95模板被扩增 扩增效率概念 绝对定量简介绝对定量简介 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 绝对定量举例：HBV病毒检测 Sample: HBV阳性标准品，分别含有5103、5104、5105、5106 copies /ml copies/mlCt1Ct2Mean CtSTD 510328.1828.6428.410.16 510425.2525.1425.190.04 510522.1122.4622.280.12 510618.6318.9218.770.10 BLANKNoneNone 实验数据： 绝对定量简介绝对定

21、量简介 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 标准曲线制作举例 扩增效率（E）计算 E=10-1/斜率 =10-1/-3.17 =2.03 E%=(2.03-1) 100% =103% 标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线 y = -3.17x + 37.52 R2 = 0.9988 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 标准曲线制作举例 如未知样本Ct为20.5 标准曲线制作：利用MeanCt作图可得到标准曲线 将Ct值带入线性方程： 20.5= -3.1726 X + 37.52 X= 20.5-37.

22、517 -3.1726 =5.36 QuantityUnknown=105.36 =229087 copies y = -3.17x + 37.52 R2 = 0.9988 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 内容概要内容概要 1 实时荧光定量实时荧光定量PCR原理原理 1 实时荧光定量实时荧光定量PCR的几种方法的几种方法 1绝对定量分析方法简介绝对定量分析方法简介 1相对定量分析方法简介相对定量分析方法简介 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 分析方法： 2 Ct 2 Ct Pfaffi法 相对定量简介相对定量简介 应用举例：测定测定Jun基因在某因子作用前后的表达变化基因在某因子作用前后的表达变化 800免费电话：免费电话：800-810-2177 qPCR原理与分析方法 2Ct法应用举例：测定测定Jun基因在某因子作用前后的表达变化基因在某因子作用前后的表达变化 比率（处理后/处理前）2 Ct（处理后）Ct（处理前）2 Ct2 （1618）4 2 Ct法：假设扩增效率（E=101