有机物分离与纯化方法、柱层析一些技巧

1、有机化合物的分离与纯化方法有机化合物的分离与纯化方法 v分离纯化是有机化合物分析必不可少的过程分离纯化是有机化合物分析必不可少的过程 v1、有机化合物样品分析，首先要进行分离纯 化步骤,才能达到分析结果准确的目的。 v2、不同的有机化合物样品有不同的纯化方 法。 v3、依据样品中有机化合物的性质和杂质的 性质差别来选择分离纯化的方法 一、固体一、固体有机物分离提纯方法有机物分离提纯方法 二、液体有机物分离提纯方法二、液体有机物分离提纯方法 v液体有机化合物液体有机化合物蒸馏法蒸馏法 v蒸馏法原理蒸馏法原理：依液体混合物中各组分沸点不同而 分离。 v关键关键：控制温度缓慢上升，收集不同温度范的围

2、馏 份。 v蒸馏方法分类：分类： 常压蒸馏适用于b.p较低，在b.p时不分解的物质。 减压蒸馏适用于b.p较高，或在b.p发生分解的物质。 水蒸气蒸馏适用于不与水反应，b.p较高的物质。 、常压蒸馏 ）装置不扭、歪、漏 ）温度计水银球位置 ）加沸石 ）容器中液体体积 ）热源选择 ）馏出速度 v = 2 D/S ）液体的干燥 v液体含水：干燥剂脱水后蒸馏（干燥剂不可进入蒸 馏体系）（容量与速度） v干燥剂种类及性能： vCaO 中、碱性化合物可用，脱水力强。 vCaCl2 卤烃、烃、酯、醚可用（醇、酸不可用） 脱水力强。 vNa2 SO4多数溶剂可用，脱水能力不强。 vK2 CO3碱性化合物、醇

3、、酯脱水力较强。 vP2 O5卤烃、烃（醇、酸不可用），脱水力强。 vNaOH 饱和烃、肼、胺（酸性物质不可用） v分子筛多数可用，脱水力强。 、减压蒸馏、减压蒸馏 ）减压蒸馏的原理 液体的沸点随液面压强降低而降低。 v对沸点和压强进行估算。 过如下途径进行估算。 v）查T-P关系图 A线标减压沸点数据， B线正常压强沸点 C线压强刻度（mmHg). A B C 沸点低 压强小 压强大 ）用近似公式估算 v用近似公式 lgP=A+B/T v P 蒸汽压; v T 绝对温度; v A 、B为常数（可以通过化合物物理性质手 册或者化工手册查阅） ）减压蒸馏装置 v仪器装置 v带橡皮套的毛细管、容积

4、 =1/2V、不用平底接受器 v减压泵 v（水泵7-20mmHg）机械 泵（油泵） 0.1mmHg （要 连接吸收装置） 减压蒸馏装置图减压蒸馏装置图 注意：负压与正压 操作一样要带护目 镜防爆！ ）减压蒸馏操作步骤 vA、查蒸馏系统可否达应有真空度 开始：开始：关安全瓶活塞，紧毛细管螺丝夹，开抽气泵， 压力达要求。 停止：停止：慢慢打开安全瓶活塞 ，压力与外界平衡， 松毛细管螺丝夹，关抽气泵。 vB、加液料、关活塞、开抽气、调毛细（气泡与线）、达到 压力 后（平衡、稳定）再 加热。 vC、热源温高于b.p20-30，压力不稳调热源。 v 馏出速度0.51D/S vD、多组分蒸馏：馏出温度上升

5、时转换接收器（使用多头接 受器）。 vE、蒸馏完后 先撤热源、再开活塞 ，压力平衡后关气泵与打开 毛细管夹。 可旋转多用接头 、旋转浓缩蒸馏法、旋转浓缩蒸馏法 v一般用于提取液浓缩 v）浓缩原理 v使溶剂在瓶壁形成一层薄膜，扩大蒸馏 面积，提高蒸馏速度。 v）应用条件 v压力400600mmHg v转速50160转/分。 、水蒸汽蒸馏 v）主要用途 v沸点比较高，容易热分解，或者糊状混合物中的成 分。 v）蒸馏原理 v混合体系中总的蒸汽压等于各组分蒸汽分压之和。 被蒸馏体系接近100时，水的蒸汽压接1atm，故 被蒸馏的物质蒸汽可以和水蒸气合计等于1atm，从 而在接近100从混合物被蒸馏出来

6、。 v）必须满足的条件： v不与水反应 v在100时不低与5mmHg的蒸汽压 ）操作步骤：）操作步骤： va、装好仪器 vb、调热浴温度高于b.p10以上 vc、冷却水接蛇形冷凝管（低于b.p20） vd、接真空泵（不低于300mmHg） ve、加热、开自动加液旋塞， vf、开动电机使旋转，收集馏出液。 v g、关电机、除热源、关加液旋塞、压 力平衡停抽气 ）水蒸气蒸馏操作 v水蒸气蒸馏操作与常压蒸馏操作类似，其装置比常 压蒸馏装置多一个水蒸气发生器。 水蒸气发生器 T形管 安全管 三、柱层析分离（固液）有机物 v1、柱层析技术用途 v架设一个带活塞的玻璃柱，填入吸附剂，可 以用于分离混合物是

7、分离混合物的重要方法。 v2、柱色谱的几种技术指标 直径与长度比：1：101：40 短而粗的柱子，分离快，分离效果差 长而细的柱子，分离慢，分离效果好 色谱柱的分离效果还与吸附剂和洗脱剂的选择、 柱子的装填质量有关。 3、柱层析原理与分类 v）原理：混合物被束缚在色谱柱的固定相 上，流动相自上而下流经固定相，带动被分 离组分向下移动。与固定相作用力大的组分 在流动过程中留在了后面，与固定相作用力 小的组分在流动过程中跑在了前面（略）， v）柱层析分类：吸附、分配、凝胶 vA、吸附色谱柱：吸附剂固体表面吸附各成分。 vB、分配色谱柱：惰性载体表面涂高沸点液体， 被分离物在淋洗剂与高沸点液体之间溶

8、解分 配。 vC、凝胶色谱柱：多凝胶填粒、淋洗，凝胶网 眼大小筛分不同尺寸的分子 4、吸附柱的装填要求 v吸附剂要装填均实，淋洗剂等速水平下降， 分离效果好。 v）干装：先装洗脱剂于柱内，吸附剂通过 漏斗直接装入盛有洗脱剂的色谱柱（边装边 敲），最后应使吸附剂上有一薄层溶剂。 v为保持柱上有平整表面，最上层可加石英砂。 v）湿装：先装洗脱剂于柱内，用淋洗剂 调 成糊状的吸附剂慢慢加入，慢慢沉降 。最后 应使吸附剂上有一薄层溶剂。亦应边加边敲。 5、吸附剂的分类 v吸附剂种类：氧化铝、硅胶、弗罗里硅土、纤 维素、氧化镁、碳酸钙、活性碳等。 v吸附剂的要求：对被吸附物有一定的作用，与 被吸附物，淋

9、洗剂无化学反应。 v吸附能力：与颗粒粗细有关，粗则流速快，分 离效果差；粗则流速慢，分离效果好。 v氧化铝分类：酸性、中性、碱性三种 v酸性：HCl浸泡，蒸馏水洗pH4.， 用于分离酸性物质 v中性：pH为.左右，用于分离中性物质 v碱性：pH，用于分离碱性物质或烃类。 6、吸附剂的活性 v含水量越低活性越高。 v氧化铝依含水量分为五级，含水量分别为； ； v硅胶五级对应含水量为； ； v一般制备方法：烘至 无水（小时）加入相应水量得相应级别。 v极性越强吸附力越大。 7、常见吸附剂的处理 v中性氧化铝：活化h，使用前 130活化 5h，可保一周，过期重新活化； 时中性变碱性。吸附色素最佳。

10、v硅胶：水玻璃加盐酸，沉淀脱水得无定形多 孔物质。表面Si-OH称硅醇，与不饱和化合物 或极性基形成氢键而吸附；Si-O-Si氧桥可水 解，称溶解度，pH = 以上显著，故不可用 强碱性淋洗液； v硅胶层析性能与多孔骨架及坑穴体系密切相 关，加热有变。活化温度不超过。 130活化h备用。用于有机氯有机化合物 分离。 8、混合吸附剂柱 v用混合吸附剂装柱柱可以用于纯化多种杂质 的样品。不同的有机化合物样品的提纯用不 同的混合柱。常见混合柱如下。 v活性碳氧化镁，用于有机磷有机化合物分 离。 v活性碳纤维素，由于有机磷，有机氯有机 化合物分离。 v弗罗里硅土中性氧化铝酸性硅藻土，用 于植物食品中有

11、机氦有机化合物净化； v活性碳中性氧化铝，CHCl3淋洗由于提纯 有机磷有机化合物。 9、淋洗剂选择 v）极性递增顺序： vR-X C=C R-OCH3 R-CO2R R2C=O v R-CHO R-SHR-NH2 R-OHR-CO 2H v）吸附力与淋洗剂性质有关。 v选淋洗剂时应考虑被洗脱物质的极性与溶解度。 v极性大的化合物用极性大的淋洗剂洗脱； v极性小的化合物用小极性淋洗剂洗脱； v几种极性差别大的混合物用几种不同极性的淋洗剂分 批洗脱。 v亦可以用混合淋洗剂。 10、淋洗剂洗脱能力与洗脱要点 v）常用淋洗剂洗脱能力： v正己烷CCl4C6H5-CH3C6H6CH2Cl2 CHCl3

12、Et 2OCH3CO2C2H5Me2CO C3H7OHMeOHH2O v）淋洗要点：连续不断，不快不慢，吸 附剂不露出液面。 v）淋洗速度V=1滴/S为宜。 v洗脱快则交换不平衡； v洗脱慢则具有大表面的吸附剂使某些成分 破坏。 ）淋洗曲线 v分段收集标准品洗脱液进行含量分析，绘成 的淋洗剂体积样品含量曲线。 v用途 v使要收集的组分尽可能收集完全，无色化合 物用标准品进行实验。分段收集洗脱液进行 含量分析，绘成曲线。 v确定淋洗过程应收集的 洗脱液体积。 可以确定淋洗所需溶剂 。 含量 淋洗剂体积 11、分配柱与凝胶渗透柱层析法 v分配柱层析法：把有机氯有机化合物从极性 小的有机化合物样品中

13、分配到极性大的溶剂 中去。主要分离含脂肪、蜡质试样的有机氯。 v凝胶渗透柱层析法：用凝胶sephadex LH-20 作有机磷有机化合物.分离净化。 v被纯化物质的分子量范围：有机磷200-400； 色素500-900。用118g葡聚糖LH-20装柱。乙 醇或丙酮淋洗；淋洗速度V=4.5ml/h。 v多数有机磷（.水平0.050.005ppm）淋洗 体积在305428ml；回收率可达66-98%。 六）薄层色谱分离提纯 v比柱色谱更加应用广泛的分离分析手段。 v用于分离提纯具有简单快速的特点。分离 容量不及柱色谱大，效果也不及柱色谱好。 v薄层分类：吸附与分配色谱， v分配色谱又分正相色谱与反

14、相色谱。 v正相：含水吸附剂（固定相），弱极性流 动相，极性小的移动快。 v反相：钝化吸附剂（固定相），强极性流 动相，极性强的移动快。 薄层吸附色谱 v1、固定相：硅胶、氧化铝活化。 va加石膏为G型，不加为H型，加荧光剂为GF或HF vb正相分配色谱：纤维素或用缓冲水溶液处理过的 硅胶、或用极性有机溶剂处理过的硅胶。 vC、反相分配色谱固定相：用硅酮、石蜡等非极性 溶剂处理过的硅胶或纤维素。 vD、薄层涂层：薄层自然晾干后进行活化。 vE、活化温度与时间： v硅胶板105-120，1h； v氧化铝板：70，40min。 2、吸附剂选择 吸附剂用途吸附剂用途 硅胶吸附，分配氧化铝吸附，分配

15、硅藻土 分配 纤维素 分配 氢氧化钙 吸附聚酰胺吸附 离子交换树脂离子交换氧化镁吸附，分配 吸附剂粒度的要求：5-50m。 粒度太大推进快，影响分离； 粒度太小则展开慢，出现拖尾或横向扩散过度。 3、展开剂选择 v与淋洗剂标准一致。官能团极性如下： vRHRClCH=CH2ROCH3RNO2 RNMe2RCOCH3RCO2RR2C=O RCHORSHRNH2RNHCOR ROHRCONH2RCO2H v一般单一展开剂没有很适合的极性，多用 相容的展开剂混合，以调节展开剂极性。 7、一般薄层色谱实验操作 v点样展开显色计算Rf值 v点样：在距薄板下沿1cm处的水平线上，毛细 管口液滴与薄层表面相

16、切，切忌玻璃管戳破薄 层，可以重复点样。 v展开：薄层板下沿水平插入层析缸，展开剂不 能淹没样点，缸内充满展开剂蒸汽，要盖上盖 子，展开剂水平线上升，接近薄层上沿时为止。 v显色：大多物质要进行物理或者化学方法显色。 v薄层板从层析缸取出，在展开剂前沿作一记号， 待展开剂挥发干后显色。 v物理方法：紫外灯照射；碘蒸汽熏蒸等。 v化学方法：可以产生有色物质的反应。 8、影响Rf的因素 v薄层厚度薄层厚度 v吸附剂种类、活度、展开剂极性、展层的饱和度 v展开方法展开方法：一般不加黏合剂，薄板水平展开。 v单向上行一次展开，倾角70-80 vRf值接近的物质要多次单向展开。每次可用同一展 开剂，也可

17、不同的展开剂。 v双向展开法：用正方形薄板，展开剂一次走到上沿 后取出风干，旋转90后再展开 v边缘效应边缘效应：溶剂前沿线一般朝下弯造成Rf不准，且 使色斑大小及形状不规则 v显色是配合薄层进行鉴别。 四、化学提纯法 v化学净化法是使杂质与某种试剂发生化 学反应除掉或者消除干扰。 v有机化合物提取液干扰分析成分很大程 度是脂肪与色素。 v最常用的化学净化法是用酸处理对酸稳 定的有机化合物或用碱处理对碱稳定的 有机化合物来除杂。 v1、酸净化：用浓H2SO4或浓H2SO4与发 烟硫酸（1：1）混合液在分液漏斗中处 理萃取液，可以除脂肪、色素。 v 浓硫酸净化原理 v不饱和脂肪，色素中含有C=C

18、，可以和浓 H2SO4加成生，成可溶于浓H2SO4的化合 物而除去。 R R H2SO4 R R OSO3H 硫酸除杂注意事项 v）对酸不稳定的有机化合物如有机磷、氨 基甲酸酯不可用。 v）酸体积与提取液体积之比为1：10；一般 净化两次。 v）提取液脱水不完全或潮天加发烟 H2SO4 效果较好； v）防乳化：第一次净化轻摇，第二次净化 猛摇，已乳化可以加水消乳 柱层析的几个技巧 v1、硅胶的使用 v2、洗脱剂的使用 v3、装柱子的技巧 v4、上样的技巧 v5、过柱的技巧 1、硅胶的使用 初做柱层析很容易把柱子装得长了或短了，有时还会有大 量的硅胶剩余，浪费硅胶，这主要是对硅胶等固定相的使用的

19、 量没有掌握。柱层析用的硅胶一般是100-200目，100毫升硅 胶的质量在47克左右，如果装一个直径是2.8厘米的柱子，可 以装18厘米高。为了避免浪费硅胶和溶剂，最初学习装柱时最 好对实验室中各种不同规格的柱子摸摸底。方法很简单：用量 筒量出100毫升干硅胶，直接倒入各种规格的柱子中，敲实， 用刻度尺量出硅胶在柱子中的高度，这样就可以做到心中有数 了。一般在装柱的时候可以根据实验所需柱子的高度来调整硅 胶的使用量，这样就可以大大地节省硅胶的使用，避免造成没 有必要的浪费。称量硅胶时一般称3070倍于上样量，如果极 难分，也可以用100倍量以上的硅胶。 2、洗脱剂的使用 v洗脱剂的极性可用薄

20、层层析来确定，一般以待分离样品Rf值 为0.2-0.3为宜 v选择的洗脱剂应该使两相邻物质Rf值之差最大化。不要认为 在板上爬得高分离的效果就比较好，如果Rf在0.6，即使相 差0.2也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次爬板的 过程，可以通过公式的比较：0.6/0.8一次的分离度，肯定 不如（0.2/0.3）的三次方或四次方大。有时虽然在薄层板上 看到分离的效果很好，但过柱层析时还是很难分开。这主要 的原因就是薄层层析用硅胶比柱层析用硅胶要细得多，所以 分离效果好。 v解决的办法就是降低洗脱剂的极性，一般柱层析用洗脱剂 比薄层层析用的展开剂极性要再降低一倍可以达到比较好 的分离效果。当所分

21、离物质极性跨度较大时，可用采梯度 洗脱的方法，即逐渐增加溶剂的极性，使吸附在硅胶上的 不同化合物逐个洗脱下来。 v常用的展开剂极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统；极性较 大的用甲醇：氯仿系统；极性大的用甲醇：水：正丁醇： 醋酸系统；拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸。 v对于很难分离的化合物，一是增加柱子的长度和直径，二 是减小洗脱剂的极性，这样可以很好地将混合物分开。 v在同样能洗脱的情况下，尽量使用毒性小的洗脱剂。例如， 乙酸乙酯：石油醚系统和二氯甲烷：石油醚系统，在同样 都能洗脱的情况下，应该用毒性小的乙酸乙酯：石油醚系 统。 v另外洗脱剂在过柱子后最好也回收使用，一方面环保，另 一方面也能节省部

22、分经费，缺点是要消耗一定的人工。这 里要注意的是，一般在过柱同时进行的是减压旋蒸，混合 溶剂的比例由于挥发度的不同会导致极性的变化，一般会 使得极性变大，在梯度淋洗时比较合适。还有一般回收的 溶剂中会有少量水分，使用前先要用干燥剂干燥好才能使 用。 3、装柱子的技巧 v柱层析的装柱非常重要，装柱的效果会直接影响层析分离效 果。有湿法装柱和干法装柱等两种方法。 v湿法装柱很简单，使用也最普遍，就是先用比固定相多一倍 的洗脱剂将固定相活成匀浆，柱子底部先用脱脂棉塞紧，然 后倒入洗脱剂将脱脂棉中气泡赶出。用漏斗将活好的固定相 倒入柱子中，打开底部活塞，将柱子中高出固定相的溶剂放 出。期间不断用橡皮棒

23、敲打，将固定相敲实，做到密实均匀 无气泡即可。很多时候用加压的方法可以很高效地装好柱子， 而且在柱子中没有气泡产生。 v干法装柱与湿法装柱刚好相反的是，它是将干燥的吸附剂 从柱子上端直接加入到一个空的柱子中，然后用油泵抽柱 子底部，相当于减压过柱，直到柱子变得很结实，再用淋 洗剂“走柱子”。 v干法装柱的一个缺点就是在装入洗脱剂后，由于溶剂和固 定相之间的吸附放热，所以柱子容易变花，影响分离效果。 解决的方法是：（1）固定相一定要添加结实；（1）一定 要用较多的溶剂“走柱子”，直到柱子的下端不再发烫， 恢复到室温后再撤去压力。无论使用哪种方法装柱，最后 都要求所装的柱子结实、匀称、无气泡。 4

24、、上样的技巧 v上样也有湿法和干法之分：湿法一般用淋洗剂溶解样品，也 可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好。再用胶头 滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁缓慢地均匀加入。在 不用海沙的情况下，尽量不要破坏硅胶面。加样后，打开柱 底活塞，让固定相充分地吸附所加样品。然后再加入一些洗 脱剂，再充分地吸附后将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然 后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。很 多样品在上柱前是粘乎乎的，一般没关系。有的时候上样后 在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现， 是因为硅胶对样品的吸附饱和，而样品本身又是比较好的固 体才会析出，这就需要先重结晶样品，得到大部分的产品后 剩余的产品再柱分。如果不能重结晶也没关系，直接过柱就 行，样品会随着淋洗剂流动而慢慢溶解，最后随着洗脱剂流 出。 v有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如DMF， DMSO等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾）， 这时就必须用干法上柱了。干法过柱是把待分离的样品用 少