流式细胞仪检测凋亡和细胞周期等应用

1、什么是流式细胞仪 流式细胞仪实物 BD FACSVantageBD-Calibur 凡是能被荧光素标记的细胞或颗粒都可用流式细凡是能被荧光素标记的细胞或颗粒都可用流式细 胞仪检测。胞仪检测。 前提这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光前提这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光 源激发源激发 在生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的在生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的一机一机 多用多用的仪器。的仪器。 4. 应用范围应用范围 二、流式细胞仪的工作原理和基本结构二、流式细胞仪的工作原理和基本结构 待测细胞以待测细胞以单个细胞的悬液单个细胞的悬液，经特，经特 异性荧光染料染色，放入样品管，异性荧光染

2、料染色，放入样品管， 吸入流动室。吸入流动室。 流动室充满流动室充满鞘液鞘液，作用：约束样品，作用：约束样品 在喷嘴中心，防止样品靠近喷孔在喷嘴中心，防止样品靠近喷孔 壁堵塞喷孔。细胞排成单列由喷壁堵塞喷孔。细胞排成单列由喷 嘴中心喷出，形成细胞液柱。嘴中心喷出，形成细胞液柱。 液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光。液柱与激光束相交，细胞上的荧光染料被激发产生荧光。 荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析。荧光信号变成电信号输出到计算机，软件分析。 基本结构基本结构 三、 流式细胞仪可检测到的细胞参数 颗粒度颗粒度 细胞大小细胞大小 =前向角散射光（前向角散射光（FSCFSC）细

3、胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 =侧向角散射光（侧向角散射光（SSCSSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的细胞颗粒度及细胞内细胞器的 相对复杂性相对复杂性 血液涂片血液涂片 外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图 荧光染料被激发而发射的光信号。荧光染料被激发而发射的光信号。 定量染色定量染色 荧光信号大小荧光信号大小 被标记组分含量的定量被标记组分含量的定量 多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量多荧光标记胞内多种组分，实现多参数测量 二色镜 1 2 3 带通滤波片 光电倍增管 激光束 细胞 收集透镜 前向 散射 光 侧向散射 光，荧光 光信号分离，导向光信号分离，导

4、向 各探测通道接收并转化为电信号。各探测通道接收并转化为电信号。 光信号收集光信号收集 三三 数据处理及数据处理及流式报告 FSC SSC FL1 FL2 FL3 对数对数 线性线性 线性线性 线性线性 对数对数 脉冲处理，模数转换 光信号 电信号 记录数据，显示结果 （面积，峰高，宽度） n流式报告的图一般分为四种，即散点图、直方流式报告的图一般分为四种，即散点图、直方 图、密度图和二维等高图等。最常用的为散点图、密度图和二维等高图等。最常用的为散点 图和直方图。图和直方图。 n几个概念：几个概念： n%Gated：阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞百分比。反映细胞群体中 阳性细胞的数量

5、。阳性细胞的数量。 nMean：平均荧光强度，与被检测物质的表达平均荧光强度，与被检测物质的表达 量有关，在正态分布时一般用该值。量有关，在正态分布时一般用该值。 nGeo Mean：几何平均荧光强度，在阳性细胞几何平均荧光强度，在阳性细胞 为偏态分布时一般用该值。为偏态分布时一般用该值。 散点图 密度图 二维等高图 直方图 图 报告中常见的几种流式细胞图 R1 File: 4Acquisition Date: 06-Mar-03 QuadEvents% Gated X MeanY Mean UL2542.4037.47461.36 UR106710.08816.86468.89 LL5291

6、49.9819.574.41 LR397537.55418.809.87 图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死 流式细胞仪数据分析流式细胞仪数据分析 =点图分析点图分析 流式细胞仪数据分析流式细胞仪数据分析 =直方图分析直方图分析 图中100101（M1）为阴性细胞，101以上的（M2）为阳性细胞 五、 流式细胞术的应用 （Propidium iodide碘化丙啶），碘化丙啶）， 单参数直方图 图中2N代表G0/G1期细胞，4N代表G2/M期细胞，两者中间代表 S期细胞。这是以2倍体和4倍体细胞为主的流式DNA图 DNA细胞周期分析细胞周期分析 细胞周期细胞周期 200 400

7、 600 8001000 DNA含量含量 细细 胞胞 数数 量量 2倍体倍体 异倍体异倍体 4倍体倍体 肿瘤组织中的各种肿瘤组织中的各种DNA倍体倍体 含量与凋亡关系含量与凋亡关系 nDNA亚亚G1峰的检测：利用峰的检测：利用PI染色，检测具有染色，检测具有 亚亚G1期期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。 n凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNA降降 解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处 理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解 的的DNA

8、片段从细胞内流出，造成总体片段从细胞内流出，造成总体DNA含含 量减少，成为亚量减少，成为亚2倍体。倍体。 二）肿瘤诊断与抗肿瘤药物研究二）肿瘤诊断与抗肿瘤药物研究 1. 肿瘤诊断肿瘤诊断 2倍体倍体 异倍体异倍体 4倍体倍体 肿瘤组织中的各种肿瘤组织中的各种DNA倍体倍体 2. 凋亡研究凋亡研究 Annexin V Assay R1 File: 4Acquisition Date: 06-Mar-03 QuadEvents% Gated X MeanY Mean UL2542.4037.47461.36 UR106710.08816.86468.89 LL529149.9819.574.41

9、 LR397537.55418.809.87 图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死 Date acquired: 14-Jan-03 File: 7Gy 4hr.001 Source: dongbo DIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04 Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48 R1 图图 FCM测试细胞周测试细胞周 期分布和凋亡期分布和凋亡 根据凋亡细胞的特点来检测根据凋

10、亡细胞的特点来检测 n在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核在形态上，早期细胞核固缩，染色体边集在核 膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器膜内侧显新月体形、核碎裂；细胞浆和细胞器 密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲，密度增高、细胞体积变小；细胞膜皱折卷曲， 但早期细胞膜的完整性未受到破坏但早期细胞膜的完整性未受到破坏 n凋亡细胞的凋亡细胞的FSC ？SSC ？ n细胞坏死时，细胞肿胀，细胞坏死时，细胞肿胀，FSC ？，？，SSC ？ 三）三） R1 M1 M1 流式细胞术检测细胞表型 流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素 标记的单克隆抗体作分子探针

11、，多参数标记的单克隆抗体作分子探针，多参数 分析白血病细胞的免疫表型，了解被测分析白血病细胞的免疫表型，了解被测 白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。 FCM分析白血病免疫表型分析白血病免疫表型, 快速、特异、快速、特异、 准确，重复性好，能区分细胞起源、划准确，重复性好，能区分细胞起源、划 分其分化发育阶段等，对白血病的诊断分其分化发育阶段等，对白血病的诊断 与分型、治疗方案选择与预后判断、发与分型、治疗方案选择与预后判断、发 病机理研究等有重要价值。病机理研究等有重要价值。 四）四）白血病的免疫分型白血病的免疫分型 五）五） 细胞内蛋白的分析：细胞内蛋白

12、的分析： 荧光信号荧光信号 荧光样本制备荧光样本制备 双色直接染色双色直接染色 端粒（荧光蛋白）端粒（荧光蛋白） 六）细胞内钙离子测定六）细胞内钙离子测定 1 110106 6/ml/ml的细胞悬液，的细胞悬液， 加入终浓度为加入终浓度为1-5mol/ml Fluo-3/AM1-5mol/ml Fluo-3/AM，充分混匀，充分混匀， 室温避光作用室温避光作用6060分钟。分钟。 以以HEPESHEPES缓冲的缓冲的HanksHanks平衡盐溶液洗三次，重悬于平衡盐溶液洗三次，重悬于 0.5ml0.5ml同样的溶液，上流式细胞仪检测。同样的溶液，上流式细胞仪检测。 根据报告中给出的样品荧光强度

13、计算细胞内钙离子根据报告中给出的样品荧光强度计算细胞内钙离子 的浓度。的浓度。 FCM检测胞内钙离子、 膜电位和线粒体功能 M1阴性界限划分完全是根据阴性对照！如下图：红色部分代表阴性对照，即： 所检测的物质在阴性组中的基础表达量，可以理解为背景、静息状态下、基础 水平、未受刺激时等。蓝色部分即阳性组，也就是接受刺激后，功能状态下、 药物作用后等。 六六. 分选：分选： 488 nm laser +- Fluorescence Activated Cell Sorting Charged Plates Single cells sorted into test tubes FALS Senso

14、r Fluorescence detector 流式细胞仪是一种特殊的显微镜流式细胞仪是一种特殊的显微镜 流式细胞仪流式细胞仪显微镜显微镜 流动的细胞流动的细胞静止的细胞样本静止的细胞样本 数量大数量大数量少数量少 高速分选高速分选样本难以再利用样本难以再利用 细胞群体特征量分布细胞群体特征量分布揭示细胞内部结构信息揭示细胞内部结构信息 流式细胞仪流式细胞仪蛋白电泳蛋白电泳 多参数多参数单参数单参数 量化的分布量化的分布平均值平均值 容易检测各个参数间的容易检测各个参数间的 相关性相关性 不容易不容易 三、 流式细胞仪可检测到的细胞参数 颗粒度颗粒度 细胞大小细胞大小 =前向角散射光（前向角散

15、射光（FSCFSC）细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 =侧向角散射光（侧向角散射光（SSCSSC）细胞颗粒度及细胞内细胞器的细胞颗粒度及细胞内细胞器的 相对复杂性相对复杂性 三三 数据处理及数据处理及流式报告 FSC SSC FL1 FL2 FL3 对数对数 线性线性 线性线性 线性线性 对数对数 脉冲处理，模数转换 光信号 电信号 记录数据，显示结果 （面积，峰高，宽度） 图中100101（M1）为阴性细胞，101以上的（M2）为阳性细胞 六）细胞内钙离子测定六）细胞内钙离子测定 1 110106 6/ml/ml的细胞悬液，的细胞悬液， 加入终浓度为加入终浓度为1-5mol/ml

16、 Fluo-3/AM1-5mol/ml Fluo-3/AM，充分混匀，充分混匀， 室温避光作用室温避光作用6060分钟。分钟。 以以HEPESHEPES缓冲的缓冲的HanksHanks平衡盐溶液洗三次，重悬于平衡盐溶液洗三次，重悬于 0.5ml0.5ml同样的溶液，上流式细胞仪检测。同样的溶液，上流式细胞仪检测。 根据报告中给出的样品荧光强度计算细胞内钙离子根据报告中给出的样品荧光强度计算细胞内钙离子 的浓度。的浓度。 M1阴性界限划分完全是根据阴性对照！如下图：红色部分代表阴性对照，即： 所检测的物质在阴性组中的基础表达量，可以理解为背景、静息状态下、基础 水平、未受刺激时等。蓝色部分即阳性组，也就是接受刺激后，功能状态下、 药物作用后等。 六六. 分选：分选： 488 nm laser +- Fluorescenc