实验九 动物肝脏DNA提取和鉴定

1、实实 验验 五五 动物肝脏中动物肝脏中DNA的制备和鉴定的制备和鉴定 学时：学时：6 6 2010.3.252010.3.25 1 1、掌握动物组织总、掌握动物组织总DNADNA的提取方法及其原理。的提取方法及其原理。 2 2、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。、掌握琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理和方法。 3 3、学习核酸染色的方法。、学习核酸染色的方法。 一、实验目的：一、实验目的： 二、实验原理二、实验原理: 要获得纯的要获得纯的DNADNA样品，必须考虑以下几点：样品，必须考虑以下几点： 如何选材，如何破碎组织细胞？如何选材，如何破碎组织细胞？ 如何除去蛋白质？如何除去蛋白质？( (

2、在真核细胞内，在真核细胞内，DNADNA与蛋白质结合成核蛋与蛋白质结合成核蛋 白的形式存在。因此，分离白的形式存在。因此，分离DNADNA时必须使其与蛋白质解离，并除去蛋时必须使其与蛋白质解离，并除去蛋 白质。白质。) ) 设法除去设法除去RNARNA的污染；的污染； 防止防止DNADNA酶的降解作用；酶的降解作用； （一）动物肝脏（一）动物肝脏DNA制备原理制备原理 选选 材材 要提取动物组织要提取动物组织DNADNA，一般选择细，一般选择细 胞膜较脆弱，容易破碎的动物脏器，如胞膜较脆弱，容易破碎的动物脏器，如 胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等。胸腺、肝脏、脾脏、胰脏等。 研磨：研磨： 将剪碎的动物

3、组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研 磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合实验室使用。磨或匀浆，破碎细胞。这种方法温和，适合实验室使用。 组织捣碎器：组织捣碎器： 较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升温过高，通常较剧烈的破碎细胞的方法，为了防止发热和升温过高，通常 是转是转1010秒秒2020秒，停秒，停1010秒秒2020秒，可反复多次。秒，可反复多次。 压榨法：压榨法： 在在1000100010105 5Pa Pa 2000 200010105 5PaPa 的高压下使几十毫升的细胞悬的高压下使几十毫升的细胞悬 液通过一个小孔突然

4、释放至常压，细胞将彻底破碎。温和的、液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。温和的、 彻底破碎细胞的方法，但仪器费用较高。彻底破碎细胞的方法，但仪器费用较高。 细胞破碎方法细胞破碎方法机械物理法： 反复冻融法：反复冻融法： 将待破碎的细胞冷至将待破碎的细胞冷至1515到到2020，然后放于室温，然后放于室温( (或或 40)40)迅速融化，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度迅速融化，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度 增高而引起细胞溶胀破碎。增高而引起细胞溶胀破碎。 超声波处理法：超声波处理法： 借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。使用时注意降温，借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞

5、器。使用时注意降温， 防止过热。防止过热。 冷热交替法：冷热交替法： 在在9090左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反 复多次，绝大部分细胞可以被破碎。复多次，绝大部分细胞可以被破碎。 细胞破碎方法细胞破碎方法机械物理法 有机溶剂处理法：有机溶剂处理法： 利用氯仿、甲苯等脂溶性溶剂或利用氯仿、甲苯等脂溶性溶剂或SDSSDS（十二烷基硫酸钠）等（十二烷基硫酸钠）等 表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂， 此法也可以与研磨法联合使用。此法也可以与研磨法联合使用。 溶胀法：溶胀法

6、： 细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液 中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞 膜胀破释放出细胞内含物。膜胀破释放出细胞内含物。 细胞破碎方法细胞破碎方法化学方法 (三三)除去除去RNA的方法的方法 脱氧核糖核蛋白脱氧核糖核蛋白在浓在浓NaClNaCl（1-2mol1-2molL L）溶液中）溶液中 溶解度很大，但在溶解度很大，但在0.14mol0.14molL L NaClNaCl溶液中溶解度很低，溶液中溶解度很低， 而而核糖核蛋白核糖核蛋白则溶于则溶于0.14mo

7、l0.14molL L NaClNaCl溶液中，利用溶液中，利用 这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋白这一性质可将脱氧核糖核蛋白与绝大部分核糖核蛋白 分离开来。分离开来。 (四四)除去蛋白质的方法除去蛋白质的方法 用氯仿一异戊醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性，然用氯仿一异戊醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性，然 后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质溶胶停留在水相及氯仿后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质溶胶停留在水相及氯仿 相中间，而相中间，而DNADNA溶于上层水相。用两倍体积溶于上层水相。用两倍体积9595乙醇溶液可将乙醇溶液可将 DNADNA钠盐沉淀出来。钠盐沉淀出来。 用十二烷

8、基硫酸钠（用十二烷基硫酸钠（SDSSDS）等去污剂使蛋白质变性，可以直接）等去污剂使蛋白质变性，可以直接 从生物材料中提取从生物材料中提取DNADNA。 纯纯DNA样品的获得样品的获得 为了防止为了防止DNADNA酶的降解，提取时可加入适量酶的降解，提取时可加入适量 EDTAEDTA（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低（乙二胺四乙酸）、柠檬酸，以降低 DNADNA酶的活性。酶的活性。 加入加入RNARNA酶降解剩余的酶降解剩余的RNARNA，获得纯的，获得纯的DNADNA。 保存：将保存：将DNADNA于滤纸上干燥，溶于于滤纸上干燥，溶于1mlTE1mlTE中低中低 温保存。温保存。 （二）琼脂糖

9、凝胶电泳分离核酸的原理：（二）琼脂糖凝胶电泳分离核酸的原理： l琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳是用电泳是用琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶作为支持介质的一种电作为支持介质的一种电 泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已泳分离方法，是一种简便、快速分离鉴定核酸的方法，已 成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。成为分子生物学及基因工程研究中常用实验方法之一。 l琼脂糖琼脂糖英文名英文名agarose，是从是从琼脂琼脂中提取出来的，由中提取出来的，由半半 乳糖乳糖和和3.6-3.6-脱水脱水- -L-L-半乳糖半乳糖相互结合的相互结合的链状多糖链状多糖。琼脂糖琼脂糖 和琼脂和琼脂都可在不同浓度的

10、水溶液下可形成都可在不同浓度的水溶液下可形成多孔的凝胶多孔的凝胶，电，电 泳中具有泳中具有分子筛效应分子筛效应。但。但琼脂糖含硫酸根比琼脂少琼脂糖含硫酸根比琼脂少，电渗电渗 作用作用降低，因而分离效果明显提高。降低，因而分离效果明显提高。 lDNADNA分子分子在在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电高于其等电点的溶液中带负电荷，在电 场中向正极移动（场中向正极移动（电荷效应电荷效应） 。 lDNA分子泳动速率的大小除与分子泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关分子的带电量有关 外，还与外，还与DNA分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶 的的分子筛效应分

11、子筛效应）。）。 l电泳时，用电泳时，用溴酚蓝溴酚蓝做前沿指示剂，用做前沿指示剂，用溴化乙啶溴化乙啶 （ethidium bromide，EB） 指示指示DNA样品在凝胶中的确样品在凝胶中的确 切位置。切位置。 l溴化乙啶溴化乙啶是一种荧光染料，可插入是一种荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的双螺旋结构的 两个碱基对之间，与两个碱基对之间，与DNA分子形成络合物，在紫外光的分子形成络合物，在紫外光的 激发下发出橙黄色的荧光。激发下发出橙黄色的荧光。 l 荧光荧光来自两方面，一是核酸吸收来自两方面，一是核酸吸收260260nmnm的紫外光，的紫外光， 并将能量传给并将能量传给EB；二是二是EB本身

12、吸收波长为本身吸收波长为302302nmnm和和 360360nmnm的紫外光。这两方面的能量最终激发的紫外光。这两方面的能量最终激发EB发出发出 波长为波长为590590nmnm的红橙色荧光。的红橙色荧光。 l 溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶 放在含放在含EB的溶液中浸泡的溶液中浸泡. l 溴化乙啶检测溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出的灵敏度很高，可检出10ng,甚甚 至更少的至更少的DNA。 琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素琼脂糖凝胶电泳分离核酸的影响因素 （1）核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的

13、关系 凝胶中，凝胶中，DNA片段迁移率与片段迁移率与DNA分子大小分子大小(碱基对的对数碱基对的对数)成反比成反比( 20kb) ，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离 时行比较，便可测出未知片段的大小。时行比较，便可测出未知片段的大小。 （2）核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型不同构型DNA的移动速度次序为：闭环的移动速度次序为：闭环DNA直线直线DNA开环的双链开环的双链 环状环状DNA. （3）不同大小的不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳需要用不同浓度的琼脂

14、糖凝胶进行电泳 分离。分离。 琼脂糖浓度琼脂糖浓度/%/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0 线状线状DNADNA大小大小/ /kbkb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 3-0.2 2-0.1 注：注：DNADNA片段在片段在5-5005-500bpbp之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳（之间时，一般用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEPAGE）进进 行电泳分离。行电泳分离。 琼脂糖凝胶电泳具有以下优点：琼脂糖凝胶电泳具有以下优点： （1 1）操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度）操作简单、制备容易快速、凝胶机械性能好、电泳速度 快、分离快、

15、分离DNADNA片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电泳。片段范围广、样品不需事先处理就可以进行电泳。 （2 2）凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率）凝胶结构均匀，对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率 高，重复性好。高，重复性好。 （3 3）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外）琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外 光检测及定量测定。光检测及定量测定。 （4 4）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制）电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。制 成干膜可长期保存。成干膜可长期保存。 因此，因此，琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因

16、工程研电泳已成为分子生物学及基因工程研 究中常用实验方法之一，究中常用实验方法之一， DNADNA样本的分离、纯化、鉴定以及样本的分离、纯化、鉴定以及 相对分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。相对分子质量测定常用琼脂糖凝胶电泳。 荧光染料荧光染料EB染色染色 后，在紫外灯后，在紫外灯 (305nm)下观察下观察 到的电泳结果：到的电泳结果： * * 荧光染料荧光染料EBEB染色的原理和优点是什么？染色的原理和优点是什么？ 1 1、原理：、原理： EBEB：即即3,8-3,8-二氨基二氨基-5-5-乙基乙基-6-6-苯基菲锭溴盐苯基菲锭溴盐 ( (EthidiumEthidium Bromide)

17、Bromide)。 EBEB是一种扁平分子，它可以嵌是一种扁平分子，它可以嵌 入核酸的碱基之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧入核酸的碱基之间，在紫外线激发下，发出红橙色荧 光。光。 激发的荧光的能量来源于两个方面：一是核酸吸激发的荧光的能量来源于两个方面：一是核酸吸 收收2 260nm60nm的紫外线后将能量传递给的紫外线后将能量传递给EBEB，二是二是EBEB本身吸收本身吸收 302302nmnm和和360360nmnm的紫外线的能量。这两方面的能量最终的紫外线的能量。这两方面的能量最终 激发激发EBEB发射波长为发射波长为590590nmnm的可见光（红橙区）。的可见光（红橙区）。 2 2

18、、优点：、优点： （1 1）染色比较简便、快捷，一般在）染色比较简便、快捷，一般在10101515minmin就可反应。就可反应。 （2 2）EBEB对核酸分子无破坏作用，这是其它染料所不能做对核酸分子无破坏作用，这是其它染料所不能做 到的。到的。 （3 3）EBEB灵敏度高，可检测出灵敏度高，可检测出1010ngng或更少的或更少的DNADNA含量。含量。 （4 4）既可用于）既可用于DNADNA也可用于也可用于RNARNA的检测。的检测。 （5 5）EBEB可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外 灯检测电泳的进程和效果。灯检测电泳的进程和效果。

19、 （6 6）EB-DNAEB-DNA复合物中的复合物中的EBEB发出的荧光比游离的发出的荧光比游离的EBEB强强1010倍，倍， 因此不需洗净凝胶中游离的因此不需洗净凝胶中游离的EBEB也可检测出也可检测出DNADNA的条带。的条带。 3 3、缺点：、缺点： 溴化乙啶是一种强的致突变剂，在操作和配制试剂溴化乙啶是一种强的致突变剂，在操作和配制试剂 时应戴手套。含溴化乙啶的溶液不能直接倒入下水道，时应戴手套。含溴化乙啶的溶液不能直接倒入下水道， 应进行处理。应进行处理。 （1 1）每）每100100mlml溶液中加入溶液中加入100100mgmg粉状活性炭；粉状活性炭； （2 2）室温下放置）室

20、温下放置1 1小时，不时的摇动；小时，不时的摇动； （3 3）用新华一号滤纸过滤，弃滤液；）用新华一号滤纸过滤，弃滤液； （4 4）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物处理。）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物处理。 * *溴化乙啶在溴化乙啶在260260分解，在标准条件下进行焚化后不会有分解，在标准条件下进行焚化后不会有 危险性。危险性。 (一一)材料：动物肝脏材料：动物肝脏 (二二)试剂：试剂： （1）0.14molLNaCl0.15molL EDTA-Na溶液：溶液： （2）20SDS溶液：溶液： （3）氯仿一异戊醇氯仿一异戊醇(24:1)混合液混合液： （4）95乙醇溶液。乙醇溶

21、液。 （5）80乙醇溶液乙醇溶液。 （6） pH8.0TE缓冲液：缓冲液：10 mmolLTrisHCI，lmmol L EDTANa，其中含其中含RNA酶酶20ugmL。 二、实验材料、试剂和仪器二、实验材料、试剂和仪器: （7）电泳缓冲液：）电泳缓冲液：Tris-硼酸硼酸-EDTA（50TBE）pH8.0。 （8）加样缓冲液：加样缓冲液：0.25%溴酚蓝（溴酚蓝（BPB）40%蔗糖。蔗糖。 （9）溴化乙啶（溴化乙啶（EB）溶液：溶液：10g/ml。 （10）琼脂糖凝胶：浓度为琼脂糖凝胶：浓度为0.7%。 (三三)仪器仪器 （1）稳压稳流电泳仪稳压稳流电泳仪 （2）可调微量移液器可调微量移液

22、器 （3）水平电泳槽水平电泳槽 （4）暗箱紫外透射仪等。暗箱紫外透射仪等。 移液器的使用移液器的使用 取液器的构造 取液器的使用 吸入液体吸入液体 排出液体排出液体 使用注意事项：不超量程使用；不倒置；使用完毕调至最大刻度上。使用注意事项：不超量程使用；不倒置；使用完毕调至最大刻度上。 三、实验步骤：三、实验步骤： 1 1取新鲜动物肝，称取取新鲜动物肝，称取2 2g g，切成小块，切成小块， 加入加入4 4ml 0.14molml 0.14molL L NaClNaCl0.15mol0.15molL L EDTAEDTA溶液，于研钵中研磨至匀浆，再加溶液，于研钵中研磨至匀浆，再加4 4mlml

23、 清洗转入离心管中清洗转入离心管中，以以40004000r rminmin的转速的转速 离心离心 10 10minmin。 2 2在上述沉淀物中加入在上述沉淀物中加入4 4mLmL 0.14 0.14molmolL L NaClNaCl 0.15mol0.15molL EDTAL EDTA溶液，然后在溶液，然后在6060下，滴加下，滴加 2020SDSSDS溶液溶液3 35 5滴滴，边加边摇动，再摇动边加边摇动，再摇动 10 10minmin， 使核酸与蛋白质分离。使核酸与蛋白质分离。 3. 3. 加固体氯化钠加固体氯化钠0.40.4g g混匀，使其最终浓度达到混匀，使其最终浓度达到 l.4m

24、oll.4molL,L,摇匀。摇匀。 4 4加等体积的氯仿一异加等体积的氯仿一异 戊醇，混匀，摇动戊醇，混匀，摇动5 5minmin，以，以 40004000r rminmin的转速离心的转速离心 1010minmin。离心管内的物质分离心管内的物质分 为三层，上层为含为三层，上层为含DNADNA的水的水 相层，下层为氯仿一异戊醇相层，下层为氯仿一异戊醇 混合物，中间层为变性蛋白混合物，中间层为变性蛋白 凝胶。凝胶。 5 5吸出上清液，加入吸出上清液，加入2 2倍体积倍体积9595乙醇溶乙醇溶 液（预冷），产生絮状沉淀。液（预冷），产生絮状沉淀。 6.6.用取液器挑出絮状沉淀用取液器挑出絮状沉

25、淀( (沉淀用沉淀用8080乙醇乙醇 溶液离心洗涤，洗两次溶液离心洗涤，洗两次) )。 7 7加入加入3040ul TETE缓冲液缓冲液，使使DNADNA充分溶充分溶 解，待用。解，待用。 8.8.凝胶板的制备：凝胶板的制备： （1 1）取琼脂糖）取琼脂糖0.70.7g g，加加1 1TBETBE缓冲溶液缓冲溶液100100mlml，于沸水浴中于沸水浴中 至熔化，制成至熔化，制成0.7%0.7%的琼脂糖胶液。的琼脂糖胶液。 （2 2）胶床两头贴上防水胶带，形成）胶床两头贴上防水胶带，形成8 8mm高的挡墙，压紧胶带，高的挡墙，压紧胶带， 置水平台面上。置水平台面上。 （3 3）插入梳子，梳齿下端离板底插入梳子，梳齿下端离板底0.50.51 1mm。 （4 4）在胶床上滴加在胶床上滴加2 23 3滴滴 0.5 0.5g/g/mLmL的的EBEB溶液溶液。 （5 5）将将6060凝胶不间断倒入胶床，高凝胶不间断倒入胶床，高3 34 4mm，避免气泡，避免气泡， 摇匀，摇匀，室温下凝固。室温下凝固。 （6 6）完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，加入电泳缓冲完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，加入电泳缓冲 液，高于胶面液，高于胶面1 12 2mm，从一头轻轻斜拉出梳子，除