生化实验课件：DNA提取与电泳 2014

1、实验一实验一 组织细胞中基因组组织细胞中基因组DNA的提取的提取 实验二实验二 琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段片段 （水平潜水式）（水平潜水式） 实验一实验一 原理原理 样品研磨或者匀浆后加入细胞核裂解液，样品研磨或者匀浆后加入细胞核裂解液， 1、首先在强去污剂或者和蛋白酶、首先在强去污剂或者和蛋白酶K协同下裂解细协同下裂解细 胞释放出基因组胞释放出基因组DNA； 2、接着加入、接着加入RNase A去除去除RNA； 3、然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白；、然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白； 4、最后纯净的、最后纯净的DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于通过异丙醇沉淀并重溶解于 DN

2、A溶解液。溶解液。 操作步骤操作步骤 1、600l冰预冷的冰预冷的细胞核裂解液细胞核裂解液加入加入10-20mg新鲜组织用小匀新鲜组织用小匀 浆器匀浆浆器匀浆10s，将裂解物转入，将裂解物转入1.5ml EP管管 ； (4ml) 2、将裂解物放置在、将裂解物放置在65水浴水浴10min； 3、冷却，加入、冷却，加入Rnase A(10mg/ml) 1.8l至裂解物中裂解物中至裂解物中裂解物中 至终浓度至终浓度30g/ml，颠倒混匀，颠倒混匀，37温育温育10min去除残留去除残留 RNA；室温冷却室温冷却； 4、裂解物中加入、裂解物中加入200l 蛋白沉淀液蛋白沉淀液，涡旋振荡器上高速连续，涡

3、旋振荡器上高速连续 振荡混匀振荡混匀25s，然后，然后冰浴冰浴3min； 5、13,000rpm离心离心5min; 6、小心缓慢吸取、小心缓慢吸取600ul上清到一个新的上清到一个新的1.5ml EP管中，管中，勿吸动沉勿吸动沉 淀淀； 7、加入等体积的室温异丙醇（约、加入等体积的室温异丙醇（约600 l ），颠倒），颠倒30次混匀或直次混匀或直 到出现棉絮状（丝状）白色到出现棉絮状（丝状）白色DNA沉淀，沉淀，12,000rpm离心离心1min； 8、弃上清液，加入、弃上清液，加入1ml 70%乙醇后，颠倒漂洗乙醇后，颠倒漂洗DNA沉淀，沉淀， 12,000rpm离心离心1min，弃上清液，

4、倒置在吸水纸上轻敲几下，弃上清液，倒置在吸水纸上轻敲几下， 空气晾干沉淀几分钟空气晾干沉淀几分钟; 9、加入、加入100l 溶解液，溶解液，EP管做好标记，冰箱管做好标记，冰箱-20保存至下周保存至下周。 1、DNA溶液放置在溶液放置在65温育温育20min，中间不时轻弹管壁帮，中间不时轻弹管壁帮 助重新水化助重新水化DNA； 操作步骤操作步骤 二（接上周实验）二（接上周实验） 实验二实验二 琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段（水片段（水 平潜水式）平潜水式） 原理原理 ：分子筛效应：分子筛效应 溴乙锭溴乙锭(ethidium bromide, EB)，其分，其分 子可插入子可插入

5、DNA的碱基之间，形成一种络合的碱基之间，形成一种络合 物，在物，在254365nm波长紫外光照射下，呈波长紫外光照射下，呈 桔红色荧光，籍此可分析实验结果。桔红色荧光，籍此可分析实验结果。 1. 凝胶槽准备：凝胶槽准备：将电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净、晾将电泳槽内的有机玻璃内槽（制胶槽）洗干净、晾 干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，干，放入制胶玻璃板。取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好， 形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。形成模子。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。 2. 制备琼脂糖凝胶：制备琼脂糖凝胶：按照被分离的按照被分离的D

6、NA分子的大小选择合适浓度的分子的大小选择合适浓度的 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶。称取一定量的琼脂糖，置于锥形瓶中，加入电泳缓冲。称取一定量的琼脂糖，置于锥形瓶中，加入电泳缓冲 液液1TAE，置微波炉或水浴锅中加热至琼脂糖全部融化。，置微波炉或水浴锅中加热至琼脂糖全部融化。 3.灌胶：灌胶：待凝胶冷却至待凝胶冷却至60左右加入左右加入溴化乙啶溴化乙啶 (终浓度终浓度0.5g/mL)， 混匀后小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃混匀后小心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃 板表面形成均匀胶层（应注意胶面平整，无气泡），室温下冷却凝板表面形成均匀胶层（应注意胶面平整，无气泡

7、），室温下冷却凝 固。待完全凝固后，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入固。待完全凝固后，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入 电泳槽中。添加电泳槽中。添加1TAE电泳缓冲液电泳缓冲液使之高出胶面使之高出胶面13mm。 4. 加样：加样：在点样板上混合在点样板上混合DNA样品和上样缓冲液样品和上样缓冲液（上样缓冲液的最（上样缓冲液的最 终稀释倍数应不小于终稀释倍数应不小于1），然后加入胶板的样品小槽内。在样品），然后加入胶板的样品小槽内。在样品 一侧的样品小槽中加入分子质量标准（一侧的样品小槽中加入分子质量标准（DNA Ladder）。注意加样前）。注意加样前 要先记下加样的顺序，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防要先记下加样的顺序，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防 污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。 5. 电泳：电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压100V，样品由负，样品由负 极（黑色）向正极（红色）方向移动。当溴酚蓝移动到距离胶板下极（黑色）向正极（红色）方向移动。当溴酚蓝移动到距离胶板下 沿约沿约1cm处时，停止电泳。处