新编免疫组化

1、主要讲述内容：主要讲述内容： 第一部分第一部分 免疫细胞化学的理论基础免疫细胞化学的理论基础 第二部分第二部分 免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术 第三部分第三部分 免疫酶细胞化学技术免疫酶细胞化学技术 第四部分第四部分 免疫电子显微镜技术免疫电子显微镜技术 第一部分第一部分 免疫细胞化学的理论基础免疫细胞化学的理论基础 免疫细胞化学是免疫学与细胞化学相结合的一个分支免疫细胞化学是免疫学与细胞化学相结合的一个分支 学科，以免疫学的抗原抗体反应为其理论基础。学科，以免疫学的抗原抗体反应为其理论基础。 第一节第一节 抗原（抗原（antigenantigen） 一、抗原的概念一、抗原的概念 是

2、一类在合适的条件下，能激发机体免疫系统发生免是一类在合适的条件下，能激发机体免疫系统发生免 疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质在体内和疫应答，并能与免疫应答产生的效应物质在体内和/或体外或体外 发生特异性结合反应的物质。发生特异性结合反应的物质。 抗原的性能抗原的性能：免疫原性：免疫原性 产生免疫应答产生免疫应答 反应原性反应原性 产生特异性反应产生特异性反应 二、抗原决定簇二、抗原决定簇 是与相应抗体或淋巴细胞抗原识别受体相结合的部位，是与相应抗体或淋巴细胞抗原识别受体相结合的部位， 是决定和控制抗原特异性的特殊化学基团。是决定和控制抗原特异性的特殊化学基团。 类型：类型：功能性抗原决定簇

3、功能性抗原决定簇 隐蔽性抗原决定簇隐蔽性抗原决定簇 免疫优势决定簇免疫优势决定簇 线性或连续性决定簇线性或连续性决定簇 构象决定簇或不连续性决定簇构象决定簇或不连续性决定簇 B 细胞所识别的是半抗原决定簇；细胞所识别的是半抗原决定簇；T细胞所识别的是免疫细胞所识别的是免疫 原性决定簇或连续性决定簇。原性决定簇或连续性决定簇。 三、抗原的性质与种类三、抗原的性质与种类 （一）抗原的性质（一）抗原的性质 1、抗原的异物性、抗原的异物性 机体能对进入体内的异种、异体的大分子物质产生免疫应答。该物机体能对进入体内的异种、异体的大分子物质产生免疫应答。该物 质与机体的种系关系愈远，其免疫原性愈强，机体的

4、免疫反应也更强。质与机体的种系关系愈远，其免疫原性愈强，机体的免疫反应也更强。 自身抗原；自身抗体自身抗原；自身抗体 2、大分子胶体、大分子胶体 作为抗原，分子愈大，其免疫原性愈强作为抗原，分子愈大，其免疫原性愈强 3、抗原的特异性、抗原的特异性 各种抗原物质各有其特异的抗原决定簇，即一种抗体只能与相应的各种抗原物质各有其特异的抗原决定簇，即一种抗体只能与相应的 抗原起反应而不能与其它抗原反应。抗原起反应而不能与其它抗原反应。 （二）抗原的种类方法（二）抗原的种类方法 分类依据分类依据 种类种类 单独存在时是否有免疫原性单独存在时是否有免疫原性 半抗原和完全抗原半抗原和完全抗原 抗原来源抗原来

5、源 外源性抗原和内源性抗原外源性抗原和内源性抗原 抗原与宿主关系抗原与宿主关系 异种抗原，同种异体抗原，自身抗原异种抗原，同种异体抗原，自身抗原 B细胞产生抗体时是否需要细胞产生抗体时是否需要T细胞辅助细胞辅助 胸腺依赖抗原，胸腺非依赖抗原胸腺依赖抗原，胸腺非依赖抗原 化学物质化学物质 蛋白质，多糖，脂蛋白，脂多糖，糖蛋白，蛋白质，多糖，脂蛋白，脂多糖，糖蛋白， 核酸等核酸等 物理状态物理状态 颗粒性抗原，可溶性抗原颗粒性抗原，可溶性抗原 产生方式产生方式 天然抗原，人工合成抗原，基因工程抗原天然抗原，人工合成抗原，基因工程抗原 抗原特异性程度抗原特异性程度 特异性抗原，共同抗原特异性抗原，共

6、同抗原 完全抗原：完全抗原：同时具有免疫原性和反应原性的物质。同时具有免疫原性和反应原性的物质。 不完全抗原或半抗原：不完全抗原或半抗原：无免疫原性。无免疫原性。 第二节第二节 抗体（抗体（antibodyantibody） 一、抗体的概念一、抗体的概念 机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，机体受到抗原刺激后，通过体液免疫应答，B B淋巴细淋巴细 胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅胞活化、增殖、分化为浆细胞，由浆细胞合成并分泌的仅 与该抗原发生特异性反应的球蛋白。与该抗原发生特异性反应的球蛋白。 二、抗体的性质和种类二、抗体的性质和种类 （一）抗体的一般性质（一）抗体的一般性

7、质 免疫球蛋白约等于抗体，分五类：免疫球蛋白约等于抗体，分五类：IgG,IgM,IgA,IgD,IgEIgG,IgM,IgA,IgD,IgE （二）免疫原性和分类特性（二）免疫原性和分类特性 免疫球蛋白都是大分子蛋白质，具有免疫原性，课作为免疫球蛋白都是大分子蛋白质，具有免疫原性，课作为 抗原。由于存在着轻链和重链，可变区和稳定区，因此，抗原。由于存在着轻链和重链，可变区和稳定区，因此， 分子结构差异较大，免疫原性比较复杂。分子结构差异较大，免疫原性比较复杂。 （三）抗体的种类（三）抗体的种类 1、根据抗体的途径或来源不同分为、根据抗体的途径或来源不同分为 免疫抗体；天然抗体；自身抗体免疫抗体

8、；天然抗体；自身抗体 2、根据抗原抗体在试管内是否出现肉眼反应分为、根据抗原抗体在试管内是否出现肉眼反应分为 完全抗体；不完全抗体完全抗体；不完全抗体 三、抗原与抗体反应三、抗原与抗体反应 称为免疫学反应。称为免疫学反应。 在体内进行称为免疫反应；在体外称为血清学反应在体内进行称为免疫反应；在体外称为血清学反应 四、抗体形成的机制四、抗体形成的机制 （一）免疫应答的产生（一）免疫应答的产生 1、感应阶段（识别及加工处理抗原阶段）、感应阶段（识别及加工处理抗原阶段） 2、反应阶段（淋巴细胞增殖分化阶段）、反应阶段（淋巴细胞增殖分化阶段） 3、效应阶段（发生免疫反应阶段）、效应阶段（发生免疫反应阶

9、段） （二）影响抗体产生的因素（二）影响抗体产生的因素 1、抗原的质和量、抗原的质和量 2、机体方面、机体方面 3、佐剂的增强免疫作用、佐剂的增强免疫作用 第三节第三节 有关基本技术方法有关基本技术方法 一、抗体的制备一、抗体的制备 （一）抗体的制备方法（一）抗体的制备方法 能制备出具有很高特异性和敏感性的高效价能制备出具有很高特异性和敏感性的高效价多克隆多克隆和和 单克隆单克隆抗体。抗体。 1.1.多克隆抗体（血清抗体：指机体接受抗原主动免疫或被动多克隆抗体（血清抗体：指机体接受抗原主动免疫或被动 免疫后从血清中分离提纯的抗体。免疫后从血清中分离提纯的抗体。 2.2.单克隆抗体：是单克隆抗体

10、：是19751975年由年由Kohlenh MilsteinKohlenh Milstein发明的一种新技发明的一种新技 术。其原理是将体外培养的骨髓细胞和免疫的脾细胞相融合，术。其原理是将体外培养的骨髓细胞和免疫的脾细胞相融合， 产生杂交细胞。这种融合的杂交细胞既有骨髓细胞的无限生长产生杂交细胞。这种融合的杂交细胞既有骨髓细胞的无限生长 能力，又有浆细胞分泌单一抗体的能力。将该免疫细胞纯化，能力，又有浆细胞分泌单一抗体的能力。将该免疫细胞纯化， 成为单克隆系，就能产生大量专一的高纯度的抗体，即单克隆成为单克隆系，就能产生大量专一的高纯度的抗体，即单克隆 抗体（抗体（monoclonal an

11、tibody, McAb)monoclonal antibody, McAb) 单克隆抗体与多克隆抗体特性的比较单克隆抗体与多克隆抗体特性的比较 特性特性 多克隆多克隆 单克隆单克隆 组成组成 多种类抗体的混合物多种类抗体的混合物 单一种类的抗体单一种类的抗体 特异性特异性 低低 高高 针对多个抗原决定族针对多个抗原决定族 针对单一的抗原决定族针对单一的抗原决定族 亲和力亲和力 平均亲和力较高平均亲和力较高 不定，较低不定，较低 交叉反应交叉反应 高高 低低 （二）抗体的配制方法（二）抗体的配制方法 1、抗体贮存、抗体贮存 2、抗体使用液的配制、抗体使用液的配制 二、组织材料的处理二、组织材料

12、的处理 尽量保存好抗原性不丢失、不扩散、不被破坏尽量保存好抗原性不丢失、不扩散、不被破坏 三、免疫染色三、免疫染色 1、增强特异性染色方法、增强特异性染色方法 蛋白酶消化法；合适的抗体稀释度；温育时间蛋白酶消化法；合适的抗体稀释度；温育时间 2、减少或消除非特异性染色方法、减少或消除非特异性染色方法 3、显色反应的控制、显色反应的控制 4、复染、复染 四、对照四、对照 阳性阳性对照；对照；阴性阴性对照对照 五、结果的判断五、结果的判断 （一）阳性细胞的染色特性（一）阳性细胞的染色特性 1、分胞浆、细胞核、细胞膜表面阳性、分胞浆、细胞核、细胞膜表面阳性 2、灶状和弥漫性、灶状和弥漫性 3、非特异

13、性的认知、非特异性的认知 4、切片质量不佳出现的阳性要排除、切片质量不佳出现的阳性要排除 （二）染色失败的几种原因（二）染色失败的几种原因 第二部分第二部分 免疫荧光细胞化学技术免疫荧光细胞化学技术 Coons等（等（1941）通过荧光标记抗体，并借助于荧）通过荧光标记抗体，并借助于荧 光显微镜观察荧光的发光物质，而建立的该项技术。光显微镜观察荧光的发光物质，而建立的该项技术。 近年来，与激光技术、电子计算机、扫描电镜等技近年来，与激光技术、电子计算机、扫描电镜等技 术的结合发展为定量免疫荧光技术。加之荧光激活细胞分术的结合发展为定量免疫荧光技术。加之荧光激活细胞分 类器的应用和激光共聚焦显微

14、镜的问世，开创了免疫荧光类器的应用和激光共聚焦显微镜的问世，开创了免疫荧光 技术的新领域。技术的新领域。 第一节第一节 原理原理 一、基本原理一、基本原理 免疫荧光技术也是根据抗原抗体反应的原理，先将已知免疫荧光技术也是根据抗原抗体反应的原理，先将已知 的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光 抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或 抗体）。抗体）。 二、荧光产生的原理二、荧光产生的原理 分子都含有电子，电子载不断的运动着。分子都含有电子，电子载不断的运动着。 一般

15、情况下，电子总是处于能量最低的能级（即基态）一般情况下，电子总是处于能量最低的能级（即基态） 在一定的条例下，电子可吸收能量跃迁到较高的能量级在一定的条例下，电子可吸收能量跃迁到较高的能量级 （即激发态），这个过程叫激发。（即激发态），这个过程叫激发。 二、荧光素二、荧光素 1、荧光色素、荧光色素 能够产生荧光并能作为染料的化合物称为。能够产生荧光并能作为染料的化合物称为。 特性：必须具备吸收激发光的光能并发射荧光；具有吸收特性：必须具备吸收激发光的光能并发射荧光；具有吸收 一定频率光能的生色团和能产生一定光亮子的荧光一定频率光能的生色团和能产生一定光亮子的荧光 团。团。 2、用于标记抗体的荧

16、光素、用于标记抗体的荧光素必须具备以下条件必须具备以下条件： 1）应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基因，结合后不）应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基因，结合后不 易解离，而未结合的色素及其降解产物容易排除。易解离，而未结合的色素及其降解产物容易排除。 2）荧光效率高，与蛋白质结合荧光效率下降不多。）荧光效率高，与蛋白质结合荧光效率下降不多。 3）结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。）结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响。 4）与蛋白质结合的方法简便而快速。）与蛋白质结合的方法简便而快速。 5）荧光素容易溶解，溶解后不会与其它物质发生化学反应。）荧光素容易溶解，溶解

17、后不会与其它物质发生化学反应。 6）荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰）荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰 判断结果。判断结果。 3、荧光素的类型、荧光素的类型 1）异硫氰酸荧光素（）异硫氰酸荧光素（fluorescien isothocyanate, FITC) 2）四甲基异硫氰酸罗达明（）四甲基异硫氰酸罗达明（tetraethyl rhodamine isothocyanate, TRITC) 3）四乙基罗达明（）四乙基罗达明（tetraethyl rhodamine, RB200) 4）其它）其它 三、免疫荧光染色方法三、免疫荧光染色方法 1、直接法直接法：用

18、已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异：用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异 性荧光抗体，直接用于细胞和组织抗原的检查。性荧光抗体，直接用于细胞和组织抗原的检查。 优点：特异性高优点：特异性高 缺点：一种荧光缺点：一种荧光 抗体只能抗体只能 检测一种检测一种 抗原。抗原。 2、间接法间接法：用特异性的抗体（：用特异性的抗体（1抗）与细胞或组织标本反抗）与细胞或组织标本反 应，随后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧应，随后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧 光抗体（光抗体（2抗）与结合再抗原上的抗体结合，形成抗）与结合再抗原上的抗体结合，形成抗原抗原 抗体抗体 荧光抗体的复合物荧

19、光抗体的复合物。 优点：荧光亮度增强，优点：荧光亮度增强， 提高了敏感度提高了敏感度 四、非特异性染色的消除方法四、非特异性染色的消除方法 1、非特异性染色的主要因素、非特异性染色的主要因素 1）部分荧光素未与蛋白质结合，形成聚合物和衍化物而不能被透析除去。）部分荧光素未与蛋白质结合，形成聚合物和衍化物而不能被透析除去。 2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分非）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分非 特异结合。特异结合。 3）组织内类属抗原的存在。）组织内类属抗原的存在。 4）从组织中难以提纯抗原性物质。）从组织中难以提纯抗原性物质。 5）抗

20、体分子上标记的荧光素太多。）抗体分子上标记的荧光素太多。 6）荧光素不纯，标本固定不当。）荧光素不纯，标本固定不当。 7）细胞和组织内某些物质自发荧光。）细胞和组织内某些物质自发荧光。 8）染色时间过长，温度过高，冲洗不够或标本干燥。）染色时间过长，温度过高，冲洗不够或标本干燥。 2、消除的方法、消除的方法 1）衬染法）衬染法（可抑制自发荧光）（可抑制自发荧光） 2）胰蛋白酶消化）胰蛋白酶消化（可抑制非特异性荧光）（可抑制非特异性荧光） 3）吸收）吸收（用小属肝粉消除组织非特异性荧光的染色）（用小属肝粉消除组织非特异性荧光的染色） 4）用正常）用正常（非免疫）血清（清除自发荧光和非特异性荧光）

21、（非免疫）血清（清除自发荧光和非特异性荧光） 5）提高抗体和荧光抗体的质量）提高抗体和荧光抗体的质量 五、荧光显微镜及检测方法五、荧光显微镜及检测方法 略 六、染色标本的保存六、染色标本的保存 原则上应立即再荧光显微镜下观察，拍照，此时荧光原则上应立即再荧光显微镜下观察，拍照，此时荧光 最强。最强。 用缓冲甘油封片，保存在用缓冲甘油封片，保存在4中，过夜后特异性荧光中，过夜后特异性荧光 强度减弱强度减弱2525，保存，保存1 1周后减弱周后减弱6060。 Nikon 荧光显微镜荧光显微镜 肾活检（直接法）肾活检（直接法） 肾活检（直接法）肾活检（直接法） 肾活检（直接法）肾活检（直接法） 低倍

22、视野低倍视野 肾活检（直接法），表达弱肾活检（直接法），表达弱 肾活检（直接法）肾活检（直接法） 肾活检（直接法）肾活检（直接法） 左图：表达在细胞左图：表达在细胞 核（核（FITC） 右图：表达在胞膜右图：表达在胞膜 左图：左图：DAPI 染色染色 （染核）（染核） 右图： 胃胃 粘粘 膜膜 上上 皮皮 细细 胞，胞， 胞胞 浆浆 胞胞 膜膜 阳阳 性性 血血 管管 内内 弹弹 力力 膜膜 阳阳 性性 胃胃 腺腺 癌癌 第三部分第三部分 免疫酶细胞化学技术免疫酶细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术是免疫组织化学中最常见的方法免疫酶细胞化学技术是免疫组织化学中最常见的方法 之一，它是在抗原抗体特异

23、性反应存在的前提条件下，借之一，它是在抗原抗体特异性反应存在的前提条件下，借 助于酶学细胞化学手段，检测某种物质（抗原助于酶学细胞化学手段，检测某种物质（抗原/抗体）组织抗体）组织 细胞内存在部位的一门新技术。细胞内存在部位的一门新技术。 第一节第一节 免疫组织化学的基本技术免疫组织化学的基本技术 一、取材一、取材 1.1.实验动物实验动物 麻醉麻醉 （处死），锋利刀片切成大小适中，厚度（处死），锋利刀片切成大小适中，厚度3mm3mm4mm4mm。 小型实验动物：灌注（流）固定后取材小型实验动物：灌注（流）固定后取材 （生理盐水和（生理盐水和4 4多聚甲醛）多聚甲醛） 2.2.人体材料人体材料

24、 活检组织、手术标本、细胞和组织活检组织、手术标本、细胞和组织 二、固定二、固定 原则是保持组织形态良好和被检测抗原的前提下，应采用原则是保持组织形态良好和被检测抗原的前提下，应采用 浓度最低的固定剂和最短的固定时间，固定时间一般为浓度最低的固定剂和最短的固定时间，固定时间一般为1 112h12h。 1.1.常用的固定剂常用的固定剂 （1 1）甲醛缓冲液）甲醛缓冲液 广泛应用于病理标本的固定，甲醛在很好地保护组织形态广泛应用于病理标本的固定，甲醛在很好地保护组织形态 结构完整的同时也有效地保存某些抗原。由于甲醛的交联作用结构完整的同时也有效地保存某些抗原。由于甲醛的交联作用 会影响被固定细胞膜

25、的通透性不利于染色时抗体的渗透，因此会影响被固定细胞膜的通透性不利于染色时抗体的渗透，因此 染色前常用酶进行消化以使抗原决定簇充分暴露，固定时间不染色前常用酶进行消化以使抗原决定簇充分暴露，固定时间不 直超过直超过24h24h。 （2 2）4 4多聚甲醛磷酸缓冲液多聚甲醛磷酸缓冲液 广泛应用于光镜细胞化学研究。广泛应用于光镜细胞化学研究。 （3 3）戊二醛多聚甲醛缓冲液）戊二醛多聚甲醛缓冲液 适用于光镜、电镜免疫组织化学研究。适用于光镜、电镜免疫组织化学研究。 （4 4）其它）其它 如如PLPPLP液（过碘酸液（过碘酸 赖赖AAAA多聚甲醛固定液）、丙酮及醇多聚甲醛固定液）、丙酮及醇 类、锇酸

26、等。类、锇酸等。 2.2.固定注意事项固定注意事项 （1 1）固定液的选择标准：）固定液的选择标准：A. A. 组织形态结构保存良好。组织形态结构保存良好。 B. B. 最大限度保存抗原的抗原性。最大限度保存抗原的抗原性。 （2 2）组织块的大小：）组织块的大小：1.5cm1.5cm1.5cm1.5cm0.5cm0.5cm为宜。为宜。 （3 3）固定时间：与组织块大小成正比，与固定液浓度成反比。）固定时间：与组织块大小成正比，与固定液浓度成反比。 （4 4）温度：一般在室温下进行，电镜标本和固定时间较长时）温度：一般在室温下进行，电镜标本和固定时间较长时 可放置在可放置在44冰箱。冰箱。 （5

27、 5）固定后处理：充分冲洗，除去多余固定剂。）固定后处理：充分冲洗，除去多余固定剂。 三、包埋三、包埋 1.1.石蜡包埋石蜡包埋 2.2.冷冻包埋冷冻包埋 3.3.环氧树脂包理环氧树脂包理 四、切片四、切片 1.1.载玻片的处理载玻片的处理 （1 1）清洗）清洗 （2 2）涂胶（防止脱片）。常用粘附剂：）涂胶（防止脱片）。常用粘附剂： 明胶：铬矾明胶和甲醛明胶。树脂胶：也称白胶。明胶：铬矾明胶和甲醛明胶。树脂胶：也称白胶。 多聚赖氨酸（多聚赖氨酸（PLLPLL）。商品化粘附剂。）。商品化粘附剂。 2.2.切片类型切片类型 （l l）石蜡切片）石蜡切片 厚约厚约3 3 5m5m，放置，放置373

28、7温箱烘烤过夜，以减少脱片。温箱烘烤过夜，以减少脱片。 （2 2）冷冻切片：）冷冻切片：2m2m。 （3 3）振动切片：特点是组织经固定后不需包埋，只要用）振动切片：特点是组织经固定后不需包埋，只要用 胶水粘在载物台上即可切片。切片较厚，可将阳性部位作胶水粘在载物台上即可切片。切片较厚，可将阳性部位作 电镜包埋。神经组织应用较多。电镜包埋。神经组织应用较多。 第二节第二节 免疫组化染色过程中基本技术免疫组化染色过程中基本技术 一、蛋白酶消化技术一、蛋白酶消化技术 进行固定时，抗原决定簇有可能被固定剂所封闭，因进行固定时，抗原决定簇有可能被固定剂所封闭，因 此在抗原抗体反应前，常用蛋白酶处理组织

29、切片，使抗原此在抗原抗体反应前，常用蛋白酶处理组织切片，使抗原 决定簇充分暴露出来，并使组织的通透性增高，以利抗原决定簇充分暴露出来，并使组织的通透性增高，以利抗原 抗体最大限度地结合增强特异性染色。抗体最大限度地结合增强特异性染色。 1.1.常用的消化酶常用的消化酶 胰蛋白酶、胃蛋白酶胰蛋白酶、胃蛋白酶 2.2.消化时间消化时间 因组织而异，一般为因组织而异，一般为5 530min30min，消化时间不宜太长，消化时间不宜太长， 以免损伤组织形态，破坏抗原决定族。消化结束后要充分以免损伤组织形态，破坏抗原决定族。消化结束后要充分 洗涤，以除去残留的蛋白酶洗涤，以除去残留的蛋白酶。 3.3.非

30、特异染色的控制非特异染色的控制 非特异染色或背景染色是指在免疫组化染色过程中凡不属非特异染色或背景染色是指在免疫组化染色过程中凡不属 于特异性抗原抗体反应所出现的染色。于特异性抗原抗体反应所出现的染色。 （1 1）原因分析）原因分析 组织方面：主要有组织的自发荧光、内源性过氧化物酶或碱组织方面：主要有组织的自发荧光、内源性过氧化物酶或碱 性磷酸酶、内源性生物素等性磷酸酶、内源性生物素等. . 试剂方面：因抗体不纯、标记的酶和荧光不纯或标记过量等。试剂方面：因抗体不纯、标记的酶和荧光不纯或标记过量等。 （2 2）消除方法）消除方法 加加1 1抗前加正常血清抗前加正常血清101030min30mi

31、n，以封闭组织中带电荷的基，以封闭组织中带电荷的基 因，避免与因，避免与1 1抗的非特异性结合。抗的非特异性结合。 减少非特异性染色：减少非特异性染色： a.a.免疫酶组化染色时，在加免疫酶组化染色时，在加1 1抗前，用抗前，用0.3%0.3%的的H H2 2O O2 2甲醇溶液将组甲醇溶液将组 织切片处理织切片处理30min30min（3%3%的的H H2 2O O2 2甲醇溶液处理甲醇溶液处理5 510min10min）。）。 b.b.免疫荧光染色时，可用免疫荧光染色时，可用0.010.010.050.05伊文思蓝稀释荧光抗体。伊文思蓝稀释荧光抗体。 二、对照二、对照 阳性对照片：用已知抗

32、原为阳性的标本作对照阳性对照片：用已知抗原为阳性的标本作对照 阴性对照片：确认不含己知抗原的标本作对照阴性对照片：确认不含己知抗原的标本作对照 三、抗体的分装、稀释、滴加及保存三、抗体的分装、稀释、滴加及保存 1.1.抗体的分装抗体的分装 不能用完的抗体分装在小的不能用完的抗体分装在小的EPEP管内，保存在管内，保存在-20-20-40-40的的 低温冰箱中持用可保持数年有效。低温冰箱中持用可保持数年有效。 2.2.抗体稀释抗体稀释 常用常用0.01MPBS0.01MPBS（磷酸缓冲溶液）或（磷酸缓冲溶液）或BSABSA（牛血清白蛋白）（牛血清白蛋白） 3.3.滴加滴加 滴加抗体要充分覆盖组织

33、切片，一般加滴加抗体要充分覆盖组织切片，一般加 303050L,50L,最好在最好在 滴加前，用蜡笔或特制的组化笔在组织周围画一圈滴加前，用蜡笔或特制的组化笔在组织周围画一圈, ,以防溶液以防溶液 的扩散。的扩散。 4.4.保存保存 未用完的抗体可在低温冰箱或冻干保存，已稀释未用完的抗未用完的抗体可在低温冰箱或冻干保存，已稀释未用完的抗 体最好在一周内用完，不宜长期保存。体最好在一周内用完，不宜长期保存。 四、免疫酶组织化学技术和酶标抗体技术四、免疫酶组织化学技术和酶标抗体技术 1.1.免疫酶染色原理免疫酶染色原理 用酶作为标记物，可分为直接法、间接法、补体法、免用酶作为标记物，可分为直接法、

34、间接法、补体法、免 疫酶桥法、免疫酶双桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法疫酶桥法、免疫酶双桥法、过氧化物酶抗过氧化物酶法 （PAPPAP法）和双法）和双PAPPAP法等。法等。 （1 1）直接法原理：用酶直接标记在特异性）直接法原理：用酶直接标记在特异性1 1抗上，与标本中的抗上，与标本中的 抗原结合，让酶催化底物反应产生有色产物，沉淀在抗抗原结合，让酶催化底物反应产生有色产物，沉淀在抗 原抗体反应部位，即可在镜下对标本的抗原进行检测。原抗体反应部位，即可在镜下对标本的抗原进行检测。 优点：简便、快速、特异性强；缺点：敏感性差。优点：简便、快速、特异性强；缺点：敏感性差。 （2 2）间接法原理：先

35、用标记的特异性）间接法原理：先用标记的特异性1 1抗与标本中相应抗原抗与标本中相应抗原 结合，再用酶标记的抗球蛋白抗体（结合，再用酶标记的抗球蛋白抗体（2 2抗）孵育，然后再加抗）孵育，然后再加 酶的底物，显示抗原抗体抗原抗体复合物存在的部酶的底物，显示抗原抗体抗原抗体复合物存在的部 位，以对抗原进行检测。位，以对抗原进行检测。 如：如：1 1抗是由兔产生的多克隆抗体抗是由兔产生的多克隆抗体, ,则则2 2抗常用羊抗兔抗常用羊抗兔IgGIgG； 1 1抗是由鼠产生的单克隆抗体抗是由鼠产生的单克隆抗体, ,则则2 2抗常用羊或马抗鼠抗常用羊或马抗鼠IgGIgG。 以上两种方法称为酶标抗体法 （3

36、 3）非酶标记的抗体酶法：是以酶为抗原免疫动物，产生）非酶标记的抗体酶法：是以酶为抗原免疫动物，产生 抗酶的抗体。通过酶与抗体的特异性结合进行标记。该方法抗酶的抗体。通过酶与抗体的特异性结合进行标记。该方法 适用于石蜡包埋的组织切片。适用于石蜡包埋的组织切片。 常用的有PAP、sABC、LsAB法（附图表说明） （酶标识特异抗体（酶标识特异抗体 （酶标识二次抗体（酶标识二次抗体 生物素生物素 HRPHRP ALPALP 2.2.常用的酶种类常用的酶种类 底物底物 沉淀颜色沉淀颜色 HRP A.3,3HRP A.3,3氨基联苯胺氨基联苯胺DABDABH H2 2O O2 2 深褐色深褐色 B.5

37、B.5氨基水杨酸氨基水杨酸 H2O2 棕色棕色 ALP A.ALP A.苯酚磷酸盐重氮盐红色苯酚磷酸盐重氮盐红色 B.PB.P校际酚磷酸盐黄色校际酚磷酸盐黄色 酸性磷酸酶酸性磷酸酶 GomouiGomoui液液 葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶 D D葡萄糖葡萄糖MTTMTT酚嗪磷酸酚嗪磷酸 甲酯化合物甲酯化合物 蓝色蓝色 第三节第三节 免疫组化的实际操作免疫组化的实际操作 1.1.实验准备（必须器材）实验准备（必须器材） （1 1）实验台：光线充足，方便操作。）实验台：光线充足，方便操作。 （2 2）湿润盒：放置抗原抗体反应过程中反应，避免干燥。）湿润盒：放置抗原抗体反应过程中反应，避免干燥。 （3

38、 3）微量移液器：）微量移液器：1 120l,2020l,20200l,100200l,1001000l1000l。 （4 4）其它：滤纸、纱布、吸头、）其它：滤纸、纱布、吸头、EPEP管、染缸、提篮等。管、染缸、提篮等。 2.2.试剂药品试剂药品 （1 1）缓冲液：）缓冲液：PBS,0.01 MPBS,0.01 M磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH7.2pH7.2） TBS,0.05 M TrisTBS,0.05 M Tris盐酸缓冲液（盐酸缓冲液（pH7.6pH7.6） （2 2）抗体稀释液）抗体稀释液: 1: 1BSABSA或或0.01 MPBS0.01 MPBS （3 3）10102 2抗免

39、疫动物的正常血清抗免疫动物的正常血清 （4 4）DBADBAH H2 2O O2 2显色液显色液 （5 5）核复染液：苏木素或甲基绿）核复染液：苏木素或甲基绿 3.3.sABCsABC法的操作过程法的操作过程 基本原理：基本原理：sABCsABC（strepto-avidin-biotin peroxidase strepto-avidin-biotin peroxidase complexcomplex）链球菌抗生物素（卵白蛋）生物素过氧化物酶）链球菌抗生物素（卵白蛋）生物素过氧化物酶 复合物复合物 生物素(biotin):是一种分子量为244da的小分子的维生素。 抗生物素(avidin)

40、:是一种糖蛋白，分子量为68KDa。 生物素与抗生物素有很强的亲和力，两者一旦结合就很难生物素与抗生物素有很强的亲和力，两者一旦结合就很难 解离。同时生物素与抗生物素都有与其它示踪剂如荧光素，胶解离。同时生物素与抗生物素都有与其它示踪剂如荧光素，胶 体金和过氧化物酶等相结合的能力。所以生物素体金和过氧化物酶等相结合的能力。所以生物素-抗生物素系抗生物素系 统具有灵敏度高、特异性强及方便快速等显着优点。统具有灵敏度高、特异性强及方便快速等显着优点。 附基本操作步骤 第四节第四节 注意事项及结果判定注意事项及结果判定 要想得到理想的结果，组织细胞形态的保存、抗原性要想得到理想的结果，组织细胞形态的

41、保存、抗原性 的保存、充分的显示是非常必要的。要满足这些条件，取的保存、充分的显示是非常必要的。要满足这些条件，取 材、固定、切片厚度、操作过程、抗体浓度及特异性的选材、固定、切片厚度、操作过程、抗体浓度及特异性的选 择、操作前蛋白酶的消化、抗原修复及显色等各程序的操择、操作前蛋白酶的消化、抗原修复及显色等各程序的操 作不当均可导致不满意结果的产生。作不当均可导致不满意结果的产生。 1. 取材固定取材固定 标本要尽可能新鲜，取材固定要及时，固定液要新标本要尽可能新鲜，取材固定要及时，固定液要新 鲜鲜 充足，防止组织破坏和抗原性的失活。充足，防止组织破坏和抗原性的失活。 2. 切片切片 切片不宜

42、过厚，一般切片不宜过厚，一般4m左右。切片不宜过大，载玻左右。切片不宜过大，载玻 片要涂粘附剂，以防脱片。切好的切片暂放片要涂粘附剂，以防脱片。切好的切片暂放37温箱保温箱保 存。存。 3.3.脱蜡脱蜡 脱蜡一定要彻底，新鲜二甲苯脱蜡一定要彻底，新鲜二甲苯 5min5min3 3。 4.4.蛋白酶消化蛋白酶消化 由于组织在固定时抗原决定簇可能被固定剂所封闭，因此由于组织在固定时抗原决定簇可能被固定剂所封闭，因此 在抗原抗体反应前常用蛋白酶处理组织切片（根据在抗原抗体反应前常用蛋白酶处理组织切片（根据1 1抗要求），抗要求）， 使抗原决定簇充分暴露出来，并使组织通透性增高，使抗体充使抗原决定簇充

43、分暴露出来，并使组织通透性增高，使抗体充 分结合抗原，增强特异性染色。一般用分结合抗原，增强特异性染色。一般用0.1%0.1%胰蛋白酶或胃蛋白胰蛋白酶或胃蛋白 酶消化酶消化5 530min30min。 5.5.抗原修复抗原修复 一般在柠檬酸钠抗原修复液内，微波炉，一般在柠檬酸钠抗原修复液内，微波炉，85859595，10min10min 左右。左右。 6.6.抗体的选择抗体的选择 选择抗体时要注意是用于冰冻切片还是用于石蜡切片的抗选择抗体时要注意是用于冰冻切片还是用于石蜡切片的抗 体，或是二者均可；其次要看抗体说明，是单抗还是多抗；适体，或是二者均可；其次要看抗体说明，是单抗还是多抗；适 用于

44、哪些组织；抗体来源于哪种动物，由此来选择用于哪些组织；抗体来源于哪种动物，由此来选择2 2抗；还有抗；还有 抗体的稀度（在实验前根据预实验选择最佳浓度。抗体的稀度（在实验前根据预实验选择最佳浓度。 7.7.特异性的确定特异性的确定 阴性对照（不加阴性对照（不加1 1抗，用抗，用PBSPBS或或TBSTBS代替）代替） 阳性对照（已知确定阳性的组织）或买阳性对照片阳性对照（已知确定阳性的组织）或买阳性对照片 显色：注意H2O2的浓度，必须在显示前加入H2O2均匀搅拌，最佳显色时间 在35min，过短或过长都不会出现满意的效果。 9.9.复染复染 一般用苏木素一般用苏木素30s30s1min1mi

45、n，过长复染将掩盖免疫组化的染色，过长复染将掩盖免疫组化的染色 效果。效果。 10.10.结果判定结果判定 判断是否阳性或阴性，要排除假阳性或假阴性结果。也要学判断是否阳性或阴性，要排除假阳性或假阴性结果。也要学 会判断特异性染色和非特异性染色。呈色深浅可反映抗原存在的会判断特异性染色和非特异性染色。呈色深浅可反映抗原存在的 数量，可作为定性、定位和定量的依据。数量，可作为定性、定位和定量的依据。 有关阳性结果的定量判断，常规的方法是根据呈色深浅和阳有关阳性结果的定量判断，常规的方法是根据呈色深浅和阳 性细胞数量分类计算，以（性细胞数量分类计算，以（- -）,+,+,+,+,+,+等分级和计数

46、统计。等分级和计数统计。 以下用图片说明 胃癌淋巴结转移胃癌淋巴结转移 cerbB-2cerbB-2癌基因表达癌基因表达 sABCsABC法法 胃癌，胃癌，P53P53抑癌基因表达，抑癌基因表达， sABCsABC法法 胃癌胃癌CerbB-2CerbB-2的表达，的表达， sABCsABC法法 胃癌胃癌cerbB-2cerbB-2的淋巴管侵袭，的淋巴管侵袭， sABCsABC法法 胃淋巴组织反应胃淋巴组织反应 性增生，性增生， CD20/CD43CD20/CD43检测检测 sABCsABC法法 胃组织中的反应性增生的淋巴组织，胃组织中的反应性增生的淋巴组织，CD43CD43表达，表达， sAB

47、CsABC法法 IgANIgAN，TGFs2TGFs2表达，主要在近曲肾小管内，表达，主要在近曲肾小管内， sABCsABC法法 IgAN, TGFs2IgAN, TGFs2的表达，的表达，sABCsABC法法 IgANIgAN，bFGFbFGF的表达，的表达， sABCsABC法法 IgAN, PDGFIgAN, PDGF的表达，的表达， sABCsABC法法 骨骼肌营养不良，骨骼肌营养不良，myosinmyosin蛋白表达，蛋白表达， sABCsABC法法 第五节第五节 免疫组织化学在病理诊断中的免疫组织化学在病理诊断中的 应用范围应用范围 1.1.肿瘤诊断肿瘤诊断 未分化恶性肿瘤性质判定

48、；圆形、梭形、多形性肿瘤细未分化恶性肿瘤性质判定；圆形、梭形、多形性肿瘤细 胞鉴别；转移肿瘤的原发部位的确定。胞鉴别；转移肿瘤的原发部位的确定。 2.2.淋巴瘤的诊断淋巴瘤的诊断 鉴定反应性增生疾病与淋巴瘤；各种淋巴瘤的分型。鉴定反应性增生疾病与淋巴瘤；各种淋巴瘤的分型。 3.3.内分泌肿瘤的诊断（检测肿瘤分泌的激素内分泌肿瘤的诊断（检测肿瘤分泌的激素) ) 4.4.软组织肿瘤；神经系统肿瘤软组织肿瘤；神经系统肿瘤 5.小活检组织病理检查（能明确显示瘤细胞存在与否小活检组织病理检查（能明确显示瘤细胞存在与否) 6.微小癌、微小转移灶（淋巴结和骨髓微小癌、微小转移灶（淋巴结和骨髓) 7.细针穿刺

49、（细胞学诊断细针穿刺（细胞学诊断) 8.8.部分肿瘤来源分类部分肿瘤来源分类 9.9.乳腺癌激素受体检测（乳腺癌激素受体检测（ERER，PR)PR) 10.10.肿瘤基因产物（肿瘤基因产物（p53,cerb-B2,ALK,CDs)p53,cerb-B2,ALK,CDs) 11.11.增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（Ki-67Ki-67，PCNA)PCNA)判定肿瘤的预后判定肿瘤的预后 12.12.病因诊断（病因诊断（HBVHBV，HCVHCV，EBVEBV，CMVCMV，HIVHIV等等) ) 第六节第六节 免疫组织化学在病理诊断中存免疫组织化学在病理诊断中存 在的不足在的不足 1.1.与分子

50、生物学等技术相比，范围有限与分子生物学等技术相比，范围有限 2.2.并非所有肿瘤均可以做免疫组化，因常无相应的抗体并非所有肿瘤均可以做免疫组化，因常无相应的抗体 3.3.相当多的肿瘤缺乏特异性抗原的表达，同一种抗体，常相当多的肿瘤缺乏特异性抗原的表达，同一种抗体，常 常可表达多种肿瘤常可表达多种肿瘤 4.4.免疫组织化学标准化问题免疫组织化学标准化问题 第四部分第四部分 免疫电子显微镜技术免疫电子显微镜技术 一、免疫电镜技术一、免疫电镜技术(immunoelection microscopy) 是利用抗原和抗体特异性结合的原理，在超微结构水平定是利用抗原和抗体特异性结合的原理，在超微结构水平定

51、 位、定性及半定量显示抗原的技术方法。从细胞超微结构水位、定性及半定量显示抗原的技术方法。从细胞超微结构水 平研究和观察抗原抗体的免疫反应，必须使抗体带上具有高平研究和观察抗原抗体的免疫反应，必须使抗体带上具有高 电子密度的标记物，这样才能在电镜下观察反应分结果。电子密度的标记物，这样才能在电镜下观察反应分结果。 到目前为止，已有三种标记技术：到目前为止，已有三种标记技术： (1)铁蛋白标记技术铁蛋白标记技术 (2)酶标记技术酶标记技术 (3)胶体金标记技术胶体金标记技术 二、免疫金标记技术（二、免疫金标记技术（immunogold staining immunogold staining t

52、echnique)technique) 用胶体状态的金颗粒，作为抗体的标记物，制成免疫用胶体状态的金颗粒，作为抗体的标记物，制成免疫 胶体金来研究抗原抗体的反应。在光镜下，胶体金来研究抗原抗体的反应。在光镜下，胶体金胶体金呈鲜红呈鲜红 色。电镜下，金颗粒电子密度大，有利于超微结构的观察。色。电镜下，金颗粒电子密度大，有利于超微结构的观察。 根据抗体特异性结合的原理，在亚细胞水平定性定位。根据抗体特异性结合的原理，在亚细胞水平定性定位。 对抗体加以标记，形成高电子密度区，在电镜下观察反应对抗体加以标记，形成高电子密度区，在电镜下观察反应 过程。在对细胞内抗原定性研究中，还可用不同的金颗粒过程。在

53、对细胞内抗原定性研究中，还可用不同的金颗粒 标记同一细胞内不同的抗原。进行多重标记。标记同一细胞内不同的抗原。进行多重标记。 三、免疫电镜的基本技术方法三、免疫电镜的基本技术方法 1.1.标本的处理标本的处理 (1)(1)取材取材: :各种培养细胞和分离的血细胞应随用随取；游离的培各种培养细胞和分离的血细胞应随用随取；游离的培 养细胞可先进行离心；贴壁细胞可在载玻片上固定，养细胞可先进行离心；贴壁细胞可在载玻片上固定， 也可用胰蛋白酶将细胞消化下来；取组织块时应做到也可用胰蛋白酶将细胞消化下来；取组织块时应做到 越快越好，最好在没有停止血流前取材。越快越好，最好在没有停止血流前取材。 （2 2

54、）固定）固定 固定液的选择：固定液的选择： 既要保存细胞的超微结构，又要尽可能的保存抗原的活性。既要保存细胞的超微结构，又要尽可能的保存抗原的活性。 A.A.多聚甲醛加低浓度的戊二醛固定液（多聚甲醛加低浓度的戊二醛固定液（PGPG固定液）固定液） B.B.过碘酸盐赖氨酸多聚甲醛混合固定液（过碘酸盐赖氨酸多聚甲醛混合固定液（ PLPPLP固定液）固定液） C.C.苦味酸多聚甲醛戊二醛固定液（苦味酸多聚甲醛戊二醛固定液（PAPGPAPG固定液固定液) ) 固定方法与时间：固定方法与时间： A.A.血管灌注固定（最好方法）血管灌注固定（最好方法） B.B.浸泡固定浸泡固定 C.C.微波固定微波固定

55、2.2.基本技术方法基本技术方法 （1 1）包埋前免疫电镜技术）包埋前免疫电镜技术 是指先对标本进行免疫标记，然后进行包埋、切片、是指先对标本进行免疫标记，然后进行包埋、切片、 观察。观察。 （2 2）包埋后免疫电镜技术）包埋后免疫电镜技术 是指组织标本经固定及树脂包埋，制作成超薄切片后再是指组织标本经固定及树脂包埋，制作成超薄切片后再 进行免疫化学染色方法。进行免疫化学染色方法。 详见包埋前和包埋后电镜技术的比较 包埋前与包埋后的比较包埋前与包埋后的比较 包埋前包埋前包埋后包埋后 优点优点 缺点缺点 修正修正 未经锇酸固定、脱水、树脂包埋未经锇酸固定、脱水、树脂包埋 及高温聚合的过程，标记的

56、阳性及高温聚合的过程，标记的阳性 率高，提高电镜的检出率。率高，提高电镜的检出率。 免疫染色完毕后用戊二醛与锇酸免疫染色完毕后用戊二醛与锇酸 作后固定，可使抗原抗体结合的作后固定，可使抗原抗体结合的 更加牢固，并有利于膜结构的保更加牢固，并有利于膜结构的保 存。存。 标记前细胞内抗原受到标记抗体标记前细胞内抗原受到标记抗体 的穿透性限制（因是组织块）的穿透性限制（因是组织块） 制作厚切片；增加细胞膜的通透制作厚切片；增加细胞膜的通透 性性 具有阳性结果重复性高、方法简具有阳性结果重复性高、方法简 便可靠的优点，可对同一组织块便可靠的优点，可对同一组织块 的连续切片作各种对照染色，能的连续切片作

57、各种对照染色，能 十分准确的解释染色结果，而且十分准确的解释染色结果，而且 还能在同一张切片上进行多重免还能在同一张切片上进行多重免 疫染色。疫染色。 抗原在脱水、浸透及树脂包埋过抗原在脱水、浸透及树脂包埋过 程中可能被破坏，使免疫染色的程中可能被破坏，使免疫染色的 阳性率下降。阳性率下降。 细胞膜保存差（锇酸作用）细胞膜保存差（锇酸作用） 固定液选择苦味酸固定液选择苦味酸(保护细胞膜保护细胞膜) 包埋剂协作低温树脂包埋剂协作低温树脂 肝细胞内肝细胞内 的内质网的内质网 和核膜，和核膜， 可见可见G-6-PG-6-P 酶阳性反酶阳性反 应产物。应产物。 ( (32000)32000) 肝细胞。

58、箭头指线粒体，线粒体嵴、内膜基质侧呈现琥珀酸肝细胞。箭头指线粒体，线粒体嵴、内膜基质侧呈现琥珀酸 脱氢酶阳性反应颗粒（脱氢酶阳性反应颗粒（3600036000） 。 IgAN, TGFs2IgAN, TGFs2的表达，免疫金银法的表达，免疫金银法 IgAN, TGFs2IgAN, TGFs2的表达，免疫金银法的表达，免疫金银法 K4MK4M低温包埋剂和紫外线低温包埋机联合的低温包埋剂和紫外线低温包埋机联合的 免疫电镜法免疫电镜法 （实验结果介绍）（实验结果介绍） 免疫电镜技术是从超微结构水平能显示抗原和抗体结合免疫电镜技术是从超微结构水平能显示抗原和抗体结合 后在细胞微细结构水平的定位，这一技

59、术已成为目前生物医后在细胞微细结构水平的定位，这一技术已成为目前生物医 学领域的一项重要研究手段。但是，由于免疫电镜技术因多学领域的一项重要研究手段。但是，由于免疫电镜技术因多 种原因造成的重复性差或技术的不稳定性，加之目前电镜包种原因造成的重复性差或技术的不稳定性，加之目前电镜包 埋所采用的是环氧树脂埋所采用的是环氧树脂618618或或812812，都需高温聚合，这样可使，都需高温聚合，这样可使 多种抗原活性减低或丧失。本研究组选用了多种抗原活性减低或丧失。本研究组选用了Lowicryls K4MLowicryls K4M低低 温包埋剂和紫外线低温包埋机（温包埋剂和紫外线低温包埋机（SPI#

60、17020SPI#17020），对免疫电镜观），对免疫电镜观 察的标本进行了处理，目的是更好的保存被检测组织中抗原察的标本进行了处理，目的是更好的保存被检测组织中抗原 的活性，提高检出率。现将一些不成熟的经验和存在的问题的活性，提高检出率。现将一些不成熟的经验和存在的问题 进行一下总结。进行一下总结。 一、一、紫外线低温包埋机（紫外线低温包埋机（SPI#17020SPI#17020） SPI#17020SPI#17020是美国特殊研制的低温包埋机，它最主要的特是美国特殊研制的低温包埋机，它最主要的特 点是采用数字化温度控制，点是采用数字化温度控制， 通常采用干冰制冷，也可以使用通常采用干冰制冷