病毒的分离鉴定

1、1 病毒分离鉴定与 常用序列分析软件简介 云南省地方病防治所 病毒立克次体病防治科 冯 云 E-mail: 2012.5.30 2 一、病毒的分离 标本的处理 蚊虫；蜱；蠓等； 血清；脑脊液等； 动物组织标本（脑，肺，脾等） 病毒的分离 动物接种 组织培养 鸡胚培养 蚊虫饲养分离病毒 “全程冷链全程冷链” 3 1 1动物接种动物接种 动物分离病毒法：乳小白鼠（动物分离病毒法：乳小白鼠（3日龄）日龄） 优点：优点：很敏感，易掌握；病毒可随传代次数的增加而增强，有利于病毒分离； 缺点：缺点：小白鼠本身存在多种病毒性疾病，往往会影响结果；小鼠也可能存在个体差 异； 接种途径：接种途径： 脑内接种脑内

2、接种 皮下接种 皮内接种 腹腔接种 肌肉接种 静脉接种 实验动物的观察：实验动物的观察： 动物的发育、活动力、食欲和粪便 特殊症状：震颤、弓背、不安、嗜睡、 瘫痪、抽搐等直至死亡 有些实验还需测量动物的体温和体重 4 （1）原代和次代细胞培养 （2）二倍体细胞培养 （3）传代细胞培养传代细胞培养 （4）病毒在培养细胞中增殖的指标 1）细胞病变 2）红细胞吸附 3）干扰现象 4）细胞代谢的改变 组织培养分离法：组织培养分离法： 没有隐性感染没有隐性感染 没有免疫能力的抵抗力没有免疫能力的抵抗力 接种量大接种量大 培养条件易于控制培养条件易于控制 加速病毒的分离过程加速病毒的分离过程 汉坦病毒敏感

3、的培养细胞汉坦病毒敏感的培养细胞 l首先发现人肺癌细胞（A549） l其他敏感细胞： Vero-E6、2BS、RL、CEC等 2 2组织培养组织培养 5 细胞病变细胞病变 （CPE ）：）： 1、分布均匀的小 颗粒状破坏病变； 2、局灶状小颗粒 状破坏； 3、细胞圆化，呈 局灶性葡萄状的堆 积； 4、细胞融合。 圆缩； 脱落； 聚集； 破碎； 6 3鸡胚培养鸡胚培养 优点：优点：对大多数病毒均较敏感，其病毒繁 殖量较高； 来源方便、经济，管理方便； 缺点：缺点：操作不当污染，导致胚胎死亡； 4蚊虫分离病毒法蚊虫分离病毒法 经口感染经口感染 胸腔接种胸腔接种 优点：优点：病毒可长时间保存在蚊体内

4、； 蚊虫饲养较实验动物容易，数 量大； 缺点：缺点：必须经常了解蚊子体内是否确 已带毒； 7 强调点强调点：实验室生物安全 n实验室安全是重中之重，如果实验室的条 件不具备，建议不要开展病毒分离工作； n在进行相关实验的时候一定要严格按步骤 操作； n实验过程中一定要做好严格防护。 8 1）蚀斑（蚀斑（plaque）测定）测定 可进行病毒的分离纯化； 蚀斑形成单位（plaque forming unit, PFU） 2）50%感染量或感染量或50%组织感染量（组织感染量（ID50或或TCID50）测定）测定 （一）（一）病毒的数量与感染性测定病毒的数量与感染性测定 二、病毒的鉴定 结晶紫染色

5、中性红染色 9 1）病毒核酸类型的测定）病毒核酸类型的测定 2）理化性状的检测：大小及结构、衣壳对称类型、有无包膜等）理化性状的检测：大小及结构、衣壳对称类型、有无包膜等 3）血清学鉴定）血清学鉴定 ELISA；IFA； （二）（二）病毒理化性质及血清学鉴定病毒理化性质及血清学鉴定 10 阳性分离物上清阳性分离物上清 提取总提取总RNA 反转录合成反转录合成cDNA 直接测序或克隆测序直接测序或克隆测序 PCR扩增扩增 （三）（三）病毒分子生物学鉴定病毒分子生物学鉴定 11 什么是聚合酶链式反应什么是聚合酶链式反应 n聚合酶链式反应聚合酶链式反应（polymerase chain reacti

6、on, PCR） 是一种在体外特异地扩增已知基因的方法；是一种在体外特异地扩增已知基因的方法； 由由K. Mullis于于1983年建立年建立； 可用于分析基因及其产物的水平变化；可用于分析基因及其产物的水平变化； 可进行实时、定量分析可进行实时、定量分析； 可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列序列 的相互作用。的相互作用。 12 PCR技术的工作原理技术的工作原理 PCR操作过程操作过程 1、预变性（预变性（Initial denaturation）：）： 模板DNA 完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95加热3-5 分钟； 2、引物退火（引物退火（

7、Primer annealing）：）：退火温度一 般需要凭实验经验决定，退火温度对PCR的特异性有 较大影响； 3、引物延伸（引物延伸（Primer elongation）：）：引物延伸 一般在72 进行（Taq酶最适温度），延伸时间随扩 增片段长短而定； 4、循环中的变性步骤：循环中的变性步骤：循环中一般95，30秒足 已使各种靶DNA序列完全变性，变性时间过长损害酶 活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败； 5、循环数：循环数：大多数PCR含25-35个循环，过多易产 生非特异条带； 6、最后延伸：最后延伸：在最后一个循环后，反应在72 维持 5-15分钟，使引物延伸完全，并使单链产

8、物退火成双 链。 13 PCR的各种变体的各种变体 反向PCR（Inverse PCR，IPCR） 不对称PCR（Asymmetric PCR） 多重PCR 荧光定量PCR（Q-PCR） 反转录PCR（Reverse transcription PCR，RT- PCR） 巢式PCR（NEST PCR） 递减PCR（Touchdown PCR） 14 可用于可用于mRNA的半定量分析的半定量分析 反 转 录反 转 录 P C R ( r e v e r s e transcription-PCR，RT-PCR) 是是 一种简单、快捷地对一种简单、快捷地对RNA进行定进行定 性、定量分析的方法。它

9、是以性、定量分析的方法。它是以 mRNA为模板，体外扩增为模板，体外扩增cDNA， 再以再以cDNA为模板进行特定基因转为模板进行特定基因转 录产物的录产物的PCR扩增。扩增。RT-PCR技术技术 一般用于一般用于RNA的定性分析；如果的定性分析；如果 设置阳性参照，则可对待测设置阳性参照，则可对待测RNA 样品进行半定量分析。样品进行半定量分析。 该方法适合对待测样品进行初步该方法适合对待测样品进行初步 筛选，目前已广泛被实时定量筛选，目前已广泛被实时定量 PCR替代。替代。 1反转录反转录PCR Trans反转录酶系列 15 常用于常用于mRNA的定量分析的定量分析 实时定量实时定量PCR

10、 (Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR) 是定量分是定量分 析析mRNA的最通用、最快速、的最通用、最快速、 最简便的方法，该方法是对最简便的方法，该方法是对 PCR反应进行实时监测，具有反应进行实时监测，具有 很高的灵敏度和特异性。很高的灵敏度和特异性。 2实时定量实时定量PCR SYBR Green实时定量 实时定量PCR分析原理示意图分析原理示意图 16 *目前有目前有5种技术用于实时定量种技术用于实时定量PCR 其中最经济、简便的技术是利用其中最经济、简便的技术是利用荧光染料荧光染料（如（如SYBR Green

11、 ）与双链）与双链DNA分子结合发光的特性，指示扩增产分子结合发光的特性，指示扩增产 物的增加；物的增加； 其他其他4种方法都是以荧光染料标记的寡核苷酸为探针种方法都是以荧光染料标记的寡核苷酸为探针 与正确的扩增子杂交，包括与正确的扩增子杂交，包括5核酸酶法核酸酶法（即人们熟知的（即人们熟知的 TaqManTM）、）、分子信标分子信标、ScropionsTM和和探针杂交法探针杂交法， 它们拥有更强的特异性，可以避免对它们拥有更强的特异性，可以避免对PCR后溶解曲线的后溶解曲线的 需求，以及后续的需求，以及后续的Southern杂交或对扩增子的测序鉴定，杂交或对扩增子的测序鉴定， 但是但是成本较

12、高成本较高。 17 3.DNA芯片技术芯片技术 nDNA芯片（芯片（DNA chip） 在固相支持物上有序固化寡在固相支持物上有序固化寡 核苷酸或核苷酸或DNA探针，与待测探针，与待测 荧光标记样品进行杂交；荧光标记样品进行杂交； 通过对杂交信号的检测、比通过对杂交信号的检测、比 较和分析，得出样品的遗传较和分析，得出样品的遗传 信息信息(基因序列及表达基因序列及表达)； 亦被称作亦被称作DNA微阵列微阵列(DNA microarray)。 基因芯片工作流程基因芯片工作流程 18 三、生物信息学是预测基因组结构和功三、生物信息学是预测基因组结构和功 能的重要手段能的重要手段 n数据库的建设：数

13、据库的建设：汇集汇集 了大量了大量DNA序列、蛋白序列、蛋白 质信息质信息 预测基因、基因产物的预测基因、基因产物的 结构、功能；分析基因结构、功能；分析基因- 基因、基因基因、基因-产物、产物产物、产物- 产物之间的相互作用或产物之间的相互作用或 联系；描述细胞或整体联系；描述细胞或整体 水平的基因表达谱；推水平的基因表达谱；推 测系统发生关系。测系统发生关系。 人类X染色体图谱 19 NCBI数据库数据库 NCBI首先创建首先创建GenBank数据库数据库 于于19911991年开发了年开发了Entrez数据库检索系统，该系统整合了数据库检索系统，该系统整合了 GenBank、EMBL、PIR和和SWISS-PROT等数据库的序列信等数据库的序列信 息以及息以及MEDLINEMEDLINE有关序列的文献信息，并通过相关链接，将有关序列的文献信息，并通过相关链接，将 他们有机地结合在一起他们有机地结合在一起 NCBI还提供了其他数据库，包括在线人类孟德尔遗传还提供了其他数据库，包括在线人类孟德尔遗传 ( (OMIM）、三维蛋白结构的分子模型数据库（）、三维蛋白结构的分子模型数据库（MMDB）、人）、人 类基因序列集成（类基因序列集成（UniGene）、人类基因组基因图谱）、人类基因组基因图谱 （GMHG）、生物门类（）