[高等教育]8蛋白质和氨基酸的测定

1、食品理化分析食品理化分析 2011年04月 8 8 蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定 3 本节概要本节概要 4 2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 1 8-1 概述概述 8-4 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定比色分析法比色分析法 4 5 8-5 食品中氨基酸态氮的测定食品中氨基酸态氮的测定 3 8-3 乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定 1、蛋白质的测定原理、测定方法、注意事项。、蛋白质的测定原理、测定方法、注意事项。 2、氨基酸的测定原理、测定方法、注意事项。、氨基酸的测定原理、测定方法、注意事项。 3、乳与乳制品中非蛋白氮含

2、量的测定原理、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定原理 1、蛋白质的性质和测定意义；、蛋白质的性质和测定意义； 2、凯氏定氮法测定蛋白质的原理和方法摘要；、凯氏定氮法测定蛋白质的原理和方法摘要； 3、熟悉凯氏定氮仪的工作原理和使用方法。、熟悉凯氏定氮仪的工作原理和使用方法。 2.重点重点 1、凯氏定氮法中蛋白质原理和关键环节。、凯氏定氮法中蛋白质原理和关键环节。 2、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定原理。、乳与乳制品中非蛋白氮含量的测定原理。 3.难点难点 3. 1.基本知识点基本知识点 8 8 蛋白质和氨基酸的测定蛋白质和氨基酸的测定 学习目标学习目标 8-1 8-1 概述概述 蛋白质是食品的重要组

3、成成分，蛋白质一蛋白质是食品的重要组成成分，蛋白质一 词，在希腊文中是词，在希腊文中是“第一重要第一重要”的意思，也就的意思，也就 所谓蛋白质是生命的基础。食品的营养价值的所谓蛋白质是生命的基础。食品的营养价值的 高低，主要看蛋白质的高低。除了保证食品的高低，主要看蛋白质的高低。除了保证食品的 营养价值外，在决定食品的色、香、味及结构营养价值外，在决定食品的色、香、味及结构 等特征上也起着重要的作用。等特征上也起着重要的作用。 一、蛋白质的组成 蛋白质是复杂的含氮有机化合物，它由蛋白质是复杂的含氮有机化合物，它由2020 多种多种氨基酸氨基酸通过通过酰胺键以一定的方式结合起来，以一定的方式结合

4、起来， 并具有复杂的空间结构。它主要含的元素是并具有复杂的空间结构。它主要含的元素是C 、 H、O、N、S、P另外还有一些微量元素另外还有一些微量元素Fe、Zn、 I、Cu、Mn。而而含N是蛋白质区别于其他有机化 合物的重要标志。 二、氨基酸 propro是由氨基酸组成的高分子化合物，目是由氨基酸组成的高分子化合物，目 前各种氨基酸已达前各种氨基酸已达175175种以上，但是构成种以上，但是构成propro的的 氨基酸主要是其中的氨基酸主要是其中的2020种。种。 赖氨酸 丙氨酸 谷氨酸 甘氨酸 天冬氨酸 缬氨酸 天冬酰胺 丝氨酸 8-1 8-1 概述概述 三、蛋白质测定的意义 蛋白质是微生物

5、发酵过程中所必需的重要氮源之一。蛋白质是微生物发酵过程中所必需的重要氮源之一。 发酵原料中蛋白质含量的高低对发酵产品的质量影发酵原料中蛋白质含量的高低对发酵产品的质量影 响很大。响很大。 啤酒生产要选用蛋白质含量较低的大麦等原料，因啤酒生产要选用蛋白质含量较低的大麦等原料，因 啤酒酿造中，原料（大麦芽）中蛋白质含量过高，可造啤酒酿造中，原料（大麦芽）中蛋白质含量过高，可造 成啤酒浑浊、高级醇含量偏高。成啤酒浑浊、高级醇含量偏高。 但对酱和酱油等发酵调味品来讲，则需要选用蛋白但对酱和酱油等发酵调味品来讲，则需要选用蛋白 质含量较高的原料；质含量较高的原料； 至于活性干酵母，含氮量则是评价其成品质

6、量的一至于活性干酵母，含氮量则是评价其成品质量的一 个重要指标，主要是判定活性酵母菌的数量。个重要指标，主要是判定活性酵母菌的数量。 蛋白质是人体重要的营养物质，测定食品中的蛋白蛋白质是人体重要的营养物质，测定食品中的蛋白 质含量，对合理调配膳食，保证不同人群的营养需求，质含量，对合理调配膳食，保证不同人群的营养需求， 掌握食品的营养价值，合理开发利用食品资源，控制食掌握食品的营养价值，合理开发利用食品资源，控制食 品加工中食品的品质、质量都具有重要的意义。品加工中食品的品质、质量都具有重要的意义。 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 一、概述 凯氏凯氏（Kj

7、eldahKjeldah）定氮法是目前普遍采用的测定有机定氮法是目前普遍采用的测定有机N N总量较为准确、方便的方法之一，总量较为准确、方便的方法之一， 适用于所有食品，所以国内外应用较为广泛。是经典的分析方法之一，也是适用于所有食品，所以国内外应用较为广泛。是经典的分析方法之一，也是GB/T 5009.5-GB/T 5009.5- 20032003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法，由于该法是丹麦人道尔（第一法，由于该法是丹麦人道尔（J.KjeldahJ.Kjeldah）于于18831883年提出年提出 用于测定研究蛋白质而得名。用于测定研究蛋白质而得名。 凯氏定氮法是将蛋白质消化，

8、测定其总凯氏定氮法是将蛋白质消化，测定其总N N量，再换算成为蛋白质含量。食品中的含量，再换算成为蛋白质含量。食品中的含N N物物 质，除蛋白质中的氮以外，还包括氨基酸、酰胺、核酸等中的氮等少量的非蛋白质含质，除蛋白质中的氮以外，还包括氨基酸、酰胺、核酸等中的氮等少量的非蛋白质含N N物质，物质， 所以该法测定的蛋白质含量应称为所以该法测定的蛋白质含量应称为粗蛋白质。粗蛋白质。 对于不同的蛋白质，它的组成和结构不同，但从分析数据可以得到近似的对于不同的蛋白质，它的组成和结构不同，但从分析数据可以得到近似的propro的元素组的元素组 成百分比。成百分比。 一般来说，一般来说，propro的平均

9、含氮量为的平均含氮量为16%16%，即，即1 1份份N N素相当于素相当于6.256.25份蛋白质，所以在用凯氏定份蛋白质，所以在用凯氏定 氮法定量氮法定量propro时，将测得的总氮时，将测得的总氮% %乘上乘上propro的换称参数的换称参数K=6.25K=6.25即为该物质的即为该物质的propro含量。含量。 蛋白质含蛋白质含N N量的倒数称为蛋白质换算系数。量的倒数称为蛋白质换算系数。 元素元素C CH HO ON NS SP P 百分比百分比50507 7232316160 03 30 03 3 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 一、概述 但是我

10、们必须要知道，食品种类不同，蛋白质的组成也不一但是我们必须要知道，食品种类不同，蛋白质的组成也不一 样，其样，其N N量也不相同，蛋白质换算系数差别很大，我们在测定量也不相同，蛋白质换算系数差别很大，我们在测定 propro时，应该是不同的食品采用不同的换算等数。如：玉米、荞时，应该是不同的食品采用不同的换算等数。如：玉米、荞 麦为麦为6.256.25， 花生：花生：5.465.46；大米：；大米：5.955.95；大豆及其制品：；大豆及其制品：5.715.71； 面粉：面粉：5.705.70；乳制品：；乳制品：6.386.38； 凯氏定氮法凯氏定氮法（Kjeldahl determinati

11、onKjeldahl determination）有常量法、微量法有常量法、微量法 及改良法，其原理基本相同，只是所使用的样品数量和仪器不及改良法，其原理基本相同，只是所使用的样品数量和仪器不 同。而改良的常量法主要是催化剂的种类、硫酸和盐类添量不同。而改良的常量法主要是催化剂的种类、硫酸和盐类添量不 同，一般采用硫酸铜、二氧化钛或硒、汞等物质代替硫酸铜。同，一般采用硫酸铜、二氧化钛或硒、汞等物质代替硫酸铜。 有些样品中含有难以分解的含有些样品中含有难以分解的含N N化合物，如：蛋白质中含有化合物，如：蛋白质中含有 色氨酸、赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、脯氨酸等，单纯以硫酸铜色氨酸、赖氨酸、组氨酸、

12、酪氨酸、脯氨酸等，单纯以硫酸铜 作催化剂，作催化剂，1818小时或更长时间也难经分解，单独用汞化合物，小时或更长时间也难经分解，单独用汞化合物， 在短时间内即可，但它有毒性。在短时间内即可，但它有毒性。 下面主要介绍下面主要介绍微量凯氏定氮法。微量凯氏定氮法。 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 常量分析（常量分析（macro analysismacro analysis）对对0.1g0.1g以上的试样进行的分析。以上的试样进行的分析。 半微量分析（半微量分析（semimicro analysissemimicro analysis）对对10mg10mg100

13、 mg100 mg的试样进行的分析。的试样进行的分析。 GB/T 5413.1-1997 GB/T 5413.1-1997 婴幼儿配方食品和乳粉蛋白质的测定就是半微量凯氏定氮法婴幼儿配方食品和乳粉蛋白质的测定就是半微量凯氏定氮法 微量分析微量分析（micro analysismicro analysis）对对1mg11mg110 mg10 mg的试样进行的分析。的试样进行的分析。 超微量分析（超微量分析（ultramicro analysisultramicro analysis）对对1mg1mg以下的试样进行的分析。以下的试样进行的分析。 痕量分析（痕量分析（trace analysistr

14、ace analysis）对待测组分的质量分数小于对待测组分的质量分数小于0.01%0.01%的分析。的分析。 超痕量分析（超痕量分析（ultratrace analysisultratrace analysis）对待测组分的质量分数小于对待测组分的质量分数小于0.0001%0.0001%的分析。的分析。 GB/T 14666-2003GB/T 14666-2003分析化学术语分析化学术语 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 二、原理（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） 蛋白质是

15、含氮的有机化合物。食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，使蛋白质分解，蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和硫酸铜、硫酸钾一同加热消化，使蛋白质分解， 分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴 定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。 凯氏定氮法凯氏定氮法（化学）（化学）反机理如下：反机理如下： 1、2CH3CHCOOH+13H2SO4=（NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O NH

16、2 2、（、（NH4）2SO4+2NaOH=2NH3+Na2SO4+2H2O 3、2NH3+2H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O 4、(NH4)2B4O7+HCL+5H2O=2NH4CL+4H3BO3 反应（反应（1 1）、）、(2)(2)在凯氏瓶内完成，反应（在凯氏瓶内完成，反应（3 3）在凯氏蒸馏装置中进行。）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入为了加速消化，可以加入CuSOCuSO4 4作催化剂，作催化剂，K K2 2SOSO4 4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液， 滴定则用强酸。滴定则用强酸。 8-2 8-2 食品中蛋白质测定

17、食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 三、方法摘要（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法第一法） Kjeldahl determination测定蛋白质含量主要分三个步骤：测定蛋白质含量主要分三个步骤： （一）消化 样品中的有机物和含样品中的有机物和含N N有机化合物，经浓有机化合物，经浓H H2 2SOSO4 4加热消化，加热消化，H H2 2SOSO4 4使有机物脱水，炭化为碳；使有机物脱水，炭化为碳； 碳将碳将H H2 2SOSO4 4还原为还原为SOSO2 2，而本身则变为，而本身则变为COCO2 2；SOSO2 2

18、使使N N还原为还原为NHNH3 3，而本身则氧化为，而本身则氧化为SOSO3 3，而消化过程，而消化过程 中所生成的新生态氢，又加速了氨的形成。在反应中生成物中所生成的新生态氢，又加速了氨的形成。在反应中生成物COCO2 2、H H2 2O O和和SOSO2 2、SOSO3 3逸去，而逸去，而NHNH3 3与与 H H2 2SOSO4 4结合生成（结合生成（NHNH4 4）2 2SOSO4 4留在消化液中。留在消化液中。 蛋白质蛋白质+ H2SO4 C C+ H2SO4SO2+CO2 SO2+N NH3+SO3 NH3+ H2SO4（NH4）2SO4 2CH3CHCOOH+13H2SO4 =

19、（ （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O NH2 脱水脱水 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 三、方法摘要（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法第一法） （二）碱化、蒸馏 （NH4）2SO4在碱性条件下，加热蒸馏，释放出氨。在碱性条件下，加热蒸馏，释放出氨。 （NH4）2SO4+2NaOH=2NH3+Na2SO4+2H2O （三）吸收、滴定 蒸馏过程中所放出的蒸馏过程中所放出的NHNH3 3，可用一定量的标准硼酸溶液吸收，再用标准盐酸溶液直接滴定。，可用一定量的标准硼酸溶液

20、吸收，再用标准盐酸溶液直接滴定。 2NH3+2H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O (NH4)2B4O7+HCL+5H2O=2NH4CL+4H3BO3 硼酸溶液仅呈极微弱的酸性，在此反应中并不影响所加的指示剂的变色反应，但具有吸收硼酸溶液仅呈极微弱的酸性，在此反应中并不影响所加的指示剂的变色反应，但具有吸收 氨的作用，所以采用之作吸收剂。氨的作用，所以采用之作吸收剂。 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 四、仪器（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） 1 1、凯氏烧瓶、凯氏烧

21、瓶500mL500mL或或250mL250mL 2 2、龙科、龙科AA凯氏定氮仪凯氏定氮仪 3 3、扭力天平、扭力天平 4 4、分析天平、分析天平 5 5、5 5mLmL移液管移液管 6 6、温度可以控制的电炉、温度可以控制的电炉 7 7、小漏斗、小漏斗 8 8、滴定管、滴定管 9 9、250250mLmL锥形瓶锥形瓶 1010、玻璃珠、玻璃珠 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 四、仪器（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定

22、氮法凯氏定氮法 四、仪器（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） FSPYL014 FSPYL014 饮料饮料 蛋白质的测定蛋白质的测定 凯氏定氮法凯氏定氮法 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 四、仪器（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） 改良式定氮蒸馏器改良式定氮蒸馏器 半微量定氮蒸馏器半微量定氮蒸馏器 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 四、仪器（GB/T 500

23、9.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 五、试剂（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） 1 1、硫酸铜、硫酸铜 ( (CuSOCuSO4 45H5H2 2O)O)。 2 2、硫酸钾。、硫酸钾。 3 3、硫酸、硫酸 ( (密度为密度为1.84191.8419g/L)g/L)。 4 4、硼酸溶液、硼酸溶液 (20 (20g/L)g/L)。 5 5、氢氧化钠溶液、氢氧化钠溶液 (400 (4

24、00g/L)g/L)。 6 6、盐酸标准滴定溶液、盐酸标准滴定溶液 c(HCl)=0.0500mol/L c(HCl)=0.0500mol/L 或或 硫酸标准滴定溶液硫酸标准滴定溶液 c(1/2Hc(1/2H2 2SOSO4 4)=0.0500mol/L )=0.0500mol/L 。 7 7、混合指示液：、混合指示液：1 1份甲基红乙醇溶液份甲基红乙醇溶液 (1 (1g/L) g/L) 与与5 5份溴甲酚绿乙醇溶液份溴甲酚绿乙醇溶液(1(1g/L) g/L) 临用时混合。临用时混合。 ( (也可用也可用2 2份甲基红乙醇溶液份甲基红乙醇溶液(1(1g/L)g/L)与与1 1份次甲基蓝乙醇溶液

25、份次甲基蓝乙醇溶液(1(1g/L)g/L)临用时混合临用时混合) )。 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 五、试剂（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） （GB/T 601-2002 GB/T 601-2002 化学试剂化学试剂 标准滴定溶液的制备）标准滴定溶液的制备） 盐酸标准滴定溶液盐酸标准滴定溶液 c(HCl)=0.0500mol/Lc(HCl)=0.0500mol/L配制与标定配制与标定 1 1、配制、配制 按下表的规定量取盐酸，注入按下表的规定量取盐酸，注入1000mL

26、1000mL水中，摇匀。水中，摇匀。 常用酸碱浓度表常用酸碱浓度表( (市售商品市售商品) ) （GB/T5009.1-2003 GB/T5009.1-2003 食品卫生检验方法食品卫生检验方法 理化部分理化部分 总则总则） 盐酸标准滴定溶液的浓度盐酸标准滴定溶液的浓度 c c(HCl) mol/L(HCl) mol/L盐酸的体积盐酸的体积V /mLV /mL 1 19090 0.50.54545 0.10.19 9 试剂名称试剂名称分子量分子量含量含量/(%)(质量分数质量分数)相对密度相对密度浓度浓度/(mol/L) 盐酸盐酸36.536381.18(约约)12(HCl) 硝酸硝酸63.0

27、265681.416(HNO3) 高氯酸高氯酸100.5701.6712(HClO4) 磷酸磷酸98.0851.7015(H3PO4) 硫酸硫酸98.196981.84(约约)18(H2SO4) 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 五、试剂（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） （GB/T 601-2002 GB/T 601-2002 化学试剂化学试剂 标准滴定溶液的制备）标准滴定溶液的制备） 盐酸标准滴定溶液盐酸标准滴定溶液 c(HCl)=0.0500mol/Lc(HCl)=0.

28、0500mol/L配制与标定配制与标定 2 2、标定、标定 按下表的规定称取于按下表的规定称取于270270300300高温炉中灼烧至恒重的工作基准试剂无水碳高温炉中灼烧至恒重的工作基准试剂无水碳 酸钠，溶于酸钠，溶于50mL50mL水中，加水中，加1010滴溴甲酚绿滴溴甲酚绿- -甲基红指示液，用配制好的盐酸溶液滴定至溶液由绿甲基红指示液，用配制好的盐酸溶液滴定至溶液由绿 色变为暗红色，煮沸色变为暗红色，煮沸2min2min，冷却后继续滴定至溶液再呈暗红色。同时做空白试验。，冷却后继续滴定至溶液再呈暗红色。同时做空白试验。 说明：说明： u 称量工作基准试剂的质量的数值小于等于称量工作基准试

29、剂的质量的数值小于等于0.5g0.5g时，按精确至时，按精确至0.01mg0.01mg称量称量; ;数值大于数值大于0.5g0.5g时，时， 按精确至按精确至0.1mg0.1mg称量。称量。 u 在标定和使用标准滴定溶液时，滴定速度一般应保持在在标定和使用标准滴定溶液时，滴定速度一般应保持在6 mL/min6 mL/min8 mL/min8 mL/min。 u 制备标准滴定溶液的浓度值应在规定浓度值的制备标准滴定溶液的浓度值应在规定浓度值的5%5%范围以内。范围以内。 盐酸标准滴定溶液的浓度盐酸标准滴定溶液的浓度 c c(HCl) mol/L(HCl) mol/L 工作基准试剂无水碳酸钠的质量

30、工作基准试剂无水碳酸钠的质量m/gm/g 1 11.9 1.9 0.50.50.950.95 0.10.10.20.2 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 五、试剂（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） （GB/T 601-2002 GB/T 601-2002 化学试剂化学试剂 标准滴定溶液的制备）标准滴定溶液的制备） 盐酸标准滴定溶液盐酸标准滴定溶液 c(HCl)=0.0500mol/Lc(HCl)=0.0500mol/L配制与标定配制与标定 2 2、标定、标定 盐酸标准滴定溶液

31、的浓度盐酸标准滴定溶液的浓度c(HCl)c(HCl)，数值以摩尔每升（，数值以摩尔每升（mol/Lmol/L）表示）表示, ,按下式计算按下式计算: : 式中式中: : mm无水碳酸钠的质量的准确数值，单位为克无水碳酸钠的质量的准确数值，单位为克(g)(g)； V V1 1盐酸溶液的体积的数值，单位为毫升盐酸溶液的体积的数值，单位为毫升(mL)(mL)； V V2 2空白试验盐酸溶液的体积的数值，单位为毫升空白试验盐酸溶液的体积的数值，单位为毫升(mL)(mL)； MM无水碳酸钠的摩尔质量的数值，单位为克每摩尔（无水碳酸钠的摩尔质量的数值，单位为克每摩尔（g/molg/mol） （1/2Na1

32、/2Na2 2COCO3 3）=52.994=52.994。 u 标准滴定溶液的浓度小于等于标准滴定溶液的浓度小于等于0.02mol/L0.02mol/L时，应于临用前将浓度高的标准滴定溶液用煮沸并时，应于临用前将浓度高的标准滴定溶液用煮沸并 冷却的水稀释，必要时重新标定。冷却的水稀释，必要时重新标定。 u 除另有规定外，标准滴定溶液在常温除另有规定外，标准滴定溶液在常温15152525下保存时间一般不超过两个月。当溶液出现下保存时间一般不超过两个月。当溶液出现 浑浊、沉淀、颜色变化等现象时，应重新制备。浑浊、沉淀、颜色变化等现象时，应重新制备。 u 贮存标准滴定溶液的容器，其材料不应与溶液起

33、理化作用，壁厚最薄处不小于贮存标准滴定溶液的容器，其材料不应与溶液起理化作用，壁厚最薄处不小于0.5mm0.5mm。 MVV m c 21 1000 )HCl( 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 五、试剂（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） （GB/T 601-2002 GB/T 601-2002 化学试剂化学试剂 标准滴定溶液的制备）标准滴定溶液的制备） 硫酸标准滴定溶液硫酸标准滴定溶液 c(1/2Hc(1/2H2 2SOSO4 4)=0.0500mol/L)=0.0500m

34、ol/L 1 1、配制、配制 按下表的规定量取硫酸，缓缓往入按下表的规定量取硫酸，缓缓往入1000mL1000mL水中，冷却，摇匀。水中，冷却，摇匀。 2 2、标定、标定 按下表的规定称取于按下表的规定称取于270270300300高温炉中灼烧至恒重的工作基准试剂无水碳高温炉中灼烧至恒重的工作基准试剂无水碳 酸钠，溶于酸钠，溶于50mL50mL水中，加水中，加1010滴溴甲酚绿滴溴甲酚绿- -甲基红指示液，用配制好的硫酸溶液滴定至溶液由绿甲基红指示液，用配制好的硫酸溶液滴定至溶液由绿 色变为暗红色，煮沸色变为暗红色，煮沸2min2min，冷却后继续滴定至溶液再呈暗红色。同时做空白试验。，冷却后

35、继续滴定至溶液再呈暗红色。同时做空白试验。 硫酸标准滴定溶液的浓度硫酸标准滴定溶液的浓度 c(1/2H2SO4) mol/Lmol/L硫酸的体积硫酸的体积V /mL/mL 1 13030 0.50.51515 0.10.13 3 硫酸标准滴定溶液的浓度硫酸标准滴定溶液的浓度c(1/2Hc(1/2H2 2SOSO4 4)/ mol/L)/ mol/L 工作基准试剂无水碳酸钠的质量工作基准试剂无水碳酸钠的质量m/gm/g 1 11.9 1.9 0.50.50.950.95 0.10.10.20.2 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 五、试剂（GB/T 5009.

36、5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） （GB/T 601-2002 GB/T 601-2002 化学试剂化学试剂 标准滴定溶液的制备）标准滴定溶液的制备） 硫酸标准滴定溶液硫酸标准滴定溶液 c(1/2Hc(1/2H2 2SOSO4 4)=0.0500mol/L)=0.0500mol/L 2 2、标定、标定 硫酸标准滴定溶液的浓度硫酸标准滴定溶液的浓度c(1/2Hc(1/2H2 2SOSO4 4),),数值以摩尔每升（数值以摩尔每升（mol/Lmol/L）表示）表示，按下式按下式 计算计算: : 式中式中: : mm无水碳酸钠的质量的准

37、确数值，单位为克无水碳酸钠的质量的准确数值，单位为克(g)(g)； V V1 1硫酸溶液的体积的数值，单位为毫升硫酸溶液的体积的数值，单位为毫升(mL)(mL)； V V2 2空白试验硫酸溶液的体积的数值，单位为毫升空白试验硫酸溶液的体积的数值，单位为毫升(mL)(mL)； MM无水碳酸钠的摩尔质量的数值，单位为克每摩尔（无水碳酸钠的摩尔质量的数值，单位为克每摩尔（g/molg/mol） （1/2Na1/2Na2 2COCO3 3）=52.994=52.994。 MVV m SOHc 21 42 1000 ) 2 1 ( 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 五

38、、试剂（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） 溴甲酚绿甲基红指示液溴甲酚绿甲基红指示液（GB/T 603-2002 GB/T 603-2002 化学试剂化学试剂 试验方法中所用制剂及制品的制备试验方法中所用制剂及制品的制备） 溶液溶液I I：称取称取0.1g0.1g溴甲酚绿，溶于乙醇溴甲酚绿，溶于乙醇(95%)(95%)，用乙醇，用乙醇(95%)(95%)稀释至稀释至100mL100mL。 溶液溶液：称取称取0.2g0.2g甲基红，溶于乙醇甲基红，溶于乙醇(95%)(95%)，用乙醇，用乙醇(95%)(95%)稀释

39、至稀释至100mL100mL。 取取30mL30mL溶液溶液I I、10mL10mL溶液溶液，混匀。，混匀。 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 六、分析步骤（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） （一）（一）试样处理 1 1、称样、称样 ( (约相当氮约相当氮30mg30mg40mg)40mg) （1 1）固体试样：称取固体试样：称取0.20g0.20g2.00g2.00g （2 2）半固体试样半固体试样：称取称取2.00g2.00g5.00g5.00g （3 3）液体试样：吸取

40、液体试样：吸取10.00mL10.00mL25.00mL25.00mL 2 2、消化准备、消化准备 将试样移入洗净、烘干、编号的将试样移入洗净、烘干、编号的100mL100mL或或500mL500mL的凯氏烧的凯氏烧 瓶内瓶内 ，加入，加入0.2g0.2g硫酸铜，硫酸铜，6g6g硫酸钾及硫酸钾及20mL20mL硫酸，加入硫酸，加入2 2粒粒3 3粒玻璃珠，粒玻璃珠， 稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以4545角斜支于有小孔的石棉网上。角斜支于有小孔的石棉网上。 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 六、分析步骤（GB/T 5009.

41、5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） （一）（一）试样处理 3 3、消化、消化 将准备好的凯氏烧瓶以将准备好的凯氏烧瓶以4545斜放于温控电炉上（先垫上石棉网），开始用微火小斜放于温控电炉上（先垫上石棉网），开始用微火小 心加热，（小心瓶内泡沫冲出而影响结果！），待内容物全部炭化心加热，（小心瓶内泡沫冲出而影响结果！），待内容物全部炭化, ,泡沫完全停止，瓶内有白烟泡沫完全停止，瓶内有白烟 冒出后，升至中温，白烟散尽后升至高温，加强火力冒出后，升至中温，白烟散尽后升至高温，加强火力, ,并保持瓶内液体微沸并保持瓶内液体微沸, ,（为加

42、快消化速度（为加快消化速度, , 可分数次加入可分数次加入10mL30%10mL30%过氧化氢溶液，但必须将烧瓶冷却数分钟以后加入！）过氧化氢溶液，但必须将烧瓶冷却数分钟以后加入！）, ,经常转动烧瓶，经常转动烧瓶， 观察瓶内溶液颜色的变化情况，当烧瓶内容物的颜色逐渐转化成蓝绿色澄清透明后，观察瓶内溶液颜色的变化情况，当烧瓶内容物的颜色逐渐转化成蓝绿色澄清透明后，再继续加再继续加 热热0.5h0.5h1h1h。然后取下并使之冷却。然后取下并使之冷却。 （若凯氏烧瓶壁粘有碳化粒时，进行摇动或待瓶中内容物冷却数分（若凯氏烧瓶壁粘有碳化粒时，进行摇动或待瓶中内容物冷却数分 钟后，用过氧化氢溶液冲下，

43、继续消化至透明为止）。钟后，用过氧化氢溶液冲下，继续消化至透明为止）。 4 4、定容定容 将消化好并冷却至室温的样品消化液加入将消化好并冷却至室温的样品消化液加入20mL蒸馏水摇蒸馏水摇 匀放冷，小心转移到匀放冷，小心转移到100mL容量瓶中，再用蒸馏水少量多次洗涤凯氏烧容量瓶中，再用蒸馏水少量多次洗涤凯氏烧 瓶，并将洗液一并转入容量瓶中，瓶，并将洗液一并转入容量瓶中，直至烧瓶洗至中性直至烧瓶洗至中性，表明铵盐无损地，表明铵盐无损地 移入容量瓶中，充分摇匀后，移入容量瓶中，充分摇匀后，静置至室温静置至室温，加水至刻度线定容，混匀备，加水至刻度线定容，混匀备 用。用。 同样条件下做一试剂空白试验

44、。同样条件下做一试剂空白试验。 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 六、分析步骤（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） （一）（一）试样处理 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 六、分析步骤（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） （二）（二）蒸馏 1 1、水蒸汽发生器的准备：、水蒸汽发生器的准备：按要求安装好定氮装置，按要求安装好定氮装置， 保证管路密闭不漏气。于水蒸气

45、发生瓶内装水至保证管路密闭不漏气。于水蒸气发生瓶内装水至2/3处，处， 加加甲基红指示剂甲基红指示剂3滴及滴及3mL5mL硫酸硫酸，以保持水呈酸性，以保持水呈酸性 （防止水中含有（防止水中含有N，加硫酸使成为（，加硫酸使成为（NH4）2SO4形式固定形式固定 下来，蒸馏中不会被蒸发），开通电源加热煮沸水蒸气发下来，蒸馏中不会被蒸发），开通电源加热煮沸水蒸气发 生瓶内的水。生瓶内的水。 2 2、清洗凯氏定氮仪：、清洗凯氏定氮仪：打开进气口，关闭废液出口，打开进气口，关闭废液出口， 接通冷凝水，空蒸接通冷凝水，空蒸5 min10min，冲冼定，冲冼定N仪、样杯、碱仪、样杯、碱 杯和内室。分别关闭进

46、气口（注意不要同时关闭所有进气杯和内室。分别关闭进气口（注意不要同时关闭所有进气 口！），使废液自动倒吸于定氮仪外室，再由样杯加入少口！），使废液自动倒吸于定氮仪外室，再由样杯加入少 量水，冲冼再次，当废液全部吸入外室后，再放排液口，量水，冲冼再次，当废液全部吸入外室后，再放排液口， 并使其敞开。并使其敞开。 3 3、吸收液准备：、吸收液准备：在在250mL锥形瓶中加入锥形瓶中加入10mL(20g/L) 硼酸溶液和硼酸溶液和1滴滴3滴混合指示剂，放置冷凝器的下端，并滴混合指示剂，放置冷凝器的下端，并 使冷凝管下端插入液面下。使冷凝管下端插入液面下。 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质

47、测定凯氏定氮法凯氏定氮法 六、分析步骤（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） （二）（二）蒸馏 4 4、蒸馏准备：、蒸馏准备：准确吸取准确吸取10mL试样处理液试样处理液，由样杯（小漏斗），由样杯（小漏斗） 流入定氮仪内室（反应室），并用流入定氮仪内室（反应室），并用10mL水冲洗样杯（小漏斗）使水冲洗样杯（小漏斗）使 流入定氮仪内室（反应室内）流入定氮仪内室（反应室内）【但内室中溶液总体积不超过内室的但内室中溶液总体积不超过内室的 2/3（约（约50mL）】，塞紧棒状玻塞，加水至杯口，塞紧棒状玻塞，加水至杯口1c

48、m2cm，以防，以防 漏气，关闭排液口，迅速由碱杯缓缓加入漏气，关闭排液口，迅速由碱杯缓缓加入10mL氢氧化钠溶液氢氧化钠溶液 (400g/L)，夹紧螺旋夹，通入蒸汽开始蒸馏。，夹紧螺旋夹，通入蒸汽开始蒸馏。 5 5、蒸馏：、蒸馏：关闭排液口，蒸汽进入反应室（内室），关闭排液口，蒸汽进入反应室（内室），NH3通过通过 冷凝管进入接收瓶被硼酸吸收，蒸馏冷凝管进入接收瓶被硼酸吸收，蒸馏5 min，移开接收瓶，使冷凝，移开接收瓶，使冷凝 管下端离开液面，再蒸馏管下端离开液面，再蒸馏1min，然后，用少量水冲冼冷凝管下端，然后，用少量水冲冼冷凝管下端 外部，洗液一并聚集于硼酸溶液中。外部，洗液一并聚集

49、于硼酸溶液中。 6 6、收尾：、收尾：关闭进气口，停止送气，废液将自动倒吸入外室，关闭进气口，停止送气，废液将自动倒吸入外室， 待倒吸完全时，将样杯中的蒸馏水分数次放入，冲冼内室，待洗液待倒吸完全时，将样杯中的蒸馏水分数次放入，冲冼内室，待洗液 全部吸入外室后，再打开排液口，放净废液。全部吸入外室后，再打开排液口，放净废液。 按上述步骤，换下一试样蒸馏按上述步骤，换下一试样蒸馏。同时准确吸取同时准确吸取10mL试剂空白试剂空白 消化液按以上操作作空白试验。消化液按以上操作作空白试验。 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 六、分析步骤（GB/T 5009.5-2

50、003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） （三）（三）滴定 取下接收瓶取下接收瓶，以硫酸或盐酸标准滴定溶液以硫酸或盐酸标准滴定溶液(0.05mol/L)滴定至滴定至灰色或蓝紫色灰色或蓝紫色为终点。为终点。 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 六、结果计算（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） 试样中蛋白质的含量按下式进行计算试样中蛋白质的含量按下式进行计算： 式中：式中：XX试样中蛋白质的含量，试样中蛋白质的含量，g/100gg/1

51、00g或或g/100mLg/100mL； V V1 1试样消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，试样消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mLmL； V V2 2试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mLmL； c c硫酸或盐酸标准滴定溶液的浓度，硫酸或盐酸标准滴定溶液的浓度，mol/Lmol/L； 0.01401.0mL 0.01401.0mL硫酸硫酸 c(1/2Hc(1/2H2 2SOSO4 4)=1.000mol/L)=1.000mol/L或盐酸或盐酸 c(HCl)=1.000mol/Lc(HCl)=1.000mol/L标准滴标准滴 定溶液相当的氮的质量，定

52、溶液相当的氮的质量，g g； m m样品的质量或体积，样品的质量或体积，g g或或mLmL； F F氮换算为蛋白质的系数。氮换算为蛋白质的系数。 一般食物为一般食物为6.256.25；乳制品为；乳制品为6.386.38；面粉为；面粉为5.705.70；玉米、高粱为；玉米、高粱为6.246.24；花生为；花生为5.465.46； 米为米为5.955.95；大豆及其制品为；大豆及其制品为5.715.71；肉与肉制品为；肉与肉制品为6.256.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.835.83；芝；芝 麻、向日葵为麻、向日葵为5.305.30。 计算结果保留三位有效数字。计算结

53、果保留三位有效数字。 100 100/10 0140. 0 21 F m cVV X 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 七、说明（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） 1 1、本法适用于食品中蛋白质的测定。、本法适用于食品中蛋白质的测定。不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物不适用于添加无机含氮物质、有机非蛋白质含氮物 质的食品测定。质的食品测定。 2 2、所用试剂要用无氨蒸馏水配制。、所用试剂要用无氨蒸馏水配制。 3 3、样品消化应在毒橱内进行。消化过程中应注意转动凯氏烧

54、瓶，利用冷凝的酸液将附在、样品消化应在毒橱内进行。消化过程中应注意转动凯氏烧瓶，利用冷凝的酸液将附在 瓶壁上的炭粒冲下，以促进消化完全。瓶壁上的炭粒冲下，以促进消化完全。 4 4、样品消化时，如泡沫太多，可加少量辛醇或液体石醋去泡，防止样品溢出。、样品消化时，如泡沫太多，可加少量辛醇或液体石醋去泡，防止样品溢出。 5 5、样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入过氧化氢、样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入过氧化氢2 2 mLmL3 3mLmL后再加热。后再加热。 6 6、为了加速氧化分解，常用催化剂是硫酸铜，有时也选用硒粉。硫酸铜也是蒸馏时样品、为了加速氧化分解，常用催化

55、剂是硫酸铜，有时也选用硒粉。硫酸铜也是蒸馏时样品 碱化的指示剂。碱化的指示剂。 7 7、消化时硫酸与硫酸钾作用生成硫酸氢钾，可提高沸点（硫酸沸点为、消化时硫酸与硫酸钾作用生成硫酸氢钾，可提高沸点（硫酸沸点为330330，添加硫酸钾，添加硫酸钾 后可达后可达400400），加快消化速度。），加快消化速度。 8 8、蒸馏装置要严防氨逸出。蒸馏过程中不得中途间断，以免样品液从反应室吸出。、蒸馏装置要严防氨逸出。蒸馏过程中不得中途间断，以免样品液从反应室吸出。 9 9、操作过程中要严防酸、碱污染硼酸吸收液，否则会造成较大的测定误差。、操作过程中要严防酸、碱污染硼酸吸收液，否则会造成较大的测定误差。 1

56、010、在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的、在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%10%。 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 八、样品的分解条件（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） 在消化过程中为了加速分解过程，缩短消化时间，常加入下列物质：在消化过程中为了加速分解过程，缩短消化时间，常加入下列物质： （一一）K2SO4或或Na2SO4 1、作用 K2SO4 或或Na2SO4是常用的增温剂，提高消化液沸点。是常用

57、的增温剂，提高消化液沸点。 在消化过程中温度起着重要的作用，消化温度一般控制在在消化过程中温度起着重要的作用，消化温度一般控制在360360410410间。间。 低于低于360360，消化不易完全，特别是杂环氮化物，不易分解，使结果偏低，高于，消化不易完全，特别是杂环氮化物，不易分解，使结果偏低，高于410410则容则容 易引氮的损失。易引氮的损失。 H2SO4的沸点仅为的沸点仅为330330。K2SO4 沸点：沸点：400400； 在消化过程中，随着在消化过程中，随着H2SO4的不断分解，水分不断蒸发，的不断分解，水分不断蒸发，K2SO4浓度逐渐升高，则沸点浓度逐渐升高，则沸点 升高，加速对

58、有机物的分解作用。升高，加速对有机物的分解作用。 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 八、样品的分解条件（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） （一一）K2SO4或或Na2SO4 2、加入量 温度高低取决于加入的温度高低取决于加入的K2SO4多少，若少（小于多少，若少（小于0.30.3g/mLg/mLK2SO4）则消化时间长则消化时间长。 H2SO4：K2SO4=1：1时时，则可大大缩短消化时间，则可大大缩短消化时间。 消化中若消化中若H2SO4消耗过多，则会影响盐的浓度，一般消耗

59、过多，则会影响盐的浓度，一般在凯氏瓶口插一小漏斗，以减少在凯氏瓶口插一小漏斗，以减少 H2SO4的损失的损失。 K2SO4+ H2SO4=2KHSO4 2KHSO4=K2SO4+H2O+SO3 K2SO4 与与H2SO4的用量比值不宜过大，当的用量比值不宜过大，当K2SO4超过超过0.80.8g/mLg/mL时，消化结束时，内容物时，消化结束时，内容物 冷却快，操作困难。同时温度过高，还会使生成的冷却快，操作困难。同时温度过高，还会使生成的(NH4)2SO4分解，放出分解，放出NH3，使，使N N损失。损失。 (NH4)2SO4NH3+(NH4)HSO4 2(NH4)HSO42NH3+2SO3

60、+H2O 因此因此K2SO4浓度应控制在浓度应控制在0.350.35g/mLg/mL0.430.43g/mLg/mL。 Na2SO4 与与K2SO4作用相同作用相同，但效果不及之。但效果不及之。 8-2 8-2 食品中蛋白质测定食品中蛋白质测定凯氏定氮法凯氏定氮法 八、样品的分解条件（GB/T 5009.5-2003GB/T 5009.5-2003食品中蛋白质的测定食品中蛋白质的测定第一法）第一法） （二二）CU2SO4的作用的作用 1 1、催化剂、催化剂 3C+4Cu2SO4+2 H2SO42Cu2SO4+4SO2+3CO2+2H2O Cu2SO4+2H2SO42CuSO4+2H2O+SO2