中药微生态制剂对后备母猪免疫应答及抗猪圆环病毒和蓝耳病毒影响的初步观察.

1、中药微生态制剂对后备母猪免疫应答及抗猪圆环病毒和蓝耳病毒影响的初步观察摘要目的：为探索控制动物病毒感染的新方法，观察中药微生态制剂“毒疫肽”对猪免疫应答和抗蓝耳病毒（PRRSV及猪圆环病毒（PCV-2 感染的影响，本实验在猪场后备母猪的饲料中添加 0.2% “毒疫肽”， 采用荧光定量PC检测血液中的带毒情况，比较处理组饲喂添加“毒 疫肽”前后以及与对照组血液中PRRS及PCV-2带毒率的变化；比较“毒疫肽”饲喂前后母猪体内免疫细胞CD4 IL-10基因表达水平的变 化。方法：采用荧光定量PCF检测血液中病毒相对数量和免疫细胞的 CD4 IL-10基因mRNA平的变化情况，比较“毒疫肽”饲喂对动

2、物免 疫机能的影响特性。 结果：后备母猪饲喂“毒疫肽”后，PRRSVPCV-2 感染率明显减少，PRRS实验组收到明显的保护效果，对照组在相同 环境下感染数量上升到2/5 ； PCV实验组由4/5下降到1/5，而对照组 反而由1/5上升大5/5。病毒含量也显著降低，以B -Actin为内参，实 验组PRRS受到保护无上升，对照组含量由 0.08上升到100;实验组 PCV含量由18下降到0.7 ,对照组由0.88上升到48。；实验组血液免疫 细胞的CD表达水平显著升高，而实验组的IL-10水平较对照组显著降 低。这显示“毒疫肽”加入饲料可显著增强动物的免疫水平，IL-10的下降有助于改善免疫细

3、胞控制和清除体内的病毒，提高其抗PRRSVPCV-2感染的能力，为实际生产中防治圆环病毒病和蓝耳病提供了新 思路。关键词：中药微生态制剂、中药、微生态、活菌、益生素、“毒疫肽”、PRRSV/PCV-2、后备母猪、CD4 IL-10、基因表达、荧光定量 PCR、尸、 亠刖言近年广泛流行的免疫抑制病，如猪呼吸与繁殖综合征（PRRS和猪 圆环病毒（PCV-2）引起的仔猪断奶后多系统衰竭综合征 （Post-weaning multisystemie wasting syndrome， PMW等病，对我国养猪业造成了极严重损害，猪群生产性能下降，母猪流产增多。 特别是产房及保育仔猪大量发病及死亡，损失极

4、为惨重。2008年及2010年下半年猪肉价格攀升，国内CP I指数不断提升，目前已被公认 与猪只疫病暴发，死亡过多，供应失调密切相关。健康猪群中的高带 毒率不仅影响猪的生长发育和增重， 也是疫病暴发的基础。目前动物 疫病肆虐，饲养和疾病防治中抗生素滥用涉及食品安全的问题更为人 们深切关注。在动物感染PRRS和PCV2勺过程中，IL-10基因和CD4S因表现出 显著的改变，两种病毒对动物的免疫应答调控和关键的Th细胞分化和生长均有抑制。Sipos等对PMW感染猪的细胞因子mRN及蛋白质水 平进行研究发现，其外周淋巴细胞中IL-10表达水平很高，表明IL-10 的过量表达可能引起免疫反应向对机体不

5、利的方向发展。J . Nielsen等用PCV攻毒 3周龄仔猪，1421天后出现PMW临床症状的仔猪有明 显的淋巴细胞减少征，而未出现症状的感染猪及阴性对照猪淋巴细胞 无明显变化，动力学分析发现其CD3淋巴细胞均有明显的减少；PCV2 攻毒猪的T淋巴细胞亚群也有变化，CD3/C4/CD8三联标签检测，CD3+CD4+CD8+忆/激活细胞的含量明显下降。因此，降低IL-10基因表达水平或维持IL-10基因在低水平表达对动物抗病毒免疫应答和机 体健康有重要意义。CD基因表达水平与阳性Th免疫细胞数量的比例 成正相关，对促进机体抗病毒免疫功能，提高抗病抵抗力具有推动作 用。在动物免疫应答过程中，作为

6、非特异免疫调控的重要组成和有直 接杀菌、抗病毒效果的活菌中药发酵制剂在近年来发挥出突出的效果 和贡献。中药微生态制剂是指选取优质中药利用活性乳酸菌进行发酵 来达到提高功效的作用。中药活菌发酵的五大革命：1、 中药成分经过益生菌转化，由大分子变成小分子，100%被机 体吸收。2、真正的疗效提速，30分钟吸收到达血液。3、真正的药效提高，发酵中药比传统中药提高 4-28倍。4、发酵过程分解毒性，真正无毒副作用。“是药三分毒”成为历 史。5、改善中药口味，使“良药不再苦口”在猪场饲料中添加“毒疫肽”展现了优异的效果，如母猪产仔率 提咼、死胎率下降，特别对保育期仔猪具有明显增重效应，临床对僵 弱仔猪的

7、生长改观；促使我们对本动物进行实验，观察其对猪体内 PCV-2和PRRS带毒率的影响。通过实验，我们找到了一种新型、经济、 高效的预防和治疗猪感染PCV和PRRS的新途径。1. 实验材料1.1 “毒疫肽”中药微生态制剂，由合肥太阳雨生物工程有限公司提供的商品化 制剂，商品名为“毒疫肽”。1.2实验猪后备母猪对比实验：180日龄加系后备母猪10头，体重90-100公 斤，由江苏省徐州市某原种猪场提供和饲养管理，分为实验组5头和 对照组5头，实验组饲料中添加0.2%“毒疫肽”，除此之外两组所用基 础饲料一致，饲养管理条件相同。实验母猪开始前和开始饲喂添加“毒 疫肽”饲料后10、20天，各自采抗凝血

8、5ml，分析血中PCV-2 PRRSV 的变化。1.3实验试剂RNA 提取：TIANGEN TRNzol总RNAI取试剂盒，RNAprep pure血 液总RNAM取试剂盒（天跟生化科技有限公司，北京），氯仿（分析纯）， 异丙醇（分析纯）；反转录：TIANGEN Qua nt cDN第一链合成试剂盒（天跟生化科技有限公司，北京）；荧光定量PCR: TIANGEN Qua ntqRT-PCR（SYBFGreen） Kit，RealMasterMix （SYBFGreen）（天跟生化科技有限公司，北京）；引物合成：上海英俊生物技术公司。2. 实验方法2.1实验时间和饲养管理实验时间：2011年10

9、月21 日至2011年11月13日期间，具体采血时间为 饲喂开始点前采血、饲喂后10天以及饲喂后20天采血。实验组后备母猪的饲养管理、饲养环境、免疫程序与对照组完全相同均采用标准化猪场管理流程 22 实时定量RT-PC检测母猪的体内PCV-2 PRRSVIL10基因、CD4基因的变化通过对PCV病毒DNA口 PRRS病毒RNA勺提取、反转录采用天根公司反转录试剂盒。定量检测用相对定量方法，试剂盒采用天根公司Q-PC试剂盒。对血浆中全细胞的 mRN的提取来检测IL10基因、CD4 基因的变化。（引物设计参考 PRIMER 5.0,Blast : NCB）表1病毒检测引物：PRRSNPCR产物长度

10、为217bp, PCVPCR产物长度为145bp引物名称碱基序列PRRSV-FTTGTGGTGTATCGTGCCGPRRSV-RCAAGGAAATGGCTGGTGGPCV-FATAACCCAGCCCTTCTCCTACCPCV-RGGCCTACGTGGTCTACATTTCC表2内参基因B -Actin ,IL-10、CD4基因引物的设计：PCF产物248bpGenesSeque nces of PrimersB -Actin F :5-CTCCTCCCTGGAGAAGAGCTA -3B -Actin R :5-CCTTCTGCATCCTGTCGGCAA -3CD4+-F5 ACACAGCCTCA

11、GTTACCGAGTTG 3CD4+-R5 CCTCTTGTCTTCCACTTCGCAGAT 3IL-10-F5 GCAGCCAGCATTAAGTCTGAGAAC 3IL-10-R5 GTCAGCAACAAGTCGCCCATCT 3分离猪外周血免疫细胞，用Trizol法提取全基因组RNA采用天 根（TianGen）公司cDN第一链合成试剂盒，20ul体系。37C 1小时 对全RNA进行反转录；实时定量 PCF检测PCV-2 PRRS、IL-10、CD4 基因，条件如下：体系为25ul SYBRGreen反应体系，具体如下：2.0ul cDNA1.0ul 上游引物、1.0ul 下游引物、12.5

12、ul SYBFGreen PCRMaster Mixed反应液，加超纯水至25ul。经过优化，最后确定实施实验的反 应条件为：95C, 10s; 95 C、5s, 56C、20s, 72C、15s, 40个循 环，退火温度56C。2.3数据分析方法：PCV-2的含量以B -Actin为内参基因，最终以相对表达量来表示， 相对荧光定量计算方法采用2- CT法计算而来。所有数据均采用 Excel进行整理，采用SPPSN.统计软件进行统计处理，结果用平均数 士标准差表示，实验组间差异用t检验进行分析。3结果3.1实验后备母猪体内PCV-2含量的变化表3后备母猪PCV-2含量的变化结果日期处理前处理后

13、10天处理后20天对照组0.08 士 0.08b9.98 士 0.76a43.88 士 24.08a实验组18.53 士 15.29a0.08 士 0.07b0.74 士 0.40bPCV-200000 0 00000EO盟 Edxw40 OHffl04e-h对照组Y-实验组图1后备母猪体内PCV-2的含量变化表4后备母猪PCV-2阳性的检测结果采血时间（天）组别母猪编号处理前处理后10天处理后20天对照组1-+2+3-+4-+5-+阳性率1/53/55/5实验组6-7+-8+ +-9+-10+-+阳性率4/51/51/5从上表3、表4,图1可知：饲喂“毒疫肽”的后备实验母猪体内 的PCV-2

14、不仅阳性率从4/5显著下降到1/5，含量也明显减少；与此相 反，对照组母猪的PCV-2阳性率从1/5显著上升到5/5，且含量也明显 高于实验母猪。3.2实验后备母猪体内PRRS含量的变化表5后备母猪PRRSN含量的变化米血时间处理前处理后10天处理后20天对照组0.01 士 0.05a1.21 士 0.54a100.88 士 43.76b实验组0.03 士 0.01a0.11 士 0.04b1.4401 士 0.01b1601401201008D6040200203匕104；采血时闻点PRRSV图2后备母猪血液PRRSV含量的变化表 PRR弭的检测分折结果病毎阳性变化组别采血时何址理前处理后1

15、0 X处理后却天1-2-3-&-+5-十+阳性率06-7-4-F实验组呂-9-10阳性率00V5从上表5、表6、图2可知：实验组母猪体内的 PRRSVf仅阳性 率( 1/5 )低于对照组母猪(2/5 ),而且含量也明显少于对照母猪； 表明：与同样饲喂条件的对照猪相比较，“毒疫肽”饲喂母猪对PRRSV 感染可能有较强的抵抗力。3.3免疫细胞IL-10基因表达的变化表7实验猪血液免疫细胞IL-10基因表达值的变化米血日期对照组实验组处理前1.523 士 0.14A1.934 士 0.31A处理后10天5.48 士 0.58A1.73 士 0.28B处理后20天10.42 士 1.20A0.80 士

16、 0.34BIL-10UO#说也dxopgeg soaBaJ15一出图3实验猪血液免疫细胞IL-10基因表达量的变化从上表7和图3中可见：与对照母猪比较，“毒疫肽”饲喂母猪的 血液免疫细胞中IL-10表达量显著减少，说明其体内IL-10的抑制性免 疫调节作用明显减弱；3.4实验猪免疫细胞的CD基因表达变化表8后备母猪血液免疫细胞CD基因表达量变化米血日期对照组实验组处理前0.10 士 0.01A1.13 士 0.11A处理后10天2.85 士 0.44B81.42 士 4.42A处理后20天0.31 士 0.12B57.74 士 4.77AU&讲sodxuwuaM-0.24E心疋 4 燈-aH

17、图4实验猪血液免疫细胞CD4基因表达量的变化从表8和图4中可见：与对照母猪比较，实验组“毒疫肽”饲喂 母猪的血液免疫细胞中CD表达量显著增加（PV0.01），说明其体内CD4 的免疫调节作用显著增强，有利于动物提高其免疫防御水平， 加强对 病毒和细菌等病原感染的清除能力。4、讨论和结论上世纪末国内发现PCV-航体阳性猪，随后抗原阳性猪被不同学者陆续证实；通过流行病学调查、临床病症观察、剖解及PC检测证实国内已有单纯PCV-2引致的种猪与保育猪临床症状及死亡病例4， 7。甚至在外表健康屠宰猪及新生仔猪体内扩增出PCV-2片段，显示国内猪只PCV-2感染的广泛性。国内猪群PCV-2高带毒率的不断报

18、道， 显示PCV-2同样是国内猪场重要的免疫抑制疫病。 一般通常认为PCV-2 可单独与PRRS或其他病原协同作用致使猪免疫功能抑制或减退，诱 导继发感染，出现临床病症。实验结果显示：“毒疫肽”拌料口服可以有效减少实验猪血液病 毒的阳性率与数量，特别对PCV-2更为明显。实验开始时，血清内PCV-2 带毒率高达4/5，最后在24天实验结束时，PCV-2带毒率仅为1/5，不 仅带毒率下降，而且血清内病毒数量也有明显减少，显示“毒疫肽” 对PCV-2不仅有抑制，而且还有清除作用。相反，对照组 PCV-2带毒率 由实验初的1/5阳性、中期3/5阳性、最后实验结束时增加为5/5阳性， 与实验组有显著差异。以前通过体外实验发现，“毒疫肽”加入培养的Marc-145细胞中 可产生良好的抗PRRS病毒增殖的效应；现在本实验发现“毒疫肽” 饲喂后备母猪的PRR