临床色谱质谱检验技术：第七章 Sanger测序及高通量测序技术1VIP

1、临床基因组学临床基因组学 第七章第七章 Sanger测序及高通量测序测序及高通量测序 技术技术 第一节第一节 核酸测序技术的发展核酸测序技术的发展 第第二节二节 Sanger测序测序技术技术 第三节第三节 高通量测序技术及其应用高通量测序技术及其应用 第三节 高通量测序技术及其应用重点 高通量测序的发展 二代测序的基本原理及操作流程 三代测序的基本原理 高通量测序的临床应用 人类基因组约含4万到10万个基因，由约 30亿个碱基亿个碱基对组成，分布在细胞核的23对 染色体中。 1990年，被誉为生命“登月计划”的国际 人类基因组计划启动。 1999年9月，中国加入这一研究计划，负 责测定人类基因

2、组全部序列的1。 2003年完成，比预计提前2年。 六国六国（美、日、英、法、德、中）科学家 历经了13年花费了年花费了27亿美元亿美元才完成的草图。 尽管第一代测序技术已经帮 助人们完成了从噬菌体基因 组到人类基因组草图等大量 的测序工作，但由于其存在 成本高、速度慢成本高、速度慢等方面的不 足，并不是最理想的测序方 法。 优势：能同时对无数条DNA分 子进行序列测定，效率极高 技术特点：每次测很短的片段 （读长较短），但是可以通过 超大量的平行测序，获得大量 的序列。 “下一代”测序技术 Next-generation sequencing , NGS 高通量测序的常用名词 高通量测序技术

3、高通量测序技术（High-throughput sequencing，HTS）是对传统 Sanger测序（称为一代测序技术）革命性的改变, 一次对几十万 到几百万条核酸分子进行序列测定, 因此在有些文献中称其为下 一代测序技术(next generation sequencing，NGS )足见其划时代的 改变, 同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细 致全貌的分析成为可能, 所以又被称为深度测序(Deep sequencing) 基因组重测序基因组重测序（Genome Re-sequencing） 是对基因组序列已知的 个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的 方

4、法。 de novo测序测序 也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就 可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行 拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。 外显子测序外显子测序（whole exon sequencing） 指利用序列捕获技术将全 基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分 析方法。 Reads 又称读长，高通量测序中一个反应获得的测序序列或测序 出来的一条条序列 。 测序深度测序深度 是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。 假设一个基因大小为2M，测序深度为10X，那么获得的总数据量 为20M。 覆盖度覆盖度 是指测序获得的序列占整

5、个基因组的比例。 Contig 拼接软件基于reads之间的overlap区，拼接获得的序列称 为Contig（重叠群）。 Scaffold 基因组de novo测序，通过reads拼接获得Contigs后，往 往还需要构建454 Paired-end库或Illumina Mate-pair库，以获得一 定大小片段（如3Kb、6Kb、10Kb、20Kb）两端的序列。基于这些 序列，可以确定一些Contig之间的顺序关系，这些先后顺序已知 的Contigs组成Scaffold。 高通量测序平台高通量测序平台 Life Ion PGM; Ion proton Illumina MiSeq Next

6、Seq 500 Roche 454 Genome Sequencer FLX Roche 454 Genome Sequencer GS FLX GS Junior System GS FLX的基本原理的基本原理 文库构建文库构建扩增测序模板焦磷酸测序数据分析 样本样本 文库构建文库构建 扩增测序模板扩增测序模板 焦磷酸测序焦磷酸测序数据分析数据分析 样本样本 (DNA)n + dNTP polymerase (DNA)n +1 +PPi Sulfurylase ATP APS+PPi ATP + luciferin oxyluciferin Lucifetase dNTP Apyrase d

7、NDP + dNMP + phosphate ATP Apyrase ADP + AMP + phosphate 文库构建文库构建扩增测序模板扩增测序模板焦磷酸测序焦磷酸测序 数据分析数据分析 样本样本 序列是什么呢？ . Life Technology Ion平台平台 Ion PGM 系统系统 Ion Proton系统系统 Ion S5 系统系统Ion Chef 系统系统 Ion torrent PGM的基本原理的基本原理 Prepare Library Clonal Amplification DNA / RNA Data Analysis Library Preparation DNA

8、Sequencing* Isolate Positive Ion Sphere Particles Data Analysis Load Chip and Sequence Template Preparation* Sensor Plate Silicon Substrate DrainSourceBulk dNTP To column receiver pH Q V Sensing Layer H+ Sequencing: Flows Ion Sphere -Primer- A G T C A A G C G T C C C A T G Sequence of InterestKey Se

9、quence TACGTACGT Flows 1-49-12Flows 5-8 etc. T A C G Flows 1-4 .-Ion Sphere Particle A “flow” is the event of exposing the chip to one particular dNTP (T, A, C, or G), followed by a washing step The flow order repeats with pattern: TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC CGACGTACGTA A “cycle” is four conse

10、cutive dNTP flows: for instance, T-A-C-G = 1 cycle T A “flow” is the event of exposing the chip to one particular dNTP (T, A, C, or G), followed by a washing step The flow order repeats with pattern: TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC Sequencing: Flows Ion Sphere -Primer- A G T C A A G C G T C C C A T

11、 G Sequence of InterestKey Sequence C TACGTACGT Flows 1-49-12Flows 5-8 etc. T A C G Flows 5-8 .-Ion Sphere Particle CGACGTACGTA A “cycle” is four consecutive dNTP flows: for instance, T-A-C-G = 1 cycle T Ion Sphere -Primer- A G T C A A G C G T C C C A T G Sequence of InterestKey Sequence C TACGTACGT

12、CGACGTACG Flows 1-49-12Flows 5-8 etc. T C G T Flows 9+ A G .-Ion Sphere Particle A “flow” is the event of exposing the chip to one particular dNTP (T, A, C, or G), followed by a washing step The flow order repeats with pattern: TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC T TA A “cycle” is four consecutive dNTP

13、 flows: for instance, T-A-C-G = 1 cycle Sequencing: Flows T Ion Sphere -Primer- A G T C A A G C G T C C C A T G Sequence of InterestKey Sequence ACG TACGTACGT Flows 1-49-12Flows 5-8 etc. T A C G T T T C G C A G G G T A C And so on .-Ion Sphere Particle A “flow” is the event of exposing the chip to o

14、ne particular dNTP (T, A, C, or G), followed by a washing step The flow order repeats with pattern: TACGTACGTCTGAGCATCGATCGATGTACAGC CGACGTACGTA A “cycle” is four consecutive dNTP flows: for instance, T-A-C-G = 1 cycle Sequencing: Flows 大家知道接下来的序列是什么吗大家知道接下来的序列是什么吗? AATCTTCTG 阿尔茨海默病（Alzheimer diseas

15、e, AD） 是老年痴呆中最常见的一种 渐进性的神经功能退化 整体认知能力的下降 早发性AD主要是由-淀粉样前体蛋白(APP)基因和早老素基因突变引 起， 与晚发性AD发病明显相关的只有载脂蛋白E-4(APOE-4)等位基因 对与AD关联的4个基因(APOE+ APP+ PSEN1+PSEN2)进行全基 因测序，有助于发现更多的AD患者的遗传变异。 阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD) 通过Ion-Torrent-PGM技术，对PSEN1、PSEN2、APP、APOE基因的外显子 区（编码区）序列进行直接测序，与参考序列进行比较，从而发现可能 存在的基因突变。 基因定位作

16、用 APOE19q13-13.2与老年性痴呆相关 APP21q11.2-21q21与老年性痴呆相关 PSEN1基因 （早老素-1基因） 14q24.3其中PSEN1基因可能是EOFAD的主要责任基因， 并且也有报道PSEN1基因的某些突变和多态性也 与散发性AD有关。 PSEN2基因 （早老素-2基因） 1q31-42与老年性痴呆相关 早发性AD的家系 举例: AD相关基因 NGS测序 PSEN1基因突变 早发型AD 常显遗传 Illumina Illumina 平台平台 Illumina Miseq的基本原理的基本原理 测序的时候，测序引物匹配于模板，反应体系里加入4种不同荧光基团标 记的F

17、l-NTPs，整合到新合成链的Fl-NTPs会发出相应的荧光，并被相机 拍下，终止反应，将荧光基团切除即可进入下一轮合成过程。如此往复 直到测完设定的循环数。 MiSeq Control Software 图片处理 Base calling 质量评分 MiSeq Reporter 数据格式转化 比对序列到参考序列 得到变异信息 质量Q30的数据达到 95%以上 测序照片 二、数据分析 NextSeq 500特色Two Channel SBS GGT, ATT, CAA, GCA TCA, ATG, CGT, GGC （A/T;A/C） 帕金森病（Parkinsons disease，PD） 是

18、一种常见的神经系统变性疾病， 老年人多见，平均发病年龄为60岁左右，40岁以下起病的青年帕金 森病较少见。 最主要的病理改变:中脑黑质多巴胺能神经元的变性死亡，由此而引 起纹状体DA含量显著性减少而致病。 症状体征不对称、静止性震颤、对左旋多巴制剂治疗敏感多提示原 发性帕金森病。 各测序技术的比较 数据来源：Liu JT, et al. J Biomed Biotechnol. 2012;2012:871272. 第三代测序第三代测序 基于单个分子信号检测的DNA测序被称为单分子测序单分子测序 (single molecule sequencing, SMS)，或第三代测序 (third ge

19、neration sequencing, TGS)。 主要包括Helicos的的tSMS，PacBio的的SMRT，Oxford的的Nanopore 。 tSMS（ture single molecule sequencingture single molecule sequencing ） 该技术的关键是采用高分辨率的相机直接读取单分子荧光信号， 不需要依赖PCR扩增以放大信号。 首先将待测核酸样本随机打断成小片段，在每个小片段的末端加 上poly-dA； 再将小片段DNA模板与固定在检测芯片上的poly-dT引物进行杂交 并精确定位，并逐一加入经过荧光物质修饰的dNTP。 tSMS技术使用

20、的dNTP也是仅能掺入新合成链而不能直接作为下 一个dNTP分子掺入新链的3端，必须将其荧光基团切除之后才可 允许下一个dNTP分子的掺入。 在dNTP掺入新链成像之后，切除荧光基团，加帽，允许下一个核 苷酸的掺入。 tSMS（ture single molecule sequencingture single molecule sequencing ） SMRTSMRT（single molecule Real-Timesingle molecule Real-Time）sequencingsequencing 该方法采用四色荧光标记的dNTP和被称为零级波导 (zero-mode wave

21、guides, ZMW) 的纳米结构对单个DNA分子进行测序。当DNA 合成进行时，连接上的dNTP由于在ZMW底部停留的时间较长 (约 200ms)，其荧光信号能够与本底噪音区分开来，从而被识别。荧 光基团被连接在dNTP的磷酸基团上，因此在延伸下一个碱基时， 上一个dNTP的荧光基团被切除，从而保证了检测的连续性，提高 了检测速度。 NanoporeNanopore 当单链DNA或RNA分子通过纳米级的小孔时，由于碱基形状大小 不同，引起孔内电阻变化，在小孔两端保持一个恒定的电压，则 能够检测到通过小孔的电流变化情况，通过测到这些特征电流， 就能够识别出通过小孔的DNA分子上的碱基排列。 外切酶测序 (Exonuclease sequencing)和链测序 (Strand sequencing)。 外切酶测序是将-溶血素和环化糊精组成的纳米孔固定在脂质双 分子膜上，两侧为浓度不同的KCl溶液，并加以160mV的电压。 DNA单链在E. coli核酸外切酶I的作用下被依