临床PCR检测技术实习生讲课(1)

1、精选课件1 临床PCR技术 精选课件2 Kary B. Mullis USA, for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method 1930年提出了两种核 酸DNA和RNA的概念 1953年Watson和 Crick提出了DNA双 螺旋结构及其半保 留复制模型。 一、一、PCRPCR概述概述 精选课件3 一、PCR概述 （一）PCR概念 PCR （polymerase chain reaction)是 一种在体外通过重复DNA合成，以扩增特 定核苷酸序列的方法。 特点 高灵敏度 高特异性 体外进行 快捷 精选课件4 P

2、CR的概念 核心技术是从水栖高温菌中分离到 能耐高温的Taq酶，使扩增反应不需 要每一个循环加一次DNA聚合酶，从 而实现了自动化。 应用领域迅速扩大，PCR技术成为了 分子生物学中的一项突破性技术。 精选课件5 PCR概述2000至2013年发表论文1280748篇 精选课件6 一、PCR概述 （二）原理 双链DNA 变性 退火 链延伸 （膜板） （双链分成单链） （膜板与引物杂交） （DNA合成） 不断重复 精选课件7 二、实验步骤 （一）核酸提取 1.DNA提取 100ul浓缩液 100ul血清 吹打混匀 12000g离心5min 弃上清 20ul提取液 100煮10min 模板 精选课

3、件8 二、实验步骤 2.RNA提取 10ulA液 200ulB液 震荡混匀 8000g离心1min 200ulDEPC乙醇 65干燥 10min RNA模板 8000g离心1min 逆转录 为cDNA 弃上清 重复洗2次 50ul血清 精选课件9 3、细胞或组织 剧烈震荡 400ul试剂1 加入400ul试剂2 震荡混匀 12000g离心5min 完全弃上清 加入试剂3 模板 加样扩增 杂交显色 精选课件10 （二）扩增 HBV引物(168bp)： 上游：5-GAAGTGTGACGTTGACATCC 下游：5-ACAGAGTACTTGCGCTCAGG 扩增体系扩增体系：（50l体系） 10*B

4、uffer -5l dNTP -1l MgCl2 -3l Primer F -2l Primer R -2l DNA -2l Taq酶 -1l H2O -34l 精选课件11 反应程序反应程序 预变性 94C 3min 循环 延伸 72C 5min。 注：每组实验阴性对照用无菌生理盐水代替模板 30循环 精选课件12 （三）结果判读 精选课件13 （四）PCR的常见问题及处理措施 常见问题 污染：污染：表现为阴性对照同样出现目的表现为阴性对照同样出现目的 条带或条带或阴性对照出现阴性对照出现S形曲线。形曲线。 污染的来源：污染的来源： 来自其他测试样品的来自其他测试样品的DNA 来自试验材料如

5、重组克隆的来自试验材料如重组克隆的DNA外外 源源DNA污染污染 来自同一靶序列前一次来自同一靶序列前一次PCR的扩增的扩增 产物。产物。 精选课件14 （三）PCR的常见问题及处理措施 如何减少污染 实验室分区实验室分区 精选课件15 酶法控制酶法控制 尿嘧啶尿嘧啶DNA糖基化酶（糖基化酶（UNG) 短于短于100bp的的PCR产物不能用产物不能用UNG完全消除污完全消除污 染。染。 紫外线表面照射紫外线表面照射 消除试剂、加样头中的消除试剂、加样头中的DNA污染。污染。 对短对短PCR产物效果不好产物效果不好 以预防污染为主以预防污染为主 良好的实验室操作良好的实验室操作 精选课件16 三

6、、荧光定量三、荧光定量PCR 精选课件17 （一）荧光（一）荧光PCR定量的概念定量的概念 以外参已知数量拷贝数的标准品为 标准，通过扩增及对荧光值的监测， 对PCR起始模板量的定量。 精选课件18 （二）荧光定量（二）荧光定量PCR原理原理 染料染色染料染色 SYBR Green I 溴乙锭(Ethidium Bromide) 探针标记探针标记 TaqManTM 分子信标(Molecular beacons) 精选课件19 TaqManTaqMan探针 reverse primer RQ forward primer 3 3 5 53 5 5 1. Polymerisation probe

7、R Q 3 3 5 53 5 5 2. Strand displacement Q 3 3 5 53 5 5 3. Cleavage R 3 5 53 5 5 4. Polymerisation completed Q R R = Reporter Q = Quencher 3 精选课件20 （三）定量（三）定量PCRPCR的数学原理的数学原理 PCR 理理 论论 方方 程程 N = N0 x (1+E)n N:扩增数量扩增数量 N0:起始模板数量起始模板数量 E：扩增效率扩增效率 n:循环数循环数 精选课件21 指数期指数期PCRPCR定量方程才有效定量方程才有效 循环数循环数 线性增长期L

8、inear 平台期Plateau y = x(1+e)n 指数增长期指数增长期GeometricGeometric 精选课件22 PCR曲线曲线 线性图谱半对数图谱 精选课件23 起点定量与终点定量起点定量与终点定量 起点定量起点定量 终点定量终点定量 “加进不同拷贝的膜板加进不同拷贝的膜板” 半对数图谱线性图谱 精选课件24 同一个样品重复96次 起点定量的优势起点定量的优势 终点产物数量： 误差太大 拐点产物数量：重现性好 l 起始起始DNADNA量，更具意义量，更具意义 l 重现性好，误差小重现性好，误差小 精选课件25 起点定量的关键：CT值 CCT T值：荧光信号有统计学意义显著增长

9、值：荧光信号有统计学意义显著增长( (穿过穿过 阈值线阈值线) )时的循环次数时的循环次数 CT值 半对数图谱 CT值 线性图谱 精选课件26 CCT T 起始起始DNADNA浓度浓度 当循环次数n=CT值时： RT = RB + X0 (1+ E)CT Rs lg (RT - RB) = lg X0 + CT lg (1+ E) + lg Rs CT lg (1+ E) = - lg X0 + lg (RT - RB) lg Rs )1log( log)log( )1log( log X SBT X O T E RRR E X C 即即 CT = - k lg X0 + b （线性方程）（线

10、性方程） Rn = RB + X0 (1+ E)n Rs 精选课件27 CCT T值值 - - X X0 0 作图 CT X0 CT = - k logX0 + b 精选课件28 四、四、PCRPCR检测的临床应用检测的临床应用 （一）标本采集要求（一）标本采集要求 精选课件29 项目项目标本采集标本采集 HBVHBV无菌注射器抽取无菌注射器抽取2 2毫升静脉血或其它体液注入毫升静脉血或其它体液注入 无菌试管或抗凝管。无菌试管或抗凝管。 HCVHCV EBEB1.1.鼻咽拭子或体液标本。鼻咽拭子或体液标本。 2.2.也可取抗凝血标本也可取抗凝血标本, ,但一般不推荐。但一般不推荐。 CMVCM

11、V1.1.尿液：中段晨尿尿液：中段晨尿20ml20ml于加盖试管。于加盖试管。 其他体液标本或咽拭子。其他体液标本或咽拭子。 2.2.也可取抗凝血标本也可取抗凝血标本, ,但一般不推荐。但一般不推荐。 TBTB1.1.痰液：患者深部咳痰痰液：患者深部咳痰1 13ml3ml于无菌加盖试于无菌加盖试 管。管。 2.2.其他组织标本：留于无菌试管。其他组织标本：留于无菌试管。 3.3.也可取抗凝血标本也可取抗凝血标本, ,但需分离单个核细胞检但需分离单个核细胞检 测，阳性率才会高。（于发热时抽取）测，阳性率才会高。（于发热时抽取） MP 咽拭子咽拭子 精选课件30 项目项目标本采集标本采集 所需容器

12、所需容器 CTCT男性：男性： 尿道分泌物：细小棉拭子伸入尿道尿道分泌物：细小棉拭子伸入尿道 约约2 24 4厘米，旋转数圈取出分泌物（应厘米，旋转数圈取出分泌物（应 略带粘膜）。略带粘膜）。 前列腺液、精液。前列腺液、精液。 女性：女性： 阴道分泌物：用无菌生理盐水洗去阴道分泌物：用无菌生理盐水洗去 宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫 颈内，停颈内，停5 5秒后旋动棉拭子采取分泌物秒后旋动棉拭子采取分泌物 。 尿道分泌物：同上尿道分泌物：同上 一次性一次性 无菌带无菌带 盖的试盖的试 管。管。 NGNG UUUU TP HPVHPV HSVHSV 精选课件3

13、1 （二）结果分析、报告及解释 1.定性PCR与定量PCR的比较 2.定量PCR测定的临床意义 3.定性PCR测定的临床意义 4.定性和定量测定的结果报告及解释 精选课件32 1.定性定性PCR与定量与定量PCR的比较的比较 精选课件33 琼脂糖凝胶电泳 精选课件34 定量PCR扩增曲线图 精选课件35 2.定量定量PCR的临床意义的临床意义 l对致病微生物核酸含量进行定量检测 l弥补免疫检测的缺陷 l缩短诊断的窗口期（如HBV,HIV） l对治疗过程进行药物疗效监测 l用于基因表达方面的研究 精选课件36 某患者某患者HBV-DNAHBV-DNA的的PCRPCR 结果动态图结果动态图 日期日期HBV-DNAHBV-DNA 2004-6-39.3E+79.3E+7 2004-12-72.0E+62.0E+6 2005-4-191.8E+31.8E+3 2005-7-250.0E+00.0E+0 精选课件37 3、定性测定的临床应用、定性测定的临床应用 n诊断 n用于筛检 n耐药突变检测 n病毒基因型检测 GG AG GG AG AA AA 精选课件38 4.定性和定量测定的结果