壮药国虾薄(绞股蓝)皂苷及其抗非小细胞肺癌(NSCLC)作用的研究

1、壮药国虾薄(绞股蓝)皂苷及其抗非小细胞肺癌( NSCLC作用 的研究目的以国虾薄 (绞股蓝)为研究对象 ,对原药材中的皂苷成分进行系统分离并 确定其化学结构 ,以期发现新的皂苷成分 , 进一步丰富绞股蓝皂苷的化学结构 ;探 讨绞股蓝皂苷对A549细胞抑制作用的构效关系，为临床科学合理用药提供参考； 从细胞毒性、细胞凋亡、细胞周期和细胞迁移四方面对代表性皂苷抗 NSCLC田胞 活性进行探究，阐释国虾薄抗NSCLC乍用的物质基础。方法1.以“文献导向、质 谱信息比对”的方式发现国虾薄原药材中仍可能存在新皂苷成分 , 综合利用正、 反相分离填料 , 常、中、高压色谱柱体系等分离手段对国虾薄原药材中的

2、皂苷成 分进行较全面系统的分离,通过“四大谱”(UV、IR、MS NMR及与已知文献比对 的方法确定绞股蓝皂苷的化学结构,通过酸水解,薄层色谱法(TLC)检识糖链中单 糖的种类。2.以A549细胞为NSCLC细胞模型,CCK 8法检测绞股蓝皂苷成分对 A549细 胞的抑制作用,通过比较绞股蓝皂苷单体的化学结构及其对 A549细胞的IC50值, 探讨构效关系。3.CCK 8法探究damulin B对MRC-5 A549 H1299细胞的抑制 作用 , 采用相关试剂盒及相应抗体从细胞凋亡、细胞周期及细胞迁移方面探究 damulin B对NSCLC勺作用机制。4.CCK 8法探究绞股蓝皂苷 L(Gy

3、p L)和绞股蓝皂苷LI(Gyp LI)对A549细胞 的抑制作用 , 采用相关试剂盒及相应抗体从细胞凋亡、细胞周期及细胞迁移比较 Gyp L和Gyp LI对A549作用的异同。5.CCK 8法探究新皂苷成分对人的5种肿 瘤细胞的抑制作用,构建H202诱导的SH-SY5Y氧化应激模型,探究新皂苷成分的 神经保护作用结果 1.从国虾薄原药材中共分离获得 19种皂苷单体成分 : 绞股蓝皂苷 LXXVD (GPF-1)、2a ,3 B ,12 B ,20(S)-四羟基达玛-24-烯-3-0- B -D-葡萄糖苷-20-0-B -D-葡萄糖苷(GPF-2)、绞股蓝皂苷区(GPF-3)、绞股蓝皂苷毗(人

4、参皂苷Rd,GPF-4)、绞股蓝皂苷 LXW(GPF-5)、2a ,3 B ,12 B ,20-四羟基-25-过氧氢-达 玛-23-烯-3-O- B -D-葡萄糖基(1 2) B -D-葡萄糖基-20-O- B -D-木糖基(1 6)- B -D-葡萄糖苷(GPF-6)、2a ,3 B ,12 B ,20,24(S)-五羟基达玛-25-烯 -3-0- B -D-葡萄糖基(1 2) B -D-葡萄糖基-20-O- B -D-葡萄糖苷(GPF-7)、 绞股蓝皂苷LV (GPF-8)、3-O- B -D-葡萄糖基(1 2) B -D-葡萄糖基-2 a ,3 B ,12 B ,20,24(S)-四羟基

5、-达玛-25-烯-20-O- B -D-木糖基(1 6)- B -D-葡萄 糖苷(GPF-9)、2a ,3 B ,12 B ,20,25-五羟基达玛-23-烯-3-O- B -D-葡萄糖基(1 2) B -D-葡萄糖基-20-O- B -D-葡萄糖苷(GPF-10)、3-O- B -D-葡萄糖基(1 2) B -D-葡萄糖基卜2 a ,3 B ,12 B ,20,24(R)-四羟基-达玛-25-烯-20-0- B -D-木糖基(1 6)- B -D-葡萄糖苷(GPF-11)、2a ,3 B ,12 B ,20-四羟基达玛-25- 烯-24-酮-3-O- B -D-葡萄糖基(1 2) B -D-

6、葡萄糖基-20-O- B -D-木糖基(1 6)- B -D-葡萄糖苷(GPF-12)、绞股蓝皂苷GD5(GPF-13)绞股蓝皂苷LW (14)、 绞股蓝皂苷XLW (15)、绞股蓝皂苷L(16)、绞股蓝皂甘LI(17)、绞股蓝皂苷 damulin B(18) 、绞股蓝皂苷 damulin A(19) 。其中,未见文献报道的新化合物 6 个，分别命名为化合物 GPF-6(绞股蓝皂苷J4)、GPF-7(绞股蓝皂苷J1)、GPF-9(绞 股蓝皂苷J5)、GPF-10(绞股蓝皂苷J2)、GPF-11(绞股蓝皂苷J6)、GPF-12(绞股 蓝皂苷 J3) 。2.绞股蓝皂苷LXXV (GPF-1)、绞股

7、蓝皂苷L(GPF-16)、绞股蓝皂苷 LI(GPF-17) 、绞股蓝皂苷 damulin B(GPF-18) 、绞股蓝皂苷 damulin A(GPF-19)对A549细胞的抑制作用较强,且具有浓度依赖性,其IC50值分别为:53.6 2.6卩 M 30.6 1.4 卩 M 22.7 1.3 卩 M 21.9 1.3 卩 M 22.5 0.9 卩 M,而其它绞 股蓝皂苷的IC50均大于80卩M,表现出很弱的A549细胞抑制活性。3.Damulin B 对NSCLC细胞的抑制作用细胞毒性:damulin B对两种非小细胞肺癌细胞的抑制 率比对人正常胚肺成纤维细胞 MRC-5的抑制率高7.5-30

8、.7%。Damulin B对NSCLC田胞抑制作用较阳性对照紫杉醇具有更明显的浓度依赖 性。经damulin B处理后,A549细胞和H1299细胞数目明显减少,细胞变圆皱缩, 空泡化现象明显，漂浮细胞明显增多，而正常MRC-5细胞处理组与实验组无明显 的形态变化。细胞凋亡：经damulin B处理后,TUNEL检测发现NSCL(细胞实验组较空白对 照组发出明显的绿色荧光 ,Annexin V/PI 双染法检测发现实验组较空白对照组发 出明显的绿色或橙红色荧光。经damulin B处理后A549细胞凋亡率由(5.2 2.3)% 上升至(42.4 3.3)%,H1299细胞凋亡率由(7.8 0.

9、5)%上升至(22.5 4.1)%,且 呈浓度依赖性。JC-1荧光探针检测发现，经damulin B处理后,NSCLCffl胞处理组较空白对照 组产生明显的绿色荧光 ,A549 细胞红绿荧光之比由 3.40.7 降为 0.4 0.1,H1299细胞红绿荧光之比由 2.0 0.5降为0.3 0.2。经DCFH-DA检测发 现,NSCLC胞处理组较空白对照组产生明显的绿色荧光，A549细胞的平均荧光 强度由 14.3 0.1 增加到 143.3 3.6,H1299 细胞的平均荧光强度由 9.1 0.2 增加到 76.47.6, 具有浓度依赖性。经damulin B处理后，两种细胞内procaspa

10、se-8、procaspase-9、抑凋亡蛋 白Bcl-2的表达均下调,cleaved caspase-8、促凋亡蛋白Bax、胞浆中促凋亡蛋 白Bid、Bid和细胞色素C表达均上调。细胞周期：与空白对照组相比，damulin B 能明显抑制克隆的形成，A549细胞克隆率由(63.5 2.1)%降为(4.0 1.4)%,H1299 细胞克隆率由 (66.0 2.8)%降为(4.8 1.4)%, 且呈浓度依赖关系 , 当damulin B浓度为24卩M时，两种细胞的克隆形成率均<5%。经damulin B处理后,A549细胞的G0/G1期细胞比例由(54.3 2.1)%上升至 (72.9 0

11、.7)%,S 期细胞由 (27.9 2.5)%降为(19.02 0.7)%,G2/M 期细胞由 (17.9 0.4)%降为(8.1 0.1)%;H1299 细胞的 G0/G1 期细胞由(66.8 2.8)%上 升至(82.4 1.2)%,S 期细胞由 (21.5 0.3)%降为(7.5 1.1)%,G2/M 期细胞由 (16.7 4.0)%降为(9.8 0.3)%DamulinB能明显上调p53的表达,明显下调CDK4 CDK6和Cyclin D1的表达；而对CDK2和Cyclin E1的表达无明显影响,甚至出现 上调趋势。细胞迁移:Damulin B浓度为20卩M和 24卩M时,A549细胞

12、的迁移抑制率分别 为(42.5 1.8)%和(62.1 3.7)%,H1299 细胞的迁移抑制率分别为 (40.7 2.5)% 和(59.4 1.6)%,具有浓度依赖性。Damulin B能明显上调A549细胞和H1299细 胞IL24蛋白的表达,明显下调MMP和MMP蛋白的表达。4.Gyp L和Gyp LI对NSCLC田胞抑制作用的异同点细胞毒性:CCK-8法探究 发现,Gyp LI(C-20为R构型)的抑制作用强于GypL(C-20为S构型)。Gyp L和 Gyp LI 处理组, 贴壁细胞数量明显减少 , 漂浮细胞明显增多 , 出现空泡化现象 ,Gyp L处理组细胞较空白对照组,细胞皱缩细

13、瘦,Gyp LI处理组细胞较空白对照组,细 胞皱缩变圆。细胞凋亡:TUNEL检测发现,Gyp L和Gyp LI处理组细胞较空白对照组,发出明显的绿色荧光；Ann ex in V/PI双染后,A549细胞经Gyp L和Gyp LI处理后,低 浓度组绿色荧光较明显 , 中、高浓度发出较明显的橙色或红色荧光。经低、中、 高浓度处理后 ,Gyp L 组凋亡率由(7.26 0.2)%上升至(72.31 1.5)%,Gyp LI 组 凋亡率由(7.260.18)%上升至(87.4 1.2)%,两种皂苷均能显著增加胞浆中细 胞色素C的释放，降低procaspase8的浓度。细胞周期：Gyp L和Gyp LI

14、均能明显抑制克隆的形成，Gyp L低、中、高浓度 组的克隆形成率分别为 (59.3 10.4)%,(39.8 8.2)%,(4.4 0.5)%;Gyp LI 低、 中、高浓度组的克隆形成率分别为 (57.5 10.6)%,(43.7 1.9)%,(2.5 3.5)%, 克隆形成率随浓度的增加而降低 , 高浓度组细胞克隆率均低于 5%。 Gyp L 能增加 G0/G1期细胞量,低、中、高浓度组G0/G1期分别为(70.9 0.4)%、(77.7 0.6)%、 (83.8 0.6)%,而空白组G0/G1期细胞为(66.0 0.8)%;而S期细胞经Gyp L 处理后,由(25.2 1.6)%降为(1

15、0.8 0.5)%,G2/M期细胞经Gyp L处理后,由(8.7 2.2)%降为(5.4 0.1)%,表明Gyp L能明显阻滞A549细胞于G0/G1期，并呈现 浓度依赖性。GypLI能增加G2/M期细胞量，低、中、高浓度组G2/M期分别为(24.7 1.0)%、 (27.3 0.4)% (29.8 6.2)%,而空白组 G2/M期细胞为(9.6 3.5)%;而 G0/G1 期 细胞经 Gyp LI 处理后, 由(65.4 1.6)%降为(54.3 1.6)%,S 期细胞由 (24.9 2.1)%降为(15.9 4.6)%,表明GypLI能明显阻滞A549细胞于G2/M期,并呈现浓 度依赖性。

16、Western Blotting 检测发现:Gyp L能明显下调CDK却CDK4的表达， 对CDK1蛋白表达影响不明显；而Gyp LI能明显下调CDK1白的表达，而对CDK2 和CDK4蛋白的表达不具有抑制作用。细胞迁移:Transwell小室实验中,Gyp L组低、中、高浓度的迁移抑制率分别为(40.3 7.6)%、(51.5 7.1)%、(65.2 0.1)%,Gyp LI 组低、中、高浓度的 迁移抑制率分别为 (29.5 3.4)%、(42.6 1.3)%、(64.9 0.4)%, 具有浓度依赖 性。Gyp L和Gyp LI均能下调MMP和MMP的表达,并呈现出浓度依赖性。5.新皂苷成分

17、在浓度为100卩M时对人的5种肿瘤细胞(肺癌A549和H1299 细胞、肝癌HepG2细胞、胃癌SGC790细胞、前列腺癌PC-3和骨髓神经母细胞 瘤SH-SY5Y细胞)的抑制率均低于15%与H202诱导的SH-SY5Y细胞氧化模型组 相比, 新皂苷处理组存活率高 2-15%,且具有一定的浓度依赖性。结论本课题从国虾薄原药材中共分离获得 19 种皂苷单体成分 , 其中,6 种为 新皂苷成分 , 一定程度地丰富了绞股蓝皂苷的化学结构。对绞股蓝皂苷的 A549 细胞抑制作用归纳出4条SAR规律,为临床科学、合理、高效用药提供依据。对代表性皂苷进行抗NSCL(活性探究发现，damulin B对NSCLC田胞增殖具 有一定的选择性抑制作用 ,能通过